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白及药材中多糖的含量测定研究



全 文 :·研究报告·
白及药材中多糖的含量测定研究
王爱民,王永林,郑林,李勇军
(贵阳医学院 药学院,贵州 贵阳 550004)
[摘要] 目的:建立白及药材中白及多糖的含量测定方法。方法:采用水提醇沉制备供试品溶液,以02%蒽酮硫酸显
色,紫外分光光度法测定多糖含量。结果:葡萄糖质量在0036~018mg线性关系良好,本法稳定,平均回收率为1002%,
RSD27%(n=9),人工栽培的白及药材中多糖含量差别不大,较为稳定。结论:所建立方法准确,简便,可为作为白及药材质
量评价的依据之一。
[关键词] 白及;白及多糖;含量测定
[收稿日期] 20090325
[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目子课题(2006BAI06
A0103);贵州科学技术基金项目黔科合[2009]2149号;贵阳市科学
技术计划[2008]筑科农合第1527号
[通信作者] 王永林,Tel:(851)6908899,Email:gywam100@
gmail.com
  白及为兰科植物白及 Bletilastriata(Thunb.)
Reichb.f.的干燥块茎,具收敛、止血、清热利湿、消
肿生肌之功效,用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡
肿毒、皮肤皲裂、溃疡出血等症。白及富含白及
胶[1],现代药理研究表明白及胶能抑制肿瘤血管生
成,兼有抗感染、抗肿瘤和促进凝血的功能[23],白及
胶质的主要成分为大分子多糖,同时含联苄类、二氢
菲类、双菲醚类、双氢菲并吡喃类,菲类、菲螺内酯类
50余种化合物[4]。作者在对贵州省正安县白及
GAP种植基地产白及进行质量评价时,发现《中国
药典》2005年版一部对白及的质量控制仅有性状和
薄层色谱鉴别,没有对白及中具有药理活性的白及
多糖和相关指标成分进行质量控制,有关白及药材
中白及多糖和其他有关成分的含量测定较少报道,
也未见有关白及药材质量评价的报道,为了较为全
面的评价贵州正安白及药材的质量,作者通过对白
及药材化学成分的研究,从中制备出白及多糖和分
离出含量较高的双[4(βD吡喃葡萄糖氧)苄基]
2异丁基苹果酸酯(militarine),分别以白及多糖和
指标成分militarine对白及药材的质量进行评价。
1 材料
UV2401PC紫外可见光分光光度计(日本岛
津),METTLERAE240电子天平(梅特勒脱利多仪
器[上海]有限公司);D无水葡萄糖对照品(中国药
品生物制品检定所,批号110833200302);蒽酮(分
析纯,上海试剂一厂);硫酸、无水乙醇等为国产分
析纯。
白及药材来源为贵州正安白及药材 GAP种植
基地,贵州正安县野生,安徽亳州市中药饮片厂和广
西河池野生,以上白及药材均由由贵州大学生命科
学院石建明教授鉴定为B.striata。
2 方法与结果
2.1 对照品储备液的制备
精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对
照品1780mg,置100mL量瓶中,加水溶解并稀释
至刻度,摇匀,即得。
2.2 供试品溶液制备
取本品粉末(过三号筛)02g,精密称定,置园
底烧瓶中,精密加水50mL,称重,用电加热器直接
加热回流1h(保持微沸),放冷,用水补足减失的质
量,摇匀,滤过。精密量取续滤液5mL,加无水乙醇
30mL,摇匀,放置1h,离心(4000r·min-1)5min,
倾去上清液,沉淀用热水溶解,放冷,置100mL量瓶
中,用水稀释至刻度,摇匀,即得。
2.3 蒽酮试液的配制
取蒽酮02g,用浓硫酸溶解并稀释至100mL,
临用时配制。
2.4 测定波长的选择
分别精密量取 D无水葡萄糖对照品溶液和供
试品溶液适量,分别置10mL刻度试管中,加水稀释
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至20mL,加02%蒽酮硫酸溶液显色,以相应试
剂为空白,置分光光度计上绘制光谱图,葡萄糖对照
品与白及供试品均在625nm处有最大吸收。
2.5 标准曲线的制备
精密量取对照品储备液 02,04,06,08,1
mL,分别置10mL刻度试管中,各加水至20mL,摇
匀,精密加入02%蒽酮硫酸溶液6mL,混匀,置沸
水浴中加热 10min,取出,立即置冰浴中冷却 10
min,取出,以相应试剂为空白。在625nm波长处测
定吸光度,以吸光度(A)为纵坐标,质量(X)为横坐
标,绘制工作曲线。线性回归方程为 A=606X+
99×10-3,r=09997,试验结果表明,葡萄糖质量
在0036~018mg,用02%蒽酮硫酸溶液显色后
的线性关系良好。
2.6 重复性试验
取正安GAP样品(批号20051027)6份,按供试
品溶液制备方法制备供试液,精密取量供试液 1
mL,照标准曲线的制备项下的方法,自“精密加入
02%蒽酮硫酸溶液6mL”起,依法测定吸光度,计
算,其中白及多糖以无水葡萄糖计为3267%,RSD
25%(n=6)。
2.7 对照品溶液和供试品溶液显色后稳定性考察
分别取葡萄糖对照品和白及供试品溶液适量用
02%蒽酮硫酸溶液显色,以相应的试剂作空白,置
比色皿中,在分光光度计上于625nm测定吸光度,
每隔10min读数,共考察60min,结果对照品溶液
和供试品溶液显色后在60min稳定。
2.8 准确度试验
2.8.1 白及多糖的提取与精制[57] 取白及药材粗
粉25g,加80%乙醇回流提取2次,每次2h,药渣
挥干后,用沸水提取2次,提取液浓缩,加乙醇使含
醇量为 80%,放置过夜,离心收集沉淀物,再溶于
水,加01%活性炭脱色,滤过,滤液再加乙醇使含
醇量为80%,放置过夜,离心收集沉淀物,用适量水
溶解,采用Sevage法除蛋白,反复进行至无蛋白层,
经双缩脲反应呈阴性表明无蛋白质存在,再醇沉,沉
淀物用无水乙醇、丙酮依次洗涤,挥去有机溶剂,60
℃减压干燥,得白及多糖。
2.8.2 换算因子的测定[810] 精密称取60℃减压
干燥至恒重的白及多糖2142mg,置100mL量瓶
中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取该液5
mL,置10mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为
白及多糖供试品溶液,精密量取1mL,照标准曲线
的制备项下的方法测定吸光度,按下式计算换算因
子:f=W/C,式中 W为多糖质量数(mg),C为葡萄
糖质量数(mg),测得换算因子平均值为 f=1111
3,RSD21%(n=3)。
2.8.3 回收率试验 取已测定含量的白及药材样
品9份(平均含量以无水葡萄糖计为3267%,计算
回收率时用换算因子将无水葡萄糖换算为白及多
糖),精密称定,分别置园底烧瓶中,照22项下制
成供试品溶液,分别显色,测定,结果见表1。
表1 白及多糖加样回收率试验
样品量
/mg
含多糖量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1023 3714 1803 5454 9651    
1065 3866 1744 5659 1028    
1084 3935 1683 5583 9792    
1022 3711 4020 7717 9965    
1046 3797 3631 7539 1031 1002 27
1019 3700 3909 7497 9713    
1094 3972 5675 9828 1032    
1011 3671 5415 9048 9930    
1028 3732 5628 9477 1021    
  注:白及多糖质量数(mg)=换算因子(f)×无水葡萄糖质量
(mg)。
2.9 样品测定
按上述对照品溶液和供试品溶液的制备方法制
备供试品溶液和对照品溶液,用02%蒽酮硫酸溶
液显色,测定,见表2。
表2 白及药材多糖含量测定(n=2)
No. 批号 样品说明
多糖含量
(以无水葡萄糖计)/%
1 20051027 正安GAP基地二年生 327
2 20051101 正安GAP基地二年生 286
3 20060128 正安GAP基地二年生 365
4 20060330 正安GAP基地二年生 314
5 20060529 正安GAP基地二年生 328
6 20060730 正安GAP基地二年生 338
7 20060930 正安GAP基地二年生 339
8 20061013 正安GAP基地二年生 306
9 20061130 正安GAP基地二年生 341
10 20061228 正安GAP基地二年生 305
11 20070226 正安GAP基地二年生 280
12 20050115 正安野生白及 365
13 20060401 正安野生白及 242
14 20060930 正安野生白及 325
15 051106 安徽亳州市中药饮片厂 253
16 20050610 广西河池野生 314
17 20060730 广西河池野生 235
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3 结果与讨论
以蒽酮硫酸显色法测定了各产地多批白及药
材中白及多糖的含量,试验还对显色剂的选择、显色
剂的浓度、样品提取的方法、醇沉条件等进行了考
察,结果样品先用水提取,醇沉得到白及多糖再用
02%蒽酮硫酸进行显色,测定,经方法学验证表
明,该法灵敏可靠、重复性和准确度好,可用于白及
药材中白及多糖的含量测定。
以白及药材中活性成分白及多糖作为质量指标
进行测定,从表2结果可见,由于人工栽培条件和生
长环境的不同等因素,导致多糖含量具有一定的差
异,以贵州正安GAP种植基产白及药材中多糖含量
较为稳定,其连续三年二年生9批白及多糖的质量
分数为 280% ~365%,平均值为 320%,RSD
79%(n=9),而野生白及多糖含量变化较大,质量
分数为 235% ~365%,平均值为 289%,RSD
184%(n=6)。
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[责任编辑 周驰]
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