全 文 ：桂枝茯苓胶囊对大鼠体外培养卵巢颗粒细胞增殖的
影响及物质基础评价
王振中１，２，范麒如２，窦霞２，赵武２，毕宇安２，萧伟２，段金廒１
（１南京中医药大学，江苏 南京 ２１００４６；
２江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 ２２２００１）
［摘要］　目的：了解桂枝茯苓胶囊各分离部位对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响，并探讨了物质基础与效应之间的关系。
方法：将桂枝茯苓胶囊水提物经大孔树脂分离得到不同部位，以２，２０，２００ｍｇ· Ｌ－１３个剂量加入培养的大鼠卵巢颗粒细胞
中，通过ＭＴＴ法观察药物对卵巢颗粒细胞生长的影响；采用ＬＣ＼ＵＶ＼ＭＳ＼ＭＳ法对活性显著部位的主要色谱峰进行分析鉴定。
结果：桂枝茯苓胶囊促进大鼠卵巢颗粒细胞增殖的活性部位主要为ＧＺ５，ＧＺ６，通过与标准化合物对照及质谱特征对活性显
著部位ＧＺ５，ＧＺ６进行了归属和指认，鉴定了７个化合物，分别为苦杏仁苷、芍药内酯苷、芍药苷、１，２，３，４，６Ｏ没食子酰葡
萄糖、苯甲酸、芍药新苷、肉桂酸等。结论：桂枝茯苓胶囊促进卵巢颗粒细胞增殖的生物效应源于水溶性部位，水溶性部位经
大孔树脂吸附醇梯度洗脱得到了５０％（ＧＺ５）、６０％（ＧＺ６）两段活性部位。
［关键词］　桂枝茯苓胶囊；卵巢颗粒细胞；效应物质基础；ＨＰＬＣＭＳ
［收稿日期］　２００９０２１０
［基金项目］　国家科技支撑计划（２００６ＢＡＩ１１Ｂ０３）；江苏省科技发
展计划（ＢＥ２００４６１）
［通信作者］　萧伟 ，Ｔｅｌ：（０５１８）８５５２１９５６，Ｆａｘ：（０５１８）８５５２２０１７
　　桂枝茯苓胶囊源自《金匮要略》中桂枝茯苓丸
经剂型改革而来，临床常用于治疗卵巢囊肿、子宫内
膜异位症、子宫肌瘤、慢性盆腔炎等妇科疾病［１３］，近
年用于治疗原发性痛经也取得较好的疗效［４］。本
研究以体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞作为研究对
象，初步探讨了桂枝茯苓胶囊促进卵巢颗粒细胞增
殖的生物效应与化学成分的相关性，为阐明复方效
应物质及建立以有效成分为指标的质量标准奠定了
基础。
１　材料
１１　药物与试剂　桂枝茯苓胶囊（江苏康缘药业
股份有限公司，批号０７０８１０）；ＭｃＣｏｙ’５Ａ培养基，
Ｓｉｇｍａ公司，批号０２６Ｋ８３０２；Ｌ谷氨酸，中国惠兴生
化试剂有限公司，批号２００５１２２８；兽用血清促性腺
激素 （ＰＭＳＧ），宁波三生药业有限公司，批号
０７０７０９；噻唑蓝 （ＭＴＴ），Ａｍｒｅｓｃｏ公司；台盼蓝
（Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ），Ｃｈｒｏｍａ进口分装；苦杏仁苷、芍药
苷、苯甲酸、肉桂酸、芍药内酯苷、１，２，３，４，６Ｏ没食
子酰葡萄糖、芍药新苷，均购自中国药品生物制品检
定所。
１２　动物　未孕３周龄雌性 ＳＤ大鼠（６０～７０ｇ），
购于江苏省实验动物中心，合格证号 ＳＹＸＫ（苏）
２００２００５３。
１３　仪器　超净工作台，苏州市洁净技术研究所；
ＬＤＺ５２医用离心机，北京医用离心机厂；ＸＳＺＤ２光
学倒置显微镜，重庆光学仪器厂；ＮＡＰＣ０５４１０二氧
化碳培养箱，ＰＲＥＣＩＳＩＯＮＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ公司；Ｓｐｅｃ
ｔｒｕｍＭＡＸ１９０酶标仪，美国ＡＤ公司；ＭｉｌｉＱＰｌｕｓ超
纯水装置，美国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司；Ｄｅｌｔａ３２０ｐＨ指示计，
梅特勒一托利公司；ＦｉｎｎｉｇａｎＴＳＱ液质联用仪，美国
ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ公司。
２　方法
２１　样品制备　桂枝茯苓胶囊内容物，加入适量去
离子水加热提取 ２次，每次 ３０ｍｉｎ，合并煎液，上
Ｄ１０１大孔树脂，乙醇梯度洗脱，依次得水洗部位
（ＧＺ０）、１０％醇洗部位（ＧＺ１）、２０％醇洗部位（ＧＺ
２）、３０％醇洗部位（ＧＺ３）、４０％醇洗部位（ＧＺ４）、
５０％醇洗部位（ＧＺ５）、６０％醇洗部位（ＧＺ６）、７０％
醇洗部位（ＧＺ７）、８０％醇洗部位（ＧＺ８）、９５％醇洗
部位（ＧＺ９）。
２２　大鼠卵巢颗粒细胞的培养　参照文献方法
培养大鼠卵巢颗粒细胞［５］：取雌性大鼠 ４只，颈
部皮下注射 ＰＭＳＧ５０Ｕ／只，以促进卵泡发育，４８
ｈ后脱颈处死，放入盛有７５％乙醇的玻璃缸内，
浸泡２ｍｉｎ。在半无菌的状态下打开腹腔，把卵
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巢及周围附着的脂肪组织一并取出，迅速放入灭
菌的含 ＤＨａｎｋｓ＇培养皿内，然后在超净台内除去
多余的脂肪、输卵管、血液残留物等，再用 Ｄ
Ｈａｎｋｓ＇冲洗液将卵巢逐个冲洗３遍。然后移入含
ＭｃＣｏｙ’５Ａ培养基，在体视显微镜下用注射针头
刺破卵泡，轻轻挤压，２００目钢筛过滤，１０００
ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，计数，用台盼蓝统计细胞活
力，细胞活率为８０％以上。以 １×１０６个／ｍＬ种
板，每组设６个复孔。第２天加入桂枝茯苓胶囊
各部位组分，使其形成 ２，２０，２００ｍｇ·Ｌ－１３个
剂量，继续培养 ４８ｈ后 ＭＴＴ法测定细胞生长
情况。
２３　色谱条件　色谱柱 ＡｌｔｉｍａＣ１８（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ）；采用Ａ乙腈，Ｂ０２％冰醋酸水溶液系统梯度
洗脱，０～６０ｍｉｎ，Ａ５％ ～９５％；检测波长 ２３０
ｎｍ；柱温３０℃；流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１，进样量１０μＬ。
２４　质谱条件　负离子扫描模式；喷雾电压３２００
Ｖ；鞘气３０ｐｓｉ；辅助气２０ｐｓｉ；毛细管温度３２０℃；扫
描质子范围１００～１０００ｍ／ｚ。
３　结果
３１　不同极性部位对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影
响　在２ｍｇ·Ｌ－１剂量下，各部位对颗粒细胞增殖
的促进作用均不明显；在 ２０，２００ｍｇ· Ｌ－１剂量
下，ＧＺ５，ＧＺ６明显促进颗粒细胞增殖，与对照组
相比有显著差异（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１）。结果
见表１。
３２　不同极性部位化学成分分析　分别取 ＧＺ
５，ＧＺ６部位供试品溶液及各对照品溶液按上述
条件进行 ＬＣ＼ＵＶ＼ＭＳ＼ＭＳ检测。由质谱解析结果
和与对照品的保留时间、质谱图的对比（图１，２），
可确认 ＧＺ５，ＧＺ６部位中含有苦杏仁苷、芍药内
酯苷、芍药苷、１，２，３，４，６Ｏ没食子酰葡萄糖、苯
甲酸、芍药新苷、肉桂酸等７种成分（表 ２）。
４　讨论
卵巢颗粒细胞为生殖细胞，是构成卵泡的重要
组成，颗粒细胞数量愈多，产生的激素愈高，而痛经
与月经周期中性激素变化有相关性［６］。从本实验
结果可知，桂枝茯苓胶囊对离体培养的大鼠卵巢颗
粒细胞增殖具有明显的促进作用。
成分分析结果表明，ＧＺ５，ＧＺ６部位的化学物
质存在一定交叉，同时效应评价也表明这２个相邻
部位均具有类似的活性，因此可考虑将其合并后
　　表１　桂枝茯苓胶囊各组分对大鼠体外培养卵巢
颗粒细胞生长的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
剂量
／ｍｇ·Ｌ－１
Ａ４９０
增殖率
／％
对照 ００９８±００１２
００９１±００１１
０１１０±００１３
ＧＺ０ ２ ００８６±０００１ １２４７
２０ ００８８±０００１ ３７９
２００ ０１００±０００１ １１３５
ＧＺ１ ２ ００８２±０００１ １６４６
２０ ００８８±０００１ ３５２５
２００ ００９８±０００１ １０２３
ＧＺ２ ２ ００８４±０００４ １４３５
２０ ００８３±０００１ １１５５
２００ ０１１５±０００２ １００９
ＧＺ３ ２ ００８４±０００５ １３９４
２０ ００８３±０００１ ８９１５
２００ ０１１５±０００４ ５２１
ＧＺ４ ２ ００８３±０００２ １５１３
２０ ００８７±０００８ ４６７
２００ ０１２４±０００１ １２９７
ＧＺ５ ２ ００８８±０００３ ９６５
２０ ０１１８±０００２１） ２９６０１）
２００ ０３２３±００１９２） １９５８０２）
ＧＺ６ ２ ００９０±０００２ ８３５
２０ ０１０７±０００１１） １７９２１）
２００ ０２５９±００１５２） １３６６８２）
ＧＺ７ ２ ００８３±０００４ １４９６
２０ ００８６±０００２ ４９２
２００ ０１２４±０００８ １３６１
ＧＺ８ ２ ００８６±０００７ １２５１
２０ ００７９±０００１ １３２０
２００ ０１１６±０００８ ５９１
ＧＺ９ ２ ００９１±００１４ ７１９
２０ ００８２±０００４ １００５
２００ ０１１６±０００３ ６００
　　注：与空白组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
表２　ＬＣ／ＵＶ／ＭＳＭＳ法分析桂枝茯苓胶囊ＧＺ５，ＧＺ６
部位中７个化合物
峰号
保留时间
／ｍｉｎ
［Ｍ＋Ｈ］＋
／ｍｚ－１
［Ｍ＋ｃｌ］＋
／ｍｚ－１
［Ｍ＋Ａｃ］＋
／ｍｚ－１
化合物
１ １９．１９ ４５６ ４９２ ５１６ 苦杏仁苷
２ ２１．２０ ４７９ ５１５ ５３９ 芍药内酯苷
３ ２６．１２ ４７９ ５１５ ５３９ 芍药苷
４ ２８．１６ ９３９ 　１，２，３，４，６Ｏ
没食子酰葡萄糖
５ ２９．８６ １２１ 苯甲酸
６ ３８．６０ ４６１ ４９７ ５２１ 芍药新苷
７ １３．１６ １４７ 肉桂酸
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Ａ对照品；ＢＧＺ５图；ＣＧＺ６图；１苦杏仁苷；２芍药内酯苷；
３芍药苷；６１，２，３，４，６Ｏ没食子酰葡萄糖；５苯甲酸；
６芍药新苷；７肉桂酸。
图１　桂枝茯苓胶囊ＧＺ５，ＧＺ６部位ＴＩＣ图
Ａ对照品；ＢＧＺ５；ＣＧＺ６；１苦杏仁苷；２芍药内酯苷；３芍药苷；
６１，２，３，４，６Ｏ没食子酰葡萄糖；５苯甲酸；６芍药新苷；７肉桂酸。
图２　桂枝茯苓胶囊ＧＺ５，ＧＺ６部位ＵＶ图
做进一步研究。对其中鉴定出的７个化合物，部分
活性已有相关报道，如苦杏仁苷、芍药苷［７９］等，为阐
明复方药效物质群及建立以有效成分群为基础的质
量标准提供了实验依据。
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ｋｅｉｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆａｃｙｔｏｋｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ
ｃｈｅｍｏａｔｒａｃｔａｎｔ，ＣＩＮＣ／ｇｒｏ，ｉｎｔｈｅｒａｔｏｖａｒｉａｎｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］
ＡｍＪＲｅｐｒｏｄＩｍｍｕｎｏｌ，２００３，４９（１）：１４
［６］　ＭｉｌｓｏｍＩ，ＳｕｎｄｅｌＧ，ＡｎｄｅｒｓｃｈＢＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｍ
ｂｉｎｅｄｏｒａｌｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅｓｏｎｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆｄｙｓｍｅｎ
ｏｒｈｅａｌ［Ｊ］Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ，１９９０，４２（５）：４９７
［７］　邢国秀，李楠，杨美燕，等天然苦杏仁苷的研究进展［Ｊ］
中成药，２００３，２５（１２）：７００１
［８］　孙丽荣，曹雄，侯风清，等芍药苷研究进展［Ｊ］中国中药
杂志，２００８，３３（１８）：８２０２
［９］　卢娟，汪辉，卢方安肉桂酸对胃腺癌细胞诱导分化的实验
研究［Ｊ］中国药理学通报，２００７，２３（２）：２３７
［责任编辑　古云侠］
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