全 文 ：黄晓舞! 廖红波! 刘屏!! 林辉! 袁丽燕! 胡园
解放军总医院 临床药理研究室! 北京 $$()#
$摘要%!目的&对人工合成绿原酸全抗原!M84致豚鼠过敏休克模型并制备抗血清和备检组织样品)JH染色观察致敏豚鼠肺%气管和肝组织的病理改变)采用被动肥大
细胞脱颗粒试验观察作生阳性反应$脱颗粒率为!#)f( k$f+)g)M84具有致豚鼠过敏作用$其过敏机制属于
0
型变态反应(
$关键词%!绿原酸全抗原)致敏反应)
0
型变态反应
$收稿日期%!+$$$+$$*
$基金项目%!国家自然科学基金项目!*$%$*$&$
$通信作者%!!刘屏$NQV#!$$ ##*)##%#$ H50BRV# FRWAR2D+#3
+#-./0
!!随着中药现代化的发展$中药制剂在临床上的
应用日益广泛$但其过敏性不良反应的报道也急剧
增多$引起了人们的高度重视( 一直以来$认为中药
注射剂发生过敏性不良反应的原因是中药注射剂达
不到质量要求$因此$各生产企业加大了制剂工艺过
程的质量控制$特别是一些主要的中药注射液生产
企业实现了指纹图谱质量控制和生产全过程的标准
化$但是临床应用中仍出现过敏反应事件( 可见$注
射液本身药效成分导致过敏的因素值得研究(
绿原酸被认为是众多中药材和中成药抗菌解
毒%消炎利胆的主要有效成分$在清热解毒类的中药
注射剂处方中$金银花%忍冬藤%鱼腥草%茵陈%栀子
等药材中均含绿原酸*+ ( 且已有文献报道认为绿
原酸是重要致敏成分*++ $是一种半抗原物质$经一
定反应与蛋白质上的氨基结合后而具有致敏活性(
为阐明绿原酸的致敏作用机制$本课题组已合成绿
原酸全抗原*)+ $本文建立绿原酸全抗原致豚鼠过敏
模型$通过多种过敏检测方法评价绿原酸全抗原的
致敏作用并初步探讨其致敏机制(
!材料与方法
]!试剂与仪器 绿原酸全抗原!实验室制备提供)绿原酸 !北京化学试剂公司$纯
度n*(g)弗氏完全佐剂!8RD0B公司)GQC./V分
离液!北京 8/VBC]R/试剂公司)甲苯胺蓝%中性红
!8RD0B公司)伊文思兰!北京化学试剂公司)磷酸
盐缓冲液!GM8$AJ%f+$$f$ 0/V-Fd)>G9:#&$
培养液!J6.V/2Q公司)胎牛血清!LR]./公司)卵
清蛋白!O\4$北京 8/VBC]R/试剂公司)生物倒置显
微镜!;R[/2公司)冷冻离心机!8RD0B公司)多功
能酶标仪!GH)= 万分析电子天平!日本 8?R0BU5
YW公司)+
孵箱!日本( :DH和组胺的HF:84试
剂盒!西美杰生物技术公司)自行配制的缓冲液有
台氏液#;BJ
+
GO
&
-+J
+
O$f$# D$;BJ)
f$ D$
+
$f+ D$葡萄糖 f$ D$定容至 $$$ 0F( 包被缓
冲液!AJ*f##;B
+
)
f* D$;BJ)
+f)* D$定容
至 $$$ 0F(
]!动物 豚鼠 &+ 只$8GE级$体重 ($ j++$ D$
由军事医学科学院实验动物中心提供$许可证号
8]&!豚鼠致敏休克模型的建立及抗血清的制备!
豚鼠 )$ 只$随机均分为空白对照组%阴性对照组%阳
性对照组%绿原酸组%绿原酸全抗原组$每组 # 只(
空白组 $)$ U腹腔注射 f$ 0F生理盐水)阴性组
第 天腹腔注射 M84!f$ 0D$f 0F加等量弗氏
佐剂共 f$ 0F$第 )$ 天注射M84!f$ 0Df$ 0F
加强免疫)阳性组第 天腹腔注 O\4!f$ 0D$f
0F加等量弗氏佐剂共 f$ 0F$第 )$ 天注射 O\4
!f$ 0Df$ 0F加强免疫)绿原酸组第 天腹腔注
射0F$第 )$ 天注射绿原酸全抗原组第 天腹腔注射 -(-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
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0D$f 0F加等量弗氏佐剂共 f$ 0F$第 )$ 天注
射等量的后第 & 天尾静脉注射生理盐水 f$ 0F$阴性组注
射!f$ 0Df$ 0F$绿原酸组注射 0F$绿原酸全抗原组注射 0F$观察豚鼠的过敏症状( 激发前眼眶采血 次$
激发完 )$ 0R2 后眼眶再次取血$& h$ $$ C-
0R2
d离心 $ 0R2后取血清$血清冷冻保存( 气管%
肺%肝脏组织用常规甲醛固定%脱水%石蜡包埋后$切
片!厚约 $f

0$JH染色$镜下观察(
]Y!被动致敏豚鼠腹腔肥大细胞!G9<脱颗粒试
验 肥大细胞的制备参照文献方法*&+ ( 取豚鼠 +
只$正常动物颈动脉放血处死收集腹腔肥大细胞液$
用预冷的不含钙的台氏液 $ 0F腹腔注射$轻轻按
摩腹部 + 0R2 $打开腹腔$吸取腹腔冲洗液$& h$
$$ C-0R2
d离心 & 0R2 $取细胞悬液$缓慢加入
)$g j($g的 GQC./V梯度分离液中$& h$ + $$ C
-0R2
d离心 0R2 $用台氏液洗 + 次!& h$ $$$ C
-0R2
d离心 $ 0R2 $收集界面细胞$镜下计数$调
细胞至 i$个=0F( 台盼蓝染色$活力大于 g$
甲苯胺蓝染色$纯度大于 *g $置于含 $g小牛血
清的>G9:#&$ 培养液中悬浮备用(
悬浮培养的正常豚鼠 G9<&$$

F与 M84%绿原酸组%阳性组%阴性组的致敏豚鼠血清 &$$

F$)% h共孵育 + ?$& h终止反应$用冷台氏液洗
涤$弃上清液( 正常组在细胞悬液中加入生理盐水
)$$

F$阴性组在细胞悬液中加入
F$阳性组在细胞悬液中加入 O\4)$$

F$绿原酸
全抗原组加入
F$绿原酸组加入

F$均为 + D-Fd$孵育 )$ 0R2$& h终止
反应$用冷台氏液洗涤$收集细胞( 镜下观察肥大细
胞脱颗粒情况$高倍镜下计算 $$ 个肥大细胞中明
显脱颗粒的细胞数( 脱颗粒百分率e脱颗粒肥大细
胞数=肥大细胞总数i$$g(
]$!HF:84法测定过敏豚鼠血清 :DH和组胺的含
量 采用竞争性酶联免疫测定法进行测定( 用 $

D-F
d相应抗原包被酶标板$每孔 $$

F$)% h
过夜!( ?$甩去包被液$用洗涤液洗涤反应板!每
孔内加入 )$

F洗涤液$并去除水滴!在厚叠吸
水纸上拍干)反复洗涤 次( 每孔加入 $$

F i
MR/@R2( 轻轻混匀 )$ S$封住板孔$)% h温育 *$ 0R2(
甩尽板内液体$用洗涤液洗涤反应板!每孔内加入
)$

F洗涤液$并去除水滴!在厚叠吸水纸上拍
干)反复洗涤 次( 每孔加入 $$

F iJ>G( 轻
轻混匀 )$ S$封住板孔$)% h温育 )$ 0R2( 甩尽板
内液体$用洗涤液洗涤反应板!每孔内加入 )$

F
洗涤液$并去除水滴!在厚叠吸水纸上拍干)反复
洗涤 次( 每孔加入 $

F显色液4和 $

F显色
液M$轻轻摇匀 $ S$)% h暗处温育! k$ 0R2(
每孔加入 $$

F终止液( 轻轻混匀 )$ S))$ 0R2内
在 &$ 20处读#值(
][!统计处理!数据采用理$结果均用
$
8k$表示$方差检验$组间比较采用
检验(
!结果
]!豚鼠过敏性休克模型 绿原酸全抗原组激发
后$均很快出现躁动$呼吸困难$口鼻流涎$四肢软弱$
全身抽搐$# 只豚鼠在 + 0R2 内全部死亡( 阳性组心
脏注射O\4$f 0F后$很快出现上述类似的症状$+
0R2内也全部死亡( 阴性组心脏注射 0F后$未出现上述类似的症状$未死亡$绿原酸组除
个别出现微小的过敏症状外其余都表现正常(
]!G9<脱颗粒试验 阳性和绿原酸全抗原致敏
血清原液处理组经抗原攻击后$镜检有丰富肥大细
胞膜不完整$颗粒脱出胞外$脱颗粒率分别为
!%f#) kf(g$!#)f( k$f+)g$呈阳性反
应$与空白组!+*f$$ k(f%g比较9l$f$( 正常
组除有个别细胞脱颗粒外大部分细胞保持完整性$
肥大细胞轮廓清晰$胞浆内颗粒丰富$见图 ( 肥大
细胞脱颗粒结果见图 +$其他各组脱颗粒率均小于
&$g$呈阴性反应(
]&!HF:84法检测过敏血清中 :DH和组胺的含量
!全抗原激发豚鼠血清中特异性 :DH%组胺较正常
组明显升高$初步证实了合成的全抗原产生的过敏反应可能为
0
型超敏反应( 见表 (
]Y!致敏豚鼠组织病理切片!各组动物的气管%
肺%肝脏组织病理切片结果见图 )( 肺组织#正常组
气道上皮结果完整$肺泡结构正常$无炎症反应)绿
原酸全抗原组气道上皮增厚脱落$肺泡水肿$充血有
炎性细胞渗出( 气管#正常组气管及支气管的组织
形态未见明显异常)绿原酸全抗原组气管及支气管
全部出现明显而广泛的慢性炎细胞浸润$管腔上皮
完全脱落$腺体消失$管壁及黏膜下层纤维素样!!
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图 !正常组肥大细胞脱颗粒
图 +!豚鼠腹腔肥大细胞脱颗粒
表 !激发豚鼠血清中特异性:DH和组胺的HF:84测定
组别 特异性:DH 组胺
阳性!!!!
$f*$ k$f$(

%$f# k(f)
+
阴性!!!! $f&( k$f$ f& kf&*
绿原酸!!! f+ k$f$# +f+ kf)#
绿原酸全抗原
f%& k$f$*
+
&(f) kf($

空白!!!! $f&( k$f$( +f* k&f&
!!注#与空白组比较9l$f$$+9l$f$(
坏死$纤维组织增生明显$黏膜下层增厚( 肝脏#正
常组肝小叶为类圆形$ 中心为中央静脉$ 肝细胞索
呈放射性规则排列$ 肝细胞索间或与肝细胞界板间
相互吻合成网状)绿原酸全抗原组肝小叶失去正常
结构$胶原纤维沿界板破坏处向肝小叶内延伸形成
假小叶$肝细胞变性坏死程度明显(
&!讨论
过敏症动物模型的建立是研究过敏原的重要手
段( 大分子化合物如蛋白质等为完全抗原$可直接
免疫动物建立过敏症动物模型*+ )分子结构明确的
单一小分子化合物作为半抗原$可以采用化学偶联
!!
图 )!致敏豚鼠气管%肺%肝脏组织病理切片
的方法与蛋白质等大分子物质合成完全抗原再免疫
动物*#5%+ ( 绿原酸作为半抗原$本身不具备致敏性$
在本研究结果中得到了证实$豚鼠肥大细胞脱颗粒
试验中$绿原酸致敏组豚鼠血清未出现阳性反应)致
豚鼠过敏模型中$绿原酸组豚鼠血清组胺含量无明
显变化$特异性:DH含量亦无升高现象(
肥大细胞是一种异质性细胞群体$当其受到刺
激时$特异性抗原与结合在肥大细胞表面的特异性
:DH交联$颗粒移至表面$分解并释放出多种活性介
质而发生变态反应$如组胺%白三烯及血小板活化因
子等( 其中释放的组胺可与机体不同部位的受体结
合$产生平滑肌收缩%血管通透性增加和黏液分泌增
多等过敏样症状$是过敏反应症状产生的最主要的
活性物质之一( 同时组胺也被认为是引起变态反应
炎症的主要活性物质之一$变态反应炎症是变态反
应发病过程中最重要的病理生理学改变之一$易发
生变态反应炎症的组织主要有支气管%肺%肝%皮肤
和鼻黏膜等$其特征因发生的组织不同而有所区别$
但其共同特征是炎症早期以渗出性炎症为主( 许多
药物引起的急性过敏反应都与组胺有关$故血浆组
胺常作为早期过敏诊断指标之一( 且在临床上也体
-)(-
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现出来组胺测定的重要性$医生们常将组胺测定看
成是急性过敏监测的.金标准/(
本文采用豚鼠腹腔肥大细胞脱颗粒试验对全抗
原后电镜观察各组织变态反应炎症的发生情况( 变态
反应炎症是变态反应发病过程中最重要的病理生理
学改变之一$本实验中绿原酸全抗原所致过敏性变
态反应炎症主要表现为炎细胞浸润和血管炎$同时
具有毛细管扩张和通透性增加所致组织水肿等变态
反应的基本病理改变( 镜下观察$绿原酸全抗原组$
阳性对照组豚鼠的肺%气管%肝组织均发生了由于过
敏性变态反应引起的病理改变( 进一步采用酶联免
疫法对血清组胺含量进行测定$发现经全抗原激发
后豚鼠血清中组胺含量比正常对照组有明显的升
高$这与过敏反应发生机制是一致的(
0
型变态反应是以 :DH为主介导的变态反应$
变态反应性疾病患者或动物的血清中存在有针对变
应原的:DH$称之为特异性:DH$特异性:DH测定是变
应原体外特异性诊断的重要手段( 测定血清特异性
:DH含量$观察中药注射剂对特异性 :DH有无影响)
以及对过敏介质白细胞三烯和组胺有无影响( 通过
这些速发型变态反应检测方法对中药注射液及其他
们原料药等引起致敏的检测$分析致敏物质成分$是
研究中药注射液过敏机制的常用手段( 本文在建立
豚鼠致敏模型的基础上$通过对豚鼠血清 :DH及过
敏介质组胺的测定结果推测 生
0
型变态反应( 为中药注射剂过敏不良反应的研
究提供了实验依据(
$参考文献%
*+!中国药典*8+-一部-+$$-
*++!金乾兴$王芳$张燕花-对中药注射剂不良反应增多的分析与
思考*X+-浙江中医药大学学报$+$$#$)$!#)*-
*)+!林辉$刘屏$王建勋$等-绿原酸人工抗原的合成及反应条件的
优化*X+-中国中药杂志$+$$*$)&!#*$#-
*&+!9R6/S?R8$bB,B@Bb$J/S/[B,B9$ Q@BV-JRS@B0R2QCQVQBSR2DCQ5
B.@R/2 R2UW.QU ]6@?Q;5@QC0R2BVU/0BR2 /TcR]CR/cWV2RTR.WS0Q@BV5
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*+!GBWVW?2 X$ 9/?C_-H7AQCR0Q2@BVBAAC/B.?QS@/QcBVWB@QCQSARCB5
@/C6BVQCD6R2 B2R0BV0/UQVS*X+ -H7A N/7R./VGB@?/V$ +$$$ #
!&G #+$)-
*#+!于洪侠$杨曙明$朱宇-莱克多巴胺多克隆抗体的制备*X+-中
国兽医科学$ +$$# $)#! ##+-
*%+!黄雅丽$程敬丽$桂文君$等-氯霉素多克隆抗体的制备及免疫
活性研究*X+-浙江大学学报#农业与生命科学版$ +$$# $)+
!+ #($-
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