全 文 ：RRLCMS/ MS法测定三黄片中小檗碱、黄芩苷和大黄素
解军波1, 2 ,张彦青1, 2 ,戚务勤1, 2
( 1 天津市食品生物技术重点实验室, 天津 300134; 天津商业大学 制药工程系, 天津 300134)
摘 要: 目的 建立 RRLCMS/ MS 法检测三黄片中小檗碱、黄芩苷与大黄素。方法 应用超声提取和 Agilent
G6410B T riple Quad LC/ M S 检测。Ag ilent Eclipse P lus C18色谱柱( 100 mm 2 1 mm, 3 5 m) , 柱温为 25 ! , 流
动相为( 0 1% 醋酸溶液)甲醇( 80∀20) ;体积流量 0 2 mL / min, 进样量为 20 L。以液相色谱分离、电喷雾离子化
串联质谱进行检测。结果 在 12 5~ 200 ng/ mL 时小檗碱、黄芩苷与大黄素线性关系良好,三黄片中小檗碱、黄芩
苷与大黄素平均加样回收率分别为 99 53%、100 24%、102 00%。结论 该方法快速简便、精密度好、灵敏度高,
可用于三黄片中小檗碱、黄芩苷与大黄素的测定。
关键词:三黄片; 小檗碱;黄芩苷; 大黄素; RRLCMS/ MS
中图分类号: R286 02 文献标识码: B 文章编号: 02532670( 2010) 05073903
三黄片是由大黄、黄芩、盐酸小檗碱组成的复方
制剂,具有清热泻火、消炎利便之功效, 用于三焦热
盛、目赤肿痛、口鼻生疮、咽喉肿痛、牙龈出血、心烦
口渴、尿黄便秘、急性胃肠炎、痢疾等。#中国药典∃
2005 年版中该制剂仅有大黄有效成分的测定 [ 1]。
为有效控制产品质量,保证临床用药的安全、有效,
采用 HPLC 法对三黄片中有效成分进行了测
定[ 2~ 6]。高分离度快速液相色谱( RRLC)是近几年
来推出的一种新的液相色谱技术, 其峰容量、分析效
率、灵敏度和分辨率较常规 HPLC 有了很大的提
高,为复杂中药体系的多指标成分分析提供了良好
的技术手段[ 7]。目前, 已经逐渐应用于中药及其制
剂分析的研究 [ 8, 9]。本研究建立了 RRLCMS/ MS
法同时测定三黄片中盐酸小檗碱、大黄素、黄芩苷 3
种有效成分,结果显示建立的方法快速简便、精密度
好、灵敏度高。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series高效液相色谱仪、G1322A
在线脱气机、G1312B 二元泵、G1316B 柱温箱、
G1315C DAD 紫外检测器、G1367D 自动进样器、
G6410B T riple Q uad LC/ MS; M asshunter 色谱工
作站( Agilent, 美国) ; BP211D型十万分之一电子天
平( Sato rius,德国) ; ZH % 2型涡流混合器(天津大
学无线电厂) ; AS10200A 型超声波清洗器(昆山超
声仪器有限公司)。
三黄片由市场购得; 盐酸小檗碱 (批号 0713
9906)、大黄素(批号 07569707)、黄芩苷(批号 715
200010)对照品均购自中国药品生物制品检定所;色
谱纯甲醇与超纯水均购自 J TBaker 公司。
2 方法与结果
2 1 分析条件
2 1 1 色谱条件: A gilent Eclipse Plus C18色谱柱
( 100 mm 2 1 mm, 3 5 m) ,柱温为 25 ! ,流动相
为 0 1% 醋酸溶液甲醇 ( 80 ∀ 20) ; 体积流量 0 2
mL/ min, 进样量为 20 L。
2 1 2 质谱条件: 离子源: 电喷雾 ESI 源, 检测方
式:多反应检测( MRM ) ,电喷雾电压: 4 000 V, 雾化
气体: N 2 ,雾化气压力: 2 4 105 Pa; 干燥气体: N 2 ,
干燥气体积流量: 8 L / m in; 离子源温度: 350 ! , 碰
撞气体: 高纯氮气, 碰撞气压力: 0 15 MPa。小檗
碱、黄芩苷和大黄素质谱分析的条件参数见表 1。
按前述色谱和质谱条件对三黄片样品中各成分
进行测定,记录色谱图。三黄片样品总离子流图及
三种目标化合物的提取离子流图见图 1。可知三黄
表 1 小檗碱、黄芩苷和大黄素质谱分析的条件参数
Table 1 MS Analysis on parameters of berberine hydrochloride, baicalin, and emodin
时间段/ min 化合物 E SI( + / - ) M RM 反应 碎裂电压/ V 碰撞能量/ eV Dw ell / ms
0. 0~ 4 5 小檗碱 E SI( + ) 336 2& 320 2 160 30 100
黄芩苷 E SI( + ) 447 1& 271 0 160 10 100
4 5~ 6 8 大黄素 E SI( - ) 269 0& 225 1 160 30 200
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收稿日期: 20091230 作者简介:解军波( 1975 % ) ,男,山东省潍坊市人,中药学博士,研究方向为中药资源开发与质量评价。Em ail: junboxie@ yah oo. com . cn
片中各组分峰型良好, 方法具有较好的分离度和灵
敏度。可以进行定量分析。
1黄芩苷 2小檗碱 3大黄素
1b aicalin 2berberine 3em odin
图 1 对照品( A)和三黄片( B)的 RRLCMS/MS色谱图
Fig 1 RRLCMS/MS Chromatograms of reference
substances (A) and Sanhuang Tablet (B)
2 2 对照品溶液的配制: 分别精密称量盐酸小檗
碱、黄芩苷、大黄素对照品 10 mg, 置 100 mL 量瓶
中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀后即得质量浓度
均为 100 g / mL 的对照品溶液。
2 3 供试品溶液的制备:取本品20片,除去包衣,精
密称定,研细,精密称取 0 1 g,置 100 mL 量瓶中,加
流动相适量,超声处理 30 min,用流动相稀释至刻度,
摇匀,针芯式微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。
2 4 标准曲线的制备:分别精密量取各对照品溶液
适量置10 mL 量瓶中,配成含各对照品 1 g / mL 的
混合对照品溶液。精密量取上述混合对照品溶液
2、1、0 5、0 25、0 125 mL 置于 10 mL 量瓶中, 加流
动相稀释至刻度, 摇匀, 按前述色谱和质谱条件测
定。以进样质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标, 进
行线性回归, 得标准曲线方程。3种组分在 12 5~
200 ng/ mL 线性关系良好,标准曲线方程分别为盐
酸小檗碱: Y= 8 907 1 X+ 9 157 7, r= 0 999 8;黄
芩苷: Y= 354 06 X - 286 21, r= 0 999 7; 大黄素:
Y= 424 84 X+ 258 63, r= 0 999 8。
2 5 精密度试验:制备 D15028批次三黄片供试品
溶液,精密吸取该供试品溶液 100 倍稀释液 20 L
进样,连续进样 5次,测定峰面积, 计算得盐酸小檗
碱、黄芩苷、大黄素提取离子流色谱峰峰面积的
RSD分别为 0 96%、1 45%、2 72%。
2 6 稳定性试验:制备 D15028批次三黄片供试品溶
液,精密吸取该供试品溶液 100 倍稀释液 20 L 进
样,分别于0、2、4、6、8 h进行分析,测定色谱峰面积,
计算得盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素提取离子流色谱
峰峰面积的 RSD分别为 156%、271%、293%。
2 7 重现性试验: D15028批三黄片 5份,制备供试
品溶液,依法测定,结果盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素
质量分数的 RSD分别为 1 82%、2 37%、2 85%。
2 8 加样回收率试验: 精密称取 D15028批三黄片
0 1 g, 按检出量精密加入质量浓度为 100 g/ mL
的盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素对照品溶液各 19 5、
13 4、1 4 mL,制备供试品溶液共 5份, 依法测定,
结果盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素的平均加样回收率
分别为 99 53%、100 24%、102 00%。
2 9 样品测定:取生产厂家河北世济唐威药业有限
公司批号为 D150283, 规格为 025g/片;药都制药集
团股份有限公司批号为 D80402,规格为 0 25g/片;天
津隆顺榕发展制药有限公司批号为 0610002, 规格
为 0 20g /片, 共 3批三黄片, 每批重复测定 3次,按
标准曲线方程计算盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素的
质量分数,结果见表 2。
表 2 三黄片中盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素的测定结果
(n= 3)
Table 2 Determination of berberine hydrochloride, baicalin,
and emodin in Sanhuang Tablet ( n= 3)
批号 盐酸小檗碱
m g/片 mg/ g
黄芩苷
mg/片 mg/ g
大黄素
mg/片 mg/ g
D15028 4 87 19 48 3 34 13 36 0 34 1 36
D80402 3 02 12 08 3 57 14 28 0 42 1 68
0610002 3 19 15 95 9 33 46 65 0 38 1 90
3 讨论
液相色谱串联质谱法( LC/ M S/ M S)因其高灵
敏度、高选择性, 多组分同时测定不需完全分离, 在
复方制剂药动学研究中具有其他传统方法不可比拟
的优势。三黄片是由大黄、黄芩、盐酸小檗碱组成
∋740∋ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
的复方制剂, 本实验采用 RRLCMS/ MS 法建立了
同时检测三黄片中盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素的
测定方法。研究结果发现以甲醇水( 0 1%醋酸)
80∀20作为流动相,体积流量 0 2 mL/ m in,得到较
好的分离度,且保留时间适当。方法学考察发现本
方法可以很好地测定三黄片中小檗碱、黄芩苷与大
黄素质量分数, 不仅为三黄片的质量控制提供了一
定参考和依据, 同时为下一步研究大鼠口服三黄片
后体内指标成分的药动学特征奠定了基础。
参考文献:
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t ography cou pled with t imeoff light tandem mass spect rome
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氧化铝柱纯化吴茱萸提取液中总生物碱和柠檬苦素的研究
许海玉1 ,刘 莹1 , 张铁军2 * ,刘昌孝3 ,朱雪瑜2 , 许 浚2
( 1 天津中医药大学,天津 300193; 2 天津药物研究院,天津 300193; 3 天津药物研究院
天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室, 天津 300193)
摘 要:目的 研究中性氧化铝柱纯化吴茱萸总生物碱和柠檬苦素的工艺。方法 以转移率和质量分数为评价指
标,对水沉工艺的 pH 值 ,氧化铝柱色谱的上样量、洗脱剂的种类、洗脱剂体积和洗脱体积流量进行考察。结果 水
沉工艺的 pH 值为 3, 氧化铝柱色谱的上样量 20 g ,洗脱剂为醋酸乙酯二氯甲烷 ( 70∀ 30) , 洗脱剂用量为 5 BV 和
洗脱速度为 2 BV/ h。结论 氧化铝柱色谱对吴茱萸活性成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素的纯化方法可行,
经济简便,效率较高。
关键词:吴茱萸; 总生物碱;柠檬苦素; 纯化;氧化铝柱色谱
中图分类号: R284. 2; R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05074104
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Evodia r utaecar
p a ( Juss ) Benth、石虎 E r utaecarp a ( Juss )
Benth var of f ieinal is ( Dode ) H uang、疏毛吴茱
萸 E r utaecar pa ( Juss ) Benth var bodinier i
( Dode) Huang 干燥的近成熟果实, 广泛分布在贵
州、江西、湖南、广东、广西等省。吴茱萸始载于
#神农本草经∃, 列为中品,性辛,苦热,有小毒,归肝、
脾、胃、肾经,具有温中止呕,散寒止痛, 助阳止泻的
功效且用于治疗疼痛症、胃寒呕吐、呃逆症、虚寒泄
泻等症 [ 1]。在传统经方左金丸、反左金丸、吴茱萸汤
等中应用广泛。吴茱萸含有多种化学成分, 目前从
中分离的主要有生物碱、柠檬苦素、挥发油、多糖 [ 2]
等化学成分。吴茱萸碱和吴茱萸次碱是吴茱萸中量
较高的成分。临床实验表明, 吴茱萸生物碱包括吴
茱萸碱和吴茱萸次碱的量与其疗效有正相关关
系[ 3 ]。柠檬苦素具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛以及
抗肿瘤等活性[ 4] , 在吴茱萸中的量较高[ 5]。因此本
实验先用水沉工艺, 然后采用中性氧化铝柱色谱对
吴茱萸中生物碱和柠檬苦素进行纯化, 并优化其
工艺。
1 仪器与试剂
Lab Alliance高效液相色谱仪( SPD10AV 紫
外检测器, LabAlliance HPLC 色谱工作室) , Anke
LXJ % IIB离心机(上海安亭科学仪器厂)。
∋741∋中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091120 基金项目: ( 十一五)国家科技支撑计划资助项目( 2006BAI06A01; 2007BAI41B06)作者简介:许海玉,男,湖南永兴人,在读博士,主要研究方向为中药制剂和中药药代动力学。
* 通讯作者 张铁军 T el: ( 022) 23006848