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Study thought of material basis of secondary development of major traditional Chinese medicine varieties on basis of combination of in vivo and in vitro experiments

基于体内外相结合的中药大品种二次开发物质基础研究思路



全 文 :·学术探讨·
基于体内外相结合的中药大品种
二次开发物质基础研究思路
成旭东1,2,3,贾晓斌1,封亮1,蒋俊1,2
(1江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药释药系统重点研究室,江苏 南京 210028;
2南京中医药大学,江苏 南京 210028;3苏州海金沙生物科技有限公司,江苏 苏州 215123)
  [摘要] 中药大品种二次开发是中药现代化、科学化、标准化进程的重要环节之一。如何准确有效地识别原方有效物
质基础是二次开发中最首要的难题,同时也是中药现代化发展的瓶颈。该文在目前已有的试验方法的基础上,根据中药复方
多成分、复杂作用需要综合多学科的方法与技术协同研究的思路,提出基于体内外相结合的中药大品种二次开发物质基础研
究思路,认为物质基础研究需要分为识别、筛选、验证3个环节,每个环节设计相应的体内、外的研究方法相互补充、相互验证,
最终筛选正确可靠的复方物质基础。该思路为中药大品种二次开发以及复方物质基础研究提供参考。
[关键词] 中药大品种;二次开发;物质基础;体内、外结合;研究思路
[收稿日期] 20130514
[基金项目] 苏州市 2012年科技计划医疗器械与新医药专项
(ZXY2012009);江苏省2013年度普通高校研究生科研创新计划(CX
LX13599)
[通信作者] 贾晓斌,博士生导师,Tel:(025)85637809,Email:jxi
aobin2005@hotmail.com
[作者简介]  成旭东,博士研究生,Tel:13814856292,Email:
chengxd2013@gmail.com
  中药大品种具有很好的临床疗效和患者认可度,在现代
中医药临床中发挥了重要作用。对中药大品种进行二次开
发是中药现代化、科学化、标准化进程的重要环节之一。如
何准确有效地识别原方中有效物质基础并进行有效的质量
控制是中药工作者所面临的最主要的难题,同时也是决定中
药大品种二次开发成败的决定性因素。本文以中药体内外
成分、效应有机结合为指导思想,提出基于体内外相结合的
中药大品种二次开发物质基础研究思路,为中药大品种二次
开发以及复方物质基础研究和复方开发提供部分参考。
1 中药复方物质基础研究现状
中药复方具有君臣佐使的组方原则,其组方构成是一个
具有一定层次与结构的有机整体。同时中药复方中每味药
材又是由多类化学成分组成。因此,整体性和复杂性是中药
复方最大的特点,同时也是物质基础研究面临的巨大难题。
目前中药复方物质基础研究方法分为传统化学成分分
离法、拆方研究法、血清药理学/药物化学法、谱效关系结合
法、代谢组学研究法。
11 传统化学成分分离法
传统化学成分分离法是研究中药复方物质基础最早、最
经典的方法。中药经过植物化学成分分离、纯化、结构鉴定,
得到的单一化合物,辅以药理活性筛选加以确定;或者利用
已有药理模型对植物化学分离中的每个部位进行活性追踪,
对最终得到的化合物进行结构鉴定。袁胜浩等[1]利用硅胶、
MCI和Rp8等柱色谱方法对秋海棠科植物大半边莲的甲醇
提取部位进行分离纯化,并根据理化性质和光谱数据(MS,
UV,IR,1HNMR,13CNMR)鉴定结构。采用比浊法测定单体
化合物的最小抑菌浓度(MIC)。结果从大半边莲中分离得
到6个酚酸类化合物,分别鉴定为水杨酸、间羟基苯甲酸、阿
魏酸、绿原酸、没食子酸和原儿茶酸。其中,水杨酸和原儿茶
酸的抑菌谱最广,阿魏酸次之,间羟基苯甲酸最小;原儿茶酸
的抑菌活性最强,间羟基苯甲酸最弱。
化学成分分离法成功研究了抗疟新药青蒿素,抗癌新药
紫杉醇、长春新碱,治疗老年痴呆病的石杉碱甲等驰名海内
外的产品。此方法可得到的结构明确、作用机制清晰的单一
活性化合物。但是,此方法工作量大,成功率低,同时脱离了
中医药范畴属于纯粹的天然药物化学方法。
12 拆方研究法
拆方研究可说明中药复方的配伍组方原理及作用机制,
为研制中药大品种二次开发提供可靠的依据,是目前中药复
方研究中最为常用的一种方法[2]。李越峰等[3]研究四逆散
拆方煎煮化学成分后发现,在配伍煎煮的过程中产生了新的
成分,且成分溶出量研究表明各成分间存在明显的相互增溶
作用。潘岩等[4]研究左金丸及拆方对胃溃疡大鼠胃黏膜愈
合和表皮生长因子受体表达的影响,结果发现,左金丸及其
拆方均有促进溃疡愈合的作用,显著性上调EGFR的表达可
能是左金丸促进溃疡愈合的重要机制之一。
13 血清药理学/药物化学法
血清药理学由日本学者20世纪80年代在对汉方的研
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究体系进行探讨的过程中首次提出,是为了研究中药复方而
诞生的一种新的体外实验方法。中药血清药理学是采集动
物给予中药或中药复方一定时间的血液,分离血清,用含有
药物成分的血清进行体外细胞、亚细胞水平进行超微、生化、
受体、基因等方面研究的一种实验方法。王威等[5]研究疏肝
导浊方药含药血清对肝癌细胞株(HepG2)的过氧化物酶体
增殖物激活受体(PPARα),肝脂酶(HL)及载脂蛋白 Apo
B100,ApoAI,ApoCImRNA表达的影响,结果表明,疏肝导
浊方药含药血清能增加 HepG2细胞 PPARα,HL,ApoB100,
ApoAI,ApoCImRNA的表达,从而促进了肝细胞的脂代谢
功能,这可能是疏肝导浊方药治疗脂肪肝的重要机制之一。
张金艳等[6]利用含药血清研究冠心苏合丸系列组方药物血
清对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响,结果表明,冠心苏合丸
系列组方对缺氧复氧心肌细胞损伤均有明显保护作用,作用
机制相似;原方中青木香被土木香替换或者去掉青木香,不
影响其抗缺氧复氧损伤的作用。
中药血清药理学同时也存在一定的问题:如血清自身组
分的复杂性至今尚未完全清楚,且血清本身固有成分会影响
体外实验的结果,还有实验动物的种属和年龄性别等因素对
实验结果的影响等[7]。
中药血清药物化学是以中药口服给药后的血清为样品,
以药物化学的研究手段和方法为基础,多种现代技术综合运
用,从血清中分离鉴定移行成分,研究血清中移行成分与传
统疗效的相关性,阐明体内直接作用物质代谢及体内动态的
领域[8]。吴芳芳等[9]利用 UPLCHDMS技术建立生脉散以
及大鼠口服生脉散后含药血清样品的分析方法,通过对比空
白血清、含药血清的成分异同,确定大鼠口服生脉散后的血
中移行成分,并利用质谱数据表征血中移行成分的结构,结
果大鼠口服生脉散后在血中分析鉴定了18个血中移行成
分,其中5个为新产生的代谢产物,13个成分为生脉散的原
型成分,血中移行成分及代谢产物可能为生脉散的体内直接
作用物质,对其进行深入的研究将有助于阐明生脉散的有效
成分及作用机制。
14 谱效关系结合法
中药复方指纹图谱是现代中药质量控制的重要手段之
一。中药指纹图谱的整体性和模糊性符合中药质量控制的
要求,较之单一化学成分的质量控制方法,更具有整体性和
科学性。谱效关系是建立在指纹图谱的研究之上,将标示活
性成分群特征峰的中药指纹图谱与药效结果对应起来,将中
药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效结果联系起来,建
立中药谱效关系,表征中药及中药复方整体成分配伍药效
相关性的有效途径,也为利用指纹图谱优化处方、改进制剂
工艺、追踪分离目标活性成分、开发中药新药提出了新的思
路和方法[10]。李鹏等[11]利用 GCMS建立桃红四物汤低极
性部位指纹图谱,结合小鼠痛经模型,研究桃红四物汤抑制
小鼠痛经有效部位的谱效关系,结果表明亚油酸在延长扭体
潜伏期和减少扭体次数方面起主要作用,十八碳烯酸、花生
酸、二十七烷对镇痛效果有一定的协同作用。
15 代谢组学研究法
代谢组学是以生物样本为研究对象,以组群指标分析为
基础,以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统
整合为目标的系统生物学的一个分支,是继基因组学、转录
组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域。它主
要是应用现代分析仪器与分析手段,定性定量研究生物样本
包括生物体液(如血液、尿等)、细胞提取物、细胞培养液和组
织等中的内源性代谢产物即代谢组。结合模式识别等化学
信息学技术,分析生物体在不同状态下的代谢指纹图谱的差
异,获得相应的生物标志物群,从而揭示生物体在特定时间、
环境下的整体功能状态[12]。于晓红等[13]研究养心汤对不稳
定型心绞痛(UA)患者血浆代谢组学的影响,结果表明神经
酰胺、甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸、白三烯 B4可能是 UA代谢
组学标志物,养心汤对UA患者血浆中的某些代谢产物或代
谢通路可能有影响。邹忠杰等[14]运用代谢组学方法研究角
叉菜胶致大鼠足肿胀后的变化及双黄连口服液发挥抗炎作
用的相关代谢途径,结果表明双黄连口服液可以使角叉菜胶
致大鼠足肿胀后发生紊乱的机体代谢回归到正常水平。
代谢组学属于新兴发展的学科,对仪器设备要求比较
高,目前该方法还尚未在中药物质基础研究中普及。
上述中药复方的物质基础研究方法可以看出,随着时代
进步与科学技术发展,中药复方物质基础研究的方法和手段
也在不断发展与创新。上述各种研究方法在揭示中药复方
内涵过程中起着并将继续起着重要的作用。中药复方是一
个复杂的巨系统,必需耦合多学科知识与研究方法才能揭示
中药复方的科学内涵。
2 基于体内外相结合的物质基础研究思路
由于成分结构复杂多样性与体内外多环节性决定了中
药大品种乃至中药(复方)物质基础研究过程中必需综合多
学科技术与理论。本文在此思想基础上提出了“基于体内外
相结合的中药复方物质基础研究思路”,建立了“以体内、体
外研究相结合为前提,以成分转移与转变为基础,以作用位
点及效能为手段,以明确整方物质基础为目的”的现代中药
复方物质基础研究新模式。即通过现代分析技术结合体内
外吸收代谢研究阐明中药复方的化学成分组成结构及生物
内环境对化学成分的影响;采用体内组织分布、生物色谱、酶
与受体模型研究揭示中药复方中与靶部位结合的化学成分
类别;采用在体与离体模型研究筛选的物质基础与原方对比
验证物质基础筛选的正确性。此研究思路可以和代谢组学
研究相互结合,分别从成分角度和生物体内环境的角度对中
药复方物质基础进行揭示,见图1。
21 中药大品种体内外吸收代谢研究
中药复方体内外吸收代谢研究主要是通过 UPLCQ
TOFMS、快速全成分免疫芯片等现代分析技术结合体内外
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图1 基于体内外相结合的中药复方物质基础研究思路
Fig1 ThematerialbasisresearchthoughtofChinesemedicine
basedontheconjunctionofinvivoandinvitrotestresult
吸收代谢模型如Caco2细胞模型、肝肠微粒体模型、肠道菌
代谢模型、在体肠灌注模型和给药后体内全成分分析等,研
究中药复方的化学成分组成及生物内环境因素对化学成分
的影响。
211 Caco2细胞模型 Caco2细胞模型是一种人克隆结
肠腺癌细胞,结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞,具有
微绒毛等结构。同时,存在于正常小肠上皮中的各种转运系
统、代谢酶等在Caco2细胞中大都也有相同的表达,如细胞
色素P450同工酶、谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、葡
萄糖醛酸酶及糖、氨基酸、二肽、维生素 B12等多种主动转运
系统在Caco2细胞中都有与小肠上皮细胞类似的表达。Ca
co2细胞模型是最近十几年来国外广泛采用的一种研究药
物小肠吸收的体外模型,具有相对简单、重复性较好、应用范
围较广的特点。
周惠芬等[15]研究养阴通脑颗粒主要有效部位在 Caco2
细胞模型的吸收特性和转运机制,结果养阴通脑颗粒中黄芪
甲苷、川芎嗪和葛根素吸收均较差,且葛根素 >川芎嗪 >黄
芪甲苷,黄酮、皂苷和生物碱的相互配伍对黄芪甲苷的外排
作用明显,对川芎嗪和葛根素的吸收转运影响不明显。黄芪
甲苷、川芎嗪和葛根素在其转运途径中可能受到了小肠顶侧
膜的转运蛋白的外排作用。吴青青等[16]考察羊藿三七提取
物中主成分淫羊藿苷的肠吸收情况,结果表明淫羊藿苷的吸
收较差,但羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中的某些成分能
抑制外排泵对淫羊藿苷的外排作用,从而有利于淫羊藿苷的
吸收。韩天娇等[17]利用Caco2细胞单层模型考察附子中乌
头类生物碱提取物的跨膜转运,结果表明加入配伍药材后附
子中11种二萜类生物碱的Papp发生了明显的变化。干姜、甘
草和半夏水提物的加入能够明显地降低二萜类生物碱在小
肠中的生物利用度,尤其抑制其中毒性较大的双酯型生物碱
的生物利用度;而浙贝母的水提物却在促进吸收和抑制外排
2个方面共同作用,使二萜类生物碱的生物利用度明显增加。
212 肝、肠微粒体模型 肝肠微粒体通过自身所表达的
药物代谢酶氧化和还原代谢多种药物、前毒物、前致癌物等
外源性物质,由此影响药物的代谢和生物利用度,对口服药
物的毒性和疗效以及药物与药物、药物与食物的相互作用有
潜在的影响。因此肝肠微粒体可用于体外药物代谢、对药酶
的抑制及体外代谢清除等方面的研究。
肝肠微粒体体外温孵实验是采用差速离心法从肝脏、小
肠组织中提取的微粒体,并加入还原型辅酶 I(NADPH)再
生系统,在体外模拟生理环境下进行代谢反应,采用高效液
相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用(HPLCMS)等测定
方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验
方法。
Zhang等[18]利用体外大鼠肝微粒体与钩吻素子进行体
外共孵育,得到了4个代谢物,通过 MS,1D/2DNMR等分析
方法进行结构确认,揭示了钩吻素子体内代谢路径。Tian
等[19]以士的宁和马钱子碱为指标研究马钱子总生物碱在大
鼠肝微粒体作用下的代谢,结果鉴定31个代谢产物,其中26
个代谢物为首次报道。马钱子总生物碱的生物转化包括羟
基化、N氧化、环氧化、甲基化、脱氢、脱甲氧基化、O去甲基
化,以及水解反应。Song等[20]利用人及大鼠肝微粒体及肠
道菌研究卵叶远志中成分卵叶远志口山酮 F及其苷元的代
谢,结果表明在人及大鼠肝微粒体中主要发生Ⅱ相代谢,而
在肠道菌中卵叶远志口山酮 F发生Ⅰ代谢产生5个代谢产
物,而苷元几乎没有代谢产物产生。Ma等[21]研究了吴茱萸
对黄连药动学的影响,在体外利用大鼠肝微粒体研究
UGT1A1表达,结果表明通过预处理吴茱萸减少了黄连生物
碱的全身分布,主要是由于吴茱萸增加了黄连生物碱的吸收
和Ⅰ相代谢,同时诱导了肝脏UGT1A1的表达。
肝肠微粒体体外温孵法较其他的体外代谢方法以其酶
制各技术简单,代谢过程快,结果重复性好,易大量操作,便
于积累代谢样品供结构研究,实际工作中应用较为普及。
213 肠道菌群模型 传统上中草药的使用,绝大多数以
方剂的形式通过口服吸收而发挥作用,药物中的有效成分在
进入肠道之后不可避免地与肠道菌群发生关联,某些成分经
相应细菌的作用发生代谢转化后被吸收,较少部分的成分则
以原型药物直接被吸收,在肝脏解毒后经胆汁排泄,与肠道
菌群接触发生结合、裂解等代谢转化再次被吸收。体内环境
中肠道菌群是完成中药有效成分代谢的重要因素之一。
将含有细菌的人、小鼠或其他动物的新鲜粪便或消化道
内容物与药物混匀,37℃厌氧培养,应用 LCMS,GCMS等
现代分析技术检测药物原型及其代谢产物的种类和量[22]。
Wang等[23]研究葡萄籽中的酚类化合物的吸收和转运,发现
肠道菌作用下的酚类化合物产生了2个代谢产物能通过Ca
co2单细胞层,而胃液和胰腺消化液都不能。Kim等[24]研究
人参皂苷等多种天然活性成分在肠道菌代谢物的活性,结果
显示经过代谢的成分比原成分显示更强的活性,揭示肠道菌
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群可以激活中药中的药理活性,是中药成分向活性成分转化
的生物催化转化器。Wan等[25]研究人肠道菌群对西洋参的
代谢作用,结果表明共25个代谢产物被检测出来,其中13
个成分可以用对照品进行对照,并确定了另外的12个成分。
4个最丰富的代谢产物是20S人参皂苷,人参皂苷Rg3,F2和
CompoundK。人参皂苷的主要代谢途径是通过逐步裂解糖
基,肠道菌群去糖基化反应伴随的脱水反应。原人参二醇和
齐墩果烷型三萜类化合物很容易代谢。肠道菌群在西洋参
代谢活性中发挥了重要作用。
214 大鼠在体肠灌流模型 在体肠灌流模型不切断血管
及神经,保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损,同时
也保证了血液及淋巴液的供应,提高了生物活性,并且避免
了胃内容物及消化道固有运动的生理影响,能较真实地反映
药物的小肠吸收情况。在体肠灌流模型是一种简便易行的
研究方法,对于阐明药物在体吸收机制和药物动力学都有着
积极的作用。
Zhang等[26]利用在体肠灌流模型研究附子甘草药对对
附子中3种双酯型生物碱吸收代谢的影响,结果表明,3种双
酯型生物碱传输机制可能适合的主动转运机制,在附子甘
草药对中3种双酯型生物碱吸收良好,给药后的吸收与滞后
时间适合2室模型。安轈等[27]采用大鼠在体单向肠灌流模
型研究葛根芩连汤不同配伍组中主要指标成分在大鼠肠道
的在体吸收情况。结果表明,甘草可促进君药葛根中葛根素
和大豆苷的吸收,同时葛根也可促进甘草苷的吸收。葛根和
甘草可促进黄芩苷的吸收,且葛根的作用强于甘草;葛根同
样可促进汉黄芩苷的吸收,但甘草对其则为抑制作用。葛根
与甘草均可促进黄连有效成分药根碱、小檗碱和巴马汀的
吸收。
215 体内原型药物、代谢产物鉴别 中药复方成分数目
庞大,种类繁多,因此其体内成分分析一直是揭示复方物质
基础的瓶颈之一。随着现代分析技术的飞速发展,特别是
LCQTOFMS等高精度分析设备在中药分析中的应用,使得
中药复方吸收入体成分及代谢物分析成为可能。
Wen等[28]利用 RRLCQTOFMS分析大鼠口服补阳还
五汤尿液中原型药物及代谢产物,鉴定了50个化合物,包括
12种原型药物及38种代谢产物,结果表明葡萄糖醛酸化和
硫酸化是异黄酮类成分主要代谢途径;而谷胱甘肽结合、葡
萄糖醛酸化和硫酸化是苯酞成分的主要代谢途径。Li等[29]
利用LCTOFMS研究大鼠口服当归补血汤后血浆与胆汁中
的成分,总共分析得到142个化合物,大鼠胆汁中含有相对
较多的谷胱甘肽结合物,血浆样本分析显示葡萄糖醛酸结合
物异黄酮、乙酰半胱氨酸结合物、苯酞类原型药物以及皂苷
的苷元是主要吸收进入体循环的成分类别。
通过上述多种模型与分析方法的结合可以了解中药复
方以下3个方面信息:中药复方中化学成分类别及相对数
量,中药复方中能够吸收进入生物体的成分,中药复方中经
过生物体酶代谢的影响产生的新成分。这些信息是了解中
药复方物质基础的第1步。
22 中药大品种物质基础的筛选
在识别中药复方成分的基础上,除了网络药理学等中药
复方物质基础及作用靶点机制的研究方法外,可采用体外细
胞膜固相色谱、酶、受体研究结合体内组织分布揭示中药复
方中与靶部位结合的化学成分群。
221 细胞膜固相色谱模型 细胞膜固相色谱法是直接以
活性细胞为分离载体,以中药提取物为研究对象,依据提取
物中的成分与细胞是否具有特异亲和能力而进行分离。采
用色谱技术比较中药提取物与细胞结合前后中药提取物色
谱图的变化,分析细胞破碎液中与活性细胞相结合的成分,
应用LCMS等技术进行鉴定,从复杂的中药体系中筛选出与
活性细胞相互作用的成分。主要流程包括细胞与药物亲和
孵育;未亲和成分洗脱;亲和成分提取;色谱分离、分析、比
较。该方法最大特点是应用活性细胞为固定相,选择性地结
合中药提取物中的活性成分,细胞膜的完整性、膜受体的立
体结构、周围环境和靶点得以保持;操作简便易行[30]。
朱建梁等[31]采用肾小球系膜细胞膜固相色谱法分析丹
皮中的效应成分,结果表明丹皮酚是丹皮与肾系膜细胞结合
的成分。Su等[32]采用细胞膜固相色谱法,以脐静脉内皮细
胞为靶细胞,应用该技术对少腹逐瘀汤的活性组分 SF11进
行了研究,结果显示SF11中芍药苷和香蒲新苷与内皮细胞
具有特异性的相互作用。经药理实验证明这2个成分能明
显抑制内皮素(ET)释放和 NO分泌,并促进前列环素
(PGI2)释放。
222 酶及受体体外筛选模型 酶和受体模型作为现代化
高通量筛选药物的新技术,被广泛运用于药物单个成分的筛
选。较之上述的动物模型,本模型具有快速、经济、高精密度
和专属性强等特点。由于分离介质多是生物源材料(如脂质
体、细胞膜、受体、目标蛋白等),该模式实质上是一种融合化
学分离和体外活性筛选于一体的仿生式中药有效组分分离
模式,具有较好的应用前景。Tao等[33]建立了将多个目标
(麦芽糖酶、蔗糖酶、脂肪酶)固定于磁珠上与中药复方进行
共孵育,富集和识别复方中不同的配体,利用 LCMS加以分
析的基于多目标亲和的磁珠色谱系统,并将其应用于中药
复方糖脂清的筛选中,筛选了复方中5个活性成分并加以
验证。
Dong等[34]建立了基于UPLCQTOFMS结合核因子κB
(NFκB)和β2肾上腺素能受体双活性荧光素酶报告基因检
测系统,对川贝枇杷滴丸进行活性成分筛选,得到β2肾上腺
素受体激动剂麻黄素和 2类 NFκB抑制剂桔梗皂苷和熊
果酸。
223 组织分布研究 研究中药大品种在体内的组织分布
可以了解复方中化学成分的作用部位,靶向作用机制,为中
药复方物质基础研究提供更为直观的依据。Shia等[35]研究
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大鼠灌服大黄汤后大黄中主要活性物质在大鼠体内的组织
分布,结果大鼠器官组织中主要是游离形式蒽醌,如肾、肝、
肺组织中的芦荟大黄素,肝、肺组织中大黄酸、大黄素,肾、肝
组织中痕量大黄酚。脑组织中则既没有游离形式的也没有
葡萄糖醛酸、硫酸化的蒽醌。Hou等[36]研究黄芩中黄酮类成
分在大鼠体内组织分布,结果显示,黄芩素和汉黄芩素及其
葡萄糖醛酸/硫酸结合物出现在肝、肾、肺中,黄芩素肺中主
要以原型形式存在,而在肝、肾中主要以葡萄糖醛酸化/硫酸
化代谢物形式存在,汉黄芩素主要以原型形式存在于肝、肾、
肺中,同时肝、肾中检测到痕量的汉黄芩素葡萄糖醛酸化/硫
酸化代谢物。脑中既没有黄芩素和汉黄芩素,也检测不到葡
萄糖醛酸/硫酸化代谢物。
经过体内外相结合的筛选模型对中药复方成分的研究,
可以发掘一部分具有明确成分组成、作用靶点与机制的化学
成分群,进一步揭示了中药复方物质基础中的效应物质。
23 化学成分群与靶点关联性数据挖掘
经过体内外吸收代谢试验与成分筛选试验获得大量的
中药大品种成分集群和作用靶点结果。这些结果是数目巨
大的、随机的、模糊的、有噪音的数据,如何从中发掘到关键
的化学成分群和作用靶点之间的关系是中药大品种二次开
发物质基础研究的重点,也是难点之一。
数据挖掘是一种新兴的信息处理技术,它汇聚了人工智
能、模式识别、模糊数学、数据库、数理统计等多种技术方法,
专门用于海量数据的处理[37]。借助数据挖掘技术揭示化学
成分群和作用靶点之间的关系得以实现。利用数据挖掘技
术对化学成分集群与靶点集群进行主成分分析、聚类分析及
关联分析等,并对化学成分与靶点进行分类,以及对相互关
系进行揭示。
通过数据挖掘所得到的与靶点具有密切相关性的化合
物可利用定向提取与富集技术进行富集,最终得到组合物能
够代替原复方的物质基础还需要进一步进行体内外药效试
验加以验证。
24 物质基础的验证
任何一种研究中药复方物质基础的研究方法最终都必
须接受药效验证以确证该方法筛选的复方物质基础的正确
性。对于前期筛选出的化学群进行定向富集、制备,与原方
一起进行相互的验证是本思路最后也是最终证明思路正确
与否的关键。在物质基础验药效验证中仍采取体外细胞模
型验证与在体模型动物药效验证2个方面。
241 体外细胞模型 细胞模型作为一种新型的技术用于
中药活性物质筛选,已广泛应用于抗肿瘤活性、抗艾滋病病
毒、多重耐药性、抗病毒药物等一系列药效评选中。
张宁等[38]建立逍遥散经口给药后大鼠血清色谱指纹
图,确定大鼠血中移行成分的生药来源,初步确定逍遥散治
疗黄褐斑的药效物质基础及其作用机制,结果鼠血中发现了
14个入血成分,其中4个为血中原型成分,10个为原型入血
或代谢产物,分别来自于柴胡、当归、白芍、甘草、茯苓,且血
中移行成分能够抑制B16细胞酪氨酸酶活性和黑素合成,是
逍遥散治疗黄褐斑的药效物质基础。
242 药理效应模型 整体动物模型是基于经典的药理实
验进行药物活性筛选,该模式能全面反映药物的有效性和毒
副作用,在药物评价方面起着重要的作用。
李越峰等[39]研究四逆散改善睡眠作用的药效物质基
础,结果显示:①四逆散冻干粉连续给药7d后血清样品中有
14种移行成分,经来源认定研究认为,其中2号成分为昔奈
福林,4号成分为芍药苷,12号成分为柴胡皂苷C,14号成分
为甘草次酸;②四逆散冻干粉、芍药苷、甘草次酸、昔奈福林
和柴胡皂苷C均可以使脑脊液中内源性物质峰面积增加,其
中四逆散冻干粉组是正常脑脊液峰面积的125倍,血清移
行成分配伍组脑脊液中内源性物质峰面积高于四逆散冻干
粉组,是四逆散冻干粉组的32倍;③昔奈福林、芍药苷、柴
胡皂苷C和甘草次酸单用对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间
无明显影响,四逆散冻干粉和血清移行成分配伍均延长小鼠
睡眠时间,且血清移行成分配伍组优于四逆散冻干粉组。结
果表明,芍药苷、甘草次酸、昔奈福林和柴胡皂苷C是四逆散
冻干粉给药后血清主要移行成分,可能是四逆散改善睡眠作
用的物质基础。
经过一系列的筛选鉴定的可以与吸收进入体内并与靶
部位想结合的成分群是否是全方的物质基础只有经过药理
试验的对比才能够真正揭示。因此药理效应验证环节是整
个研究思路的最后也是最重要的一步。
3 结语
中药复方物质基础的揭示是中药大品种二次开发、中药
复方现代化的迫切需求,为此数十年来中医药工作者一直孜
孜以求。多年来中医药工作者在中药物质基础研究领域取
得了不少成就也创建了不少的理论,但对于中药这个庞大的
局系统仍只是冰山一角。面对中药这个复杂体系,必须以多
学科联合为出发点,以现代科技进步为支撑,密切配合、通力
合作才能达到揭示其内涵的目的。本文在前人工作的基础
上综合多个学科的方法试图从体内外成分相互关联为出发
点提出一个解决思路,以希望给中药复方物质基础研究提供
一点参考。当然,任何一个创新方法与思路都需要不断经过
实践来不断地补充和完善,本文的思路也需进一步以科学实
践来证明。
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Studythoughtofmaterialbasisofsecondarydevelopmentofmajor
traditionalChinesemedicinevarietiesonbasisofcombination
ofinvivoandinvitroexperiments
CHENGXudong1,2,3,JIAXiaobin1,FENGLiang1,JIANGJun1,2
(1KeyLaboratoryofNewDrugDeliverySystemofChineseMateriaMedicaunderStateAdministrationof
TraditionalChineseMedicine,JiangsuProvincialAcademyofChineseMedicine,Nanjing210028,China;
2NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210028,China;
3SuzhouALGBioscienceCo,Ltd,Suzhou215123,China)
[Abstract] ThesecondarydevelopmentofmajortraditionalChinesemedicinevarietiesisoneofimportantlinksduringthemod
ernization,scientificationandstandardizationoftraditionalChinesemedicinesHowtoaccuratelyandefectivelyidentifythepharmaco
dynamicmaterialbasisoforiginalformulaebecomestheprimaryprobleminthesecondarydevelopment,aswelasthebotleneckinthe
modernizationdevelopmentoftraditionalChinesemedicinesOnthebasisoftheexistingexperimentalmethods,andaccordingtothe
studythoughtthatthemulticomponentandcomplexefectsoftraditionalChinesemedicinecomponentsneedtocombinemultidiscipli
narymethodsandtechnologies,weproposethestudythoughtofthematerialbasisofsecondarydevelopmentofmajortraditionalChinese
medicinevarietiesbasedonthecombinationofinvivoandinvitroexperimentsItisbelievedthatstudiesonmaterialbasisneedsthree
links,namelyidentification,screeningandverification,andinvivoandinvitrostudymethodcorespondingtoeachlinkismutualy
complementedandverifiedFinaly,theaccurateandreliablematerialbasisisselectedThisthoughtprovidesreferenceforthesec
ondarydevelopmentofmajortraditionalChinesemedicinevarietiesandstudiesoncompoundmaterialbasis
[Keywords] traditionalChinesemedicine;secondarydevelopment;combinationofinvivoandinvitroexperiments;study
thought
doi:10.4268/cjcmm20132337
[责任编辑 曹阳阳]
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