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Vol.34，Issue 3
February，2009
第 34 卷第 3 期
2009 年 2 月
18β-甘草酸和 18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞
CYP3A 酶表达的影响
王宇光 1，杨明会 2，马增春 1，梁乾德 1，谭洪玲 1，肖成荣 1，高 月 1*
（1. 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所 药理毒理研究室，北京 100850；
2. 中国人民解放军总医院 中医研究所，北京 100853）
[摘要] 目的：研究甘草中的 2 种成分 18β-甘草酸和 18α-甘草酸对原代培养大鼠肝细胞中细胞色素 P450 3A（CYP3A）
在 mRNA 及蛋白水平表达的影响，并探讨其剂量-效应关系。方法：原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞并采用“胶原蛋
白凝胶三明治”培养原代肝细胞，无血清条件下培养细胞，并用不同剂量的 18β-甘草酸和 18α-甘草酸处理细胞，RT-PCR 法
测定 CYP3A mRNA 表达水平，Western-blot 法测定 CYP3A 蛋白表达。结果：实验条件下对照组、18β-甘草酸、18α-甘草酸
处理组 CYP3A 基因及蛋白均可被检测，18β-甘草酸浓度依赖性诱导 CYP3A mRNA (25~100 μmol·L-1)及蛋白表达 (50~400
μmol·L-1)，而 18α-甘草酸浓度依赖性抑制 CYP3A mRNA(25~100 μmol·L-1)及蛋白表达(25~100 μmol·L-1)表达。结论：18β-甘
草酸和 18α-甘草酸在转录水平上分别上调和下调大鼠肝细胞 CYP3A 的表达。
[关键词] 18β-甘草酸；18α-甘草酸；CYP3A；原代肝细胞

细胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）作
为最重要的Ⅰ相药物代谢酶系统，广泛参与药物、
致癌物及环境污染物的代谢转化，使得这些代谢产
物的极性增加而利于排出体外，从而起到保护肝脏
和解毒的作用[1]。CYP3A 家族是人肝中表达最丰富
的 P450，其最显著的特征是底物广泛且肝和肠组织
中高表达，而这些组织是接触环境中化合物的主要
器官[2]。文献报道人体肝脏中CYP3A含量约占CYP
含量的 50％，居第 1 位，临床有 50%～60％的药物
要通过此亚酶代谢而排出体外，在药物相互作用中
扮演着重要角色。甘草的临床应用已有几千年的历
史，东汉成书的《神农本草经》中即有记载，并将
其列为上品。甘草在药物配伍中起着重要作用，在
古方剂中应用极为普遍，在这些方剂中，甘草大多
以佐、使药身份出现，起着缓和药性，调和百药的
作用，表明甘草在中药配伍中的调和诸药，缓和药
性的规律带有普遍性，因此有必要对甘草与药物代
谢酶，特别是 CYP3A 之间的相互作用进行研究，
从而有助于对“甘草解百毒和调和诸药”的机制进

[收稿日期] 2008-05-10
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30070936，30701112)
[通信作者] *高月，Tel：(010) 66931312，E-mail：gaoyue@yahoo.com
行深入理解并丰富其药性的相关理论。前期，本实
验室在整体动物水平上研究了甘草对药物代谢酶
各亚型的影响[3]，但其在细胞水平上对 CYP3A 表
达的影响及究竟甘草中的何种成分在发挥这种作
用尚未知晓。本研究了甘草中典型成分 18β-甘草酸
(18β-GA)和 18α-甘草酸(18α-GA)对原代培养大鼠肝
细胞中 CYP3A 在 mRNA 及蛋白水平表达的影响，
为进一步探讨甘草及其成分解毒和调和诸药的分
子机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 甘草购自北京同仁堂，经本所马
百 平 教 授 鉴 定 为 豆 科 植 物 甘 草 Glycyrrhiza
uralensis Fisch. 的 干 燥 根 。 18β- 甘 草 酸
(18β-glycyrrhizic acid)，18α-甘草酸(18α-glycyrrhizic
acid)，pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN)，Ⅳ型胶
原酶均为 Sigma 公司产品。RT-PCR 试剂盒为
Promega 公司产品。辣根过氧化物酶(HRP)标记的
IgG 及 ECL 检测系统为 Santa Cruz 产品。RNA 提
取试剂盒 Trizol，高糖型 DMEM，胎牛血清为 Gibcol
公司产品。PVDF 膜 Amersham 公司产品。所用引
物为北京赛百盛生物技术公司合成。其余试剂均为
国产分析纯。


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1.2 仪器 PCR 仪[GeneAmp PCR System 2400(PE
Applied Biosystem)]；蛋白电泳电转设备（美国
Bio-RAD mini protein 3）；细胞培养箱(日本 NAPCO
5410)；冷冻离心机(Heraeus Labofuge 400R)。
1.3 鼠原代肝细胞培养体系的建立 雄性 SD 大鼠
(180~220 g)，由军事医学科学院动物中心提供，动
物使用许可证号 SCKX(军) 2002-001。采用两步循
环灌流法分离大鼠肝细胞[4]并稍加改动。大鼠用戊
巴比妥钠 (100 mg·kg-1， ip)麻醉后，肝素钠 (300
U·kg-1，ip)，用 75%乙醇消毒，无菌条件下打开腹
腔，将内脏翻移至鼠体左侧，暴露肝门静脉。肝门
静脉插管固定后以预温的无 Ca2+ 的 HBSS(-) (含
EGTA 0.5 mmol·L-1) 灌流10 min，流速20 mL·min-1。
灌注 10 s 后，结扎下腔静脉通往肾静脉远端，在下
腔静脉腹腔段插塑料导管同时结扎胸腔段静脉。当
下腔静脉流出液体变清后，开始灌注预温的 HBSS
缓冲液(含 0.05％Ⅳ型胶原酶) 200 mL，流速 20
mL·min-1，约 10 min 取下软化的肝脏至灭菌瓶皿中，
加入预冷的 HBSS(–)清洗后用弯钳去除肝脏表面
的包膜，轻轻梳理促使肝细胞脱落分散于含有
HBSS(-)的皿中，吸取细胞悬液过 100 目尼龙网以
去除细胞团块和组织纤维。过滤后的细胞悬液离心
(4 ℃，50×g，1 min)，弃上清，HBSS(-)重悬细胞
后离心 (4 ℃，50×g，1 min)，反复 2 次。最后用
DMEM 培养基(含 10％FCS，1 μmol·L-1 地塞米松，
0.1 μmol·L-1胰岛素，100 U·mL-1 青霉素，100 U·mL-1
链霉素，10 mmol·L-1HEPES) 轻柔吹打分散细胞后
离心 (4 ℃，50×g，1 min)，弃上清后加入 DMEM
培养基重悬。用 0.45 %的台盼蓝检测细胞存活率。
存活率达 85％以上的肝细胞可用于实验。
采用“胶原蛋白凝胶三明治”培养原代肝细
胞[5]。取 1 份 DMEM (10 倍浓度，pH 7.4) 和 9 份
自制的鼠尾胶原储存液临用前混匀置冰上备用即
为胶原蛋白使用液(用 1 mol·L-1 NaOH 灭菌溶液中
和)。取 0.8 mL 胶原蛋白使用液在 6 孔板的单板孔
内均匀涂布，37 ℃温孵约 1 h 使胶原蛋白包被形成
附着基质后，之后将分离好的大鼠肝细胞接种于胶
原包被的板孔中，细胞密度 1×107个/孔。37 ℃，
5% CO2 培养约 4 h 至细胞贴壁后吸掉培养基，在
表面再涂布 0.6 mL 胶原蛋白使用液，37 ℃，5%
CO2 培养 3 h 后加入 DMEM 完全培养基(含 10
%FCS，1 μmol·L-1 地塞米松，0.1 μmol·L-1 胰岛素，
100 U·mL-1 青霉素，100 U·mL-1 链霉素，10 mmol·L-1
HEPES)继续培养并每天更换液体。
1.4 18β-甘草酸和 18α-甘草酸对原代培养大鼠肝
细胞作用实验 培养 48 h 后移去培养基并加入含
有不同浓度 18β-甘草酸，18α-甘草酸及 PCN 的无血
清培养基处理细胞，培养 1~2 d 后收集肝细胞，提
取肝细胞总 RNA 及总蛋白，进行 RT-PCR 和
Western-blot 等相关检测。培养基中 DMSO 的终质
量浓度 0.1%。
1.5 RT-PCR 药物处理后的细胞采用 Trizol 试剂
提取总RNA。以4 μg RNA 为模板，加入到40 μL RT
反应体系中，具体操作参照说明书进行。RT 的反
应条件：42 ℃反转录 30 min，99 ℃5 min 灭活反
转录酶。合成的 cDNA 10 μL 用于 PCR 扩增，终体
系为 25 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 变性
30 s，60 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 18 个循
环；72 ℃ 8 min 后终止反应。取 10 μL PCR 产物
在 1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB 染色，紫外灯下观
察并扫描。
基因表达检测引物，序列如下，CYP3A1，
Sense： 5′-GATGTTGAAATCAATGGTGTGT-3′；
Antisense：5′-TTCAGAGGTATCTGTGTTTCC-3′。
GAPDH，Sense：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-
3′；Antisense：5′-CATGGACTGTGGTCATG AG-3′。
1.6 Western-blot 检测 将板孔中不同处理的细胞
样品用预冷 PBS 洗 2 次，加 1 mL PBS 用细胞刮刀
将板孔中细胞带胶原一并刮起并转入 1.5 mL EP 管
中置于冰上，用枪吹打重悬至胶原溶解和细胞释
放。4 ℃，1 500×g，4 min 离心去上清。细胞沉淀
用 PBS 洗 2 次后离心富集沉淀。加 200 μL 细胞裂
解液 (1 %NP 40，0.5 %脱氧胆酸钠，0.1 % SDS，
0.01 mol·L-1PBS，1×Cocktail)，4 ℃放置 30 min 后，
12 000×g 离心 15 min，弃沉淀，上清即为全细胞
裂解液。全细胞裂解液经 4 ℃，1万×g离心 20 min，
所得上清再经 4 ℃，10 万×g 超速离心 60 min 后
的沉淀即为富集的微粒体蛋白。蛋白定量采用
Bradford 方法，牛血清白蛋白作为蛋白定量标准。
上清与等体积 2×SDS 上样缓冲液（0.1 mmol·L-1
Tris-HCl，pH 6.8，20 %甘油，0.1 %溴酚蓝，10 %β-
巯基乙醇，4 % SDS）混合均匀，100 ℃沸水浴煮 3


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min。样品在 8 cm×10 cm 大小的 12% SDS-聚丙烯
酰胺凝胶中电泳(蛋白电泳的上样量 10 μg)，100 V
恒压电泳至溴酚蓝前缘移动到凝胶底部。电泳完成
后，经 30 V，3 h 将蛋白从胶上转印到 PVDF 膜上，
将 PVDF 膜浸于含 5%脱脂奶粉的 1×TTBS（10
mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.0，150 mmol·L-1 NaCl pH
7.7，0.05%山梨醇甲酯）即封闭液的平皿中，4℃
过夜以封闭非特异性结合位点，加适量以含 5%脱
脂奶粉的 1×TTBS 稀释的 1∶2 000 的一抗在于室
温下孵育 1 h。用 1×TTBS 洗膜 3 次，每次 15 min；
加适量含 5%脱脂奶粉的 1×TTBS 稀释的 1∶5 000
的二抗(HRP 标记的羊抗兔 IgG)，于室温孵育 1 h
后用 1×TTBS 洗膜 3 次，每次 15 min；再用 TBS
洗膜 1 次，10 min。按照 ECL 发光试剂盒说明书
进行显影。
2 结果
2.1 对大鼠肝脏 CYP3A mRNA 表达的影响 阳
性对照苯巴比妥处理组 CYP3A1，CYP3A2 mRNA
表达水平明显上升，这些结果与以往文献报道一
致[6]，表明用 RT-PCR 方法分析 P450 相关亚酶
mRNA 的变化水平是可靠的，同时甘草酸能明显升
高 CYP3A1 和 CYP3A2 mRNA 的表达水平（图 1）。
2.2 18β-甘草酸和 18α-甘草酸对大鼠原代肝细
胞 CYP3A mRNA 表达的影响 已有研究显示
甘草在整体水平上能够使小鼠 CYP3A 在 mRNA
及蛋白表达增加 [7]，这与笔者前期的研究结果吻
合 [8]，但在细胞水平上对 CYP3A 表达的影响及
这种诱导表达的分子机制尚不十分清楚，因此
接下来利用 18β-甘草酸和 18α-甘草酸处理大鼠
原代肝细胞，观察二者对 CYP3A mRNA 表达的
量效关系。首先采用不同浓度的 CYP3A1 诱导
剂 PCN 刺激处理原代肝细胞，24 h 后收获细胞
采用 RT-PCR 检测细胞 CYP3A1 mRNA 的表达
情况。在 PCN 的刺激下，CYP3A1 mRNA 表达
明显增加；并随 PCN 浓度的增加，CYP3A1
mRNA 诱导表达出现逐渐增加的趋势，呈浓度
依赖关系，表明用双层胶原培养的原代肝细胞
可很好的保留药物代谢酶的活力，在诱导剂的
作用下其基因表达上调，表明原代肝细胞是预
测药物或其他外源物调节 P450 酶活性的可靠模
型（图 2）。

A. CYP3A1； B. CYP3A2。
图 1 甘草酸对大鼠肝 CYP3A1，CYP3A2 mRNA
表达的影响


图 2 PCN 对大鼠原代肝细胞 CYP3A1 mRNA
表达的影响


A. 18β-甘草酸；B. 18α-甘草酸。
图 3 甘草中单体成分对大鼠原代肝细胞 CYP3A1
mRNA 表达的影响

2.3 18β-甘草酸和 18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞
CYP3A 蛋白表达的影响 18β-甘草酸仅在高剂量
400 μmol·L-1时使 CYP3A1 蛋白诱导表达增加。与
18β-甘草酸诱导效应不同，18α-甘草酸在 25~100
μmol·L -1 呈浓度依赖性的降低了 CYP3A1 蛋白水
平，这与 18α-甘草酸对 CYP3A mRNA 水平的抑制
效应结果一致（图 4）。
上述结果显示，18β-甘草酸是对 CYP3A1 蛋白
表达产生诱导效应的成分，笔者进一步检测了 18β-


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A. 18β-甘草酸；B. 18α-甘草酸。
图 4 甘草中单体成分对大鼠原代肝细胞 CYP3A1
蛋白表达的影响

甘草酸对 CYP3A 的另一种亚型 CYP3A2 蛋白表达
的影响。随着 18β-甘草酸浓度的增加 (50~400
μmol·L-1)，可浓度依赖性的诱导 CYP3A2 蛋白表达
的增加（图 5）。

图 5 18β-甘草酸对大鼠原代肝细胞
CYP3A2 蛋白表达的影响

3 讨论
药物代谢酶 CYP3A 在药物代谢中发挥重要作
用，并可能改变合并用药时其他药物在体内的代谢
而影响药物疗效，因此作者认为甘草可能通过诱导
CYP3A 酶活性而加速了方剂中其他配伍中药的有
效成分的代谢而起到调节诸药，甚至解毒的作用。
研究甘草对 CYP3A 在 mRNA，蛋白上的诱导作用，
可望在药物代谢层面揭示甘草调和诸药的配伍机
制，为中药配伍机制研究提供新思路。
在实验中作者之所以采用原代肝细胞而非肝
脏来源的细胞系做为工具来研究药物对 CYP3A 表
达的影响，原因在于一方面原代肝细胞在一定的体
外培养条件下仍保留许多体内细胞的功能和活性，
特别是其很好保持了药物代谢酶的活性[9]，使其成
为对药物、毒物进行药理学、药物代谢和毒理学研
究灵敏度较高的模型，同时结合本实验需对若干化
合物进行 CYP3A 诱导活性的筛选同时需考察剂量
效应的特点，使用原代肝细胞可较经济和迅速的阐
明药物对药物代谢酶的诱导或抑制，从而避免采用
大量动物进行药理效应筛选。采用胶原将鼠肝细胞
固定成三明治状培养，可以提供近似于体内状态的
基质环境，有利于维持肝细胞的形态和肝脏特异基
因的表达[10]。但购买包被好胶原基质如 Matrigel®
的培养板价格十分昂贵，结合本实验室的特点自制
了鼠尾胶原并用其包被培养板，从结果看培养体系
对外源物的刺激应答良好，是预测药物或其他外源
物调节 P450 酶表达的可靠模型。
本研究和以往文献[7]均显示在整体动物水平甘
草能够诱导 CYP3A 的表达，CYP3A 在细胞色素
P450 中占有重要地位，其占人体肝脏中 P450 总含
量的 30％[9]居第 1 位，临床有 50%～60%的药物要
通过此亚酶代谢而排出体外。CYP3A 可被一系列的
药物如利福平、地塞米松、卡巴咪嗪和苯巴比妥药
物所诱导[11]，这种对 CYP3A 酶的诱导效应使得
CYP3A 酶表达的量发生变化进而影响到用药的个
体差异，影响药物的生物利用度并产生药物相互作
用[12]。本实验对甘草中 18 位构型不同的 2 种差向
异构体即：18β-甘草酸和 18α-甘草酸对 CYP3A 表
达的影响进行了研究，结果显示 18β-甘草酸在细胞
水平上可诱导 CYP3A1 表达，同时浓度依赖性的诱
导了 CYP3A2 表达，表明 18β-甘草酸是甘草对
CYP3A 的诱导效应中的成分之一；同时也表明 18β-
甘草酸对 CYP3A 表达的上调作用是通过肝细胞自
身固有的细胞内机制实现的，对基因和蛋白诱导效
应的一致性表明这种诱导效应发生在转录水平。虽
然 18α-甘草酸与 18β-甘草酸分子式相同仅存在 18
位H的构相差异18β-甘草酸的 D/E-环为顺式构型，
18α-甘草酸的 D/E-环为反式构型，但二者对
CYP3A 表达的影响却截然相反，18α-甘草酸呈浓度
依赖性抑制 CYP3A1 表达，显示出二者对 CYP3A
表达差异与其结构间差异存在关联，这种构效关系
差异值得深入研究。由于 18β-甘草酸和甘草提取物
均对药物代谢酶 CYP3A 表达产生诱导作用，同时
18β-甘草酸在甘草中的含量较大，故提示 18β-甘草
酸为甘草诱导药物代谢酶 CYP3A 表达的成分之
一，由于甘草中含有很多成分，因此有必要对甘草
中的其他成分进行进一步研究。虽然 18α-甘草酸对
CYP3A 表达呈剂量依赖性抑制，但由于其在甘草
中含量很低，因此甘草自身并未表现出对 CYP3A
的抑制作用。同时 18α-甘草酸对 CYP3A 抑制作用


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及其相关药理机制和病理生理意义均有待进一步
研究。
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Effects of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid on mRNA and protein
expression of cytochrome P450 3A in cultured rat primary hepatocyte

WANG Yuguang1，YANG Minghui2，MA Zengchun1，LIANG Qiande1，TAN Hongling1，
XIAO Chengrong1，GAO Yue1*
(1. Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China;
2. Institute of Traditional Chinese Medicine，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China)

[Abstract] Objective：To study the effects of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid on mRNA and protein
expression of cytochrome P450 3A in cultured rat primary hepatocyte. Method：Rat heaptocyte were isolated by two-step in situ
collagenase perfusion method; the hepatocytes were seeded in dishes coated with type I rat tail collagen，culture medium was added
and changed daily after gelation，the effect of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid on the expression of CYP3A was
determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blot respectively. Result：Treatment with
18β-glycyrrhizic acid of primary rat hepatocytes resulted in marked up-regulationof CYP3A1expression at both mRNA and protein
levels in a concentration dependent manner，while exposure to 18α-glycyrrhizic acid of primary rat hepatocytes resulted in marked
down-regulation of CYP3A1expression at both mRNA and protein levels in a concentration dependent manmer. Conclusion：
18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid up-regulate and down-regulate CYP3A1 expression at the transcriptive levels.
[Key words] 18β-glycyrrhizic acid；18α-glycyrrhizic acid；CYP3A
[责任编辑 古云侠]