全 文 ：不同炮制工艺丹皮炭中黄酮类成分的动态变化
丁安伟，张　丽，赵学龙，李　娴
（南京中医药大学 江苏省方剂研究重点实验室，江苏 南京 ２１００４６）
［摘要］　目的：研究牡丹皮炮制过程中黄酮类成分的动态变化，探讨丹皮炭的炮制机制。方法：取生丹皮及经不同炒炭
工艺制得的丹皮炭，加乙醇５０ｍＬ超声３０ｍｉｎ２次，再经聚酰胺柱纯化后采用ＨＰＬＣ，在３６０ｎｍ波长处，流动相甲醇０５‰三
氟乙酸水溶液梯度条件下，测定槲皮素、山柰素、异鼠李素等黄酮类成分的含量。结果：丹皮炭中３种黄酮类成分含量随炒制
时间的延长而降低，随炒制温度的升高而降低。结论：不同炮制条件对丹皮炭中黄酮类成分的含量影响较大，总体变化趋势
是高温长时间导致黄酮类成分含量降低，为进一步研究丹皮炭的止血机制和质量控制提供了依据。
［关键词］　丹皮炭；炮制；黄酮；槲皮素；山柰素；异鼠李素；ＨＰＬＣ
［收稿日期］　２００８０９２７
［基金项目］　国家“十一五”科技支撑计划项目（２００６ＢＡＩ０９Ｂ０６０２）
［通信作者］　丁安伟，教授，博士生导师，研究方向为中药炮制与
复方研究，现任南京中医药大学药学院院长，Ｔｅｌ：（０２５）８５８１１５２３，Ｅ
ｍａｉｌ：ａｗｄｉｎｇ１０５＠１６３．ｃｏｍ
　　牡丹皮为毛茛科植物牡丹 Ｐａｅｏｎｉａｓｕｆｒｕｔｉｃｏｓａ
Ａｎｄｒ．的干燥根皮。具有清热凉血、活血化瘀作用，
用于温毒发斑，吐血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛
经，痈肿疮毒，跌扑伤痛［１］。炒炭后专攻止血，用以
治疗各种出血性疾病，使用历史悠久［２］。目前对丹
皮的研究主要集中在生品［３５］，对炭品的炮制工艺及
炮制机制都没有深入的研究。有研究表明，槲皮素
具有一定的止血作用［６］，因此本研究对不同炮制工
艺所得牡丹炭中槲皮素、山柰素、异鼠李素的动态变
化进行了研究，以期为揭示丹皮炭炮制机制及丹皮
炭饮片的质量标准研究提供依据。
１　仪器与试药
１．１　仪器　Ｗａｔｅｒｓ５１５高效液相色谱仪（配 ｗａｔｅｒｓ
２９９６全波长紫外检测器，ｗａｔｅｒｓ７１７ｐｌｕｓ自动进样
器，Ｅｍｐｏｗｅｒ工作站）；ＹＸＪⅡ高速离心机（江苏金
坛市金城国胜实验仪器厂）；ＦＡ１１０４Ｎ电子天平
（１／万，上海精密科学仪器有限公司）；ＢＰ２１１Ｄ电子
天平（１／１０万，德国赛多利斯）；ＡＺ８８６８红外线温
度测量仪（上海壹琦仪器仪表有限公司）；高速万能
粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
１．２　试药　实验用生牡丹皮为安徽铜陵产，经南京
中医药大学吴启南教授鉴定为毛茛科植物牡丹皮
Ｐｓｕｆｒｕｔｉｃｏｓａ，丹皮炭为实验室自制。槲皮素、山柰
素、异鼠李素（中国药品生物制品检定所，批号分别
为 ０００８１２００４０６，１１０８６１２００３０３，１１０８６０２００４０６），
甲醇和三氟乙酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均
为分析纯。
２　方法
２．１　样品制备　称取生丹皮适量，共１２份，分别经
过２２０，２５０，２８０，３２０℃炒制１０，２０，３０ｍｉｎ，得不同
炒制程度的丹皮炭品，粉碎，过６０目筛，即得。生品
粉碎过６０目筛，即得。各丹皮炭样品性状见表１。
２．２　色谱条件　ＰｌａｔｉｓｉｌＯＤＳ（４６ｍｍ×１５０ｍｍ，５
μｍ），流动相为甲醇０５‰三氟乙酸水溶液，采用梯
度洗脱，其梯度流程见表２，柱温３０℃，流速为１ｍＬ
·ｍｉｎ－１，检测波长３６０ｎｍ，理论塔板数以槲皮素峰
计不得少于３０００。色谱图见图１。
２．３　供试品溶液制备　取供试品粉末约５ｇ，精密
称定，置１００ｍＬ具塞锥形瓶中，加乙醇５０ｍＬ，超声
（５００Ｗ，４０ｋＨｚ）提取３０ｍｉｎ，滤过，滤渣连同滤纸
依法提取第２次，滤过，合并２次滤液，蒸干，残渣趁
热加３０％乙醇３０ｍＬ溶解，放冷，通过聚酰胺柱（内
径１ｃｍ，长１５ｃｍ，聚酰胺湿体积１２ｍＬ），以水１００
ｍＬ洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇１００ｍＬ洗脱，收集
洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至５ｍＬ量瓶中，加
甲醇至刻度，摇匀，即得。
２．４　对照品溶液制备　分别精密称取槲皮素、山柰
素与异鼠李素对照品适量，置３个棕色量瓶中，加甲
醇溶解并稀释制成每１ｍＬ含槲皮素０１００６ｍｇ、山
柰素０１０００ｍｇ、异鼠李素０１０５０ｍｇ的各对照品
储备液，即得。分别精密量取上述槲皮素对照品储
　　
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表１　不同炮制程度丹皮炭性状
Ｎｏ． 温度／℃ 时间／ｍｉｎ 性状
Ａ１ ２２０ １０ 不规则片状，外部浅黄色，内部浅黄色
Ａ２ 　 ２０ 不规则片状，外部黄色，内部浅黄色
Ａ３ 　 ３０ 不规则片状，外部深黄色，内部浅黄色
Ｂ１ ２５０ １０ 不规则片状，外部深黄色，内部浅黄色
Ｂ２ 　 ２０ 不规则片状，外部深黄色，内部浅黄色
Ｂ３ 　 ３０ 不规则片状，外部黄褐色，内部深黄色
Ｃ１ ２８０ １０ 不规则片状，外部黑褐色，内部深黄色
Ｃ２ 　 ２０ 不规则片状，外部黑褐色，内部黄褐色
Ｃ３ 　 ３０ 不规则片状，少量炭化成粉末，外部黑褐色，内部黄褐色
Ｄ１ ３２０ １０ 不规则片状，外部焦黑色，内部黑褐色，少量炭化
Ｄ２ 　 ２０ 不规则片状，外部焦黑色，内部黑褐色，少量炭化
Ｄ３ 　 ３０ 不规则片状，外部焦黑色，内部焦黑色，炭化较多
表２　流动相梯度洗脱
时间／ｍｉｎ 甲醇／％ 水／％
００ ４５０ ５５０
２５０ ４５０ ５５０
３００ ５５０ ４５０
４５０ ５５０ ４５０
４７０ ４５０ ５５０
５００ ４５０ ５５０
备液４ｍＬ，山柰素对照品储备液２ｍＬ，异鼠李素对
照品储备液２ｍＬ，置１０ｍＬ量瓶中，加甲醇至刻度，
即得１号混合对照品溶液。
２．５　线性关系考察　精密量取１号混合对照品溶液
５ｍＬ，置１０ｍＬ量瓶中，得每１ｍＬ含槲皮素００２０１２
ｍｇ、山柰素００１０００ｍｇ、异鼠李素００１０５０ｍｇ的２
号混合对照品溶液，再采用逐级稀释法，得到质量浓
Ａ．对照品；Ｂ．生丹皮；Ｃ．丹皮炭；１．槲皮素；２．山奈素；３．异鼠李素。
图１　丹皮不同炮制品中槲皮素、山奈素、异鼠李素ＨＰＬＣ图
度分别为１号混合对照品溶液１／４，１／８，１／１６的系
列混合对照品溶液，即 ３，４，５号混合对照品溶液。
分别精密吸取上述５份溶液各１０μＬ，注入高效液
相色谱仪（ｎ＝２）。以各对照品质量浓度 Ｘ（ｇ·
Ｌ－１）为横坐标，平均峰面积 Ｙ为纵坐标，绘制标准
曲线，得各成分回归方程为槲皮素 Ｙ＝４１３８３３２２
Ｘ－３８７０７０８（ｒ＝０９９９５）；山柰素 Ｙ＝４４３８３１７４
Ｘ－１９１６５６（ｒ＝０９９９５）； 异 鼠 李 素 Ｙ ＝
３５８４５０７１Ｘ－１７９４４５（ｒ＝０９９９５）。结果表明槲
皮素、山柰素、异鼠李素 ３种成分的进样量分别在
００２５～０４，００１２５～０２，００１２５～０２μｇ呈良好
的线性关系。
２．６　精密度试验　在上述色谱条件下，以２号混合
对照品溶液为考察对象，依法测定，连续进样６针，
得槲皮素、山柰素与异鼠李素 ３种成分峰面积的
ＲＳＤ分别为１４％，１４％，１３％，表明本法精密度
良好。
２．７　重复性试验　取生牡丹皮供试品依法处理６
份，依法测定，重复性试验结果表明供试品中槲皮素
的平均含量００２５６４ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ１７％、山柰素
的平均含量０００８２３０ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ１８％与异鼠
李素的平均含量 ０００７７００ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ２５％。
结果表明该方法的重复性良好。
２．８　稳定性试验　取生牡丹皮的同１份供试品溶
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液，在１０ｈ内每隔２ｈ测定１次，共测定６次，得槲
皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的 ＲＳＤ分别为
２０％，２４％，２１％。结果表明该方法在１０ｈ内的
稳定性良好。
２．９　加样回收率试验　取生牡丹皮粉末６份，每份
约２５ｇ，精密称定，分别加入槲皮素对照品储备液
０６ｍＬ、山柰素对照品储备液０２ｍＬ和异鼠李素对
照品储备液０１８ｍＬ。依法测定，得槲皮素平均回
收率 ９３６０％，ＲＳＤ２０％，山柰素平均回收率
９７８％，ＲＳＤ１７％，异鼠李素平均回收率９９７４％，
ＲＳＤ２０％。表明该测定方法测定结果准确，见
表３～５。
表３　槲皮素加样回收率
称样量
／ｇ
样品含量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
２５０１ ００６５０３ ０１２０８ ９３０４
２５０３ ００６５０８ ０１２２７ ９６１１ 　 　
２５０３ ００６５０８ ０１１９４ ９０４７ ９３６０ ２０
２５０５ ００６５１３ ０１２２０ ９４７７ 　 　
２５０４ ００６５１１ ０１２０８ ９２８２ 　 　
２５０５ ００６５１３ ０１２２４ ９５３９ 　 　
　　注：加入量均为００６０３６ｍｇ。
表４　山柰素加样回收率
称样量
／ｇ
样品含量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
２５０１ ００２０５７ ００３９９９ ９７１０
２５０３ ００２０５９ ００４０１８ ９７９６ 　 　
２５０３ ００２０５９ ００３９６８ ９５４２ ９７８３ １７
２５０５ ００２０６０ ００４０７７ １００８０ 　 　
２５０４ ００２０６０ ００４０００ ９６９８ 　 　
２５０５ ００２０６０ ００４０２４ ９８１９ 　 　
　　注：加入量均为００２０６ｍｇ（表５同）。
表５　异鼠李素加样回收率
称样量
／ｇ
样品含量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
２５０１ ００１９２６ ００３７１５ ９９４０
２５０３ ００１９２７ ００３７５９ １０１８０ 　 　
２５０３ ００１９２８ ００３６５４ ９５９３ ９９７４ ２０
２５０５ ００１９２９ ００３７６２ １０１９０ 　 　
２５０４ ００１９２８ ００３７００ ９８４４ 　 　
２５０５ ００１９２９ ００３７２０ ９９５０ 　 　
２．１０　样品含量测定　按２．３项下供试品溶液的制
备，分别对丹皮生品与各炭品进行测定，见表６。
表６　供试品中３种黄酮类成分（ｎ＝２）
ｍｇ·ｇ－１　
样品 槲皮素 山柰素 异鼠李素
生品 ００２５６４ ０００８２２６ ０００７６９０
Ａ１（２２０℃，１０ｍｉｎ） ００１４４１ ０００５３９２ ０００４２９７
Ａ２（２２０℃，２０ｍｉｎ） ００１１４１ ０００４３０４ ０００３５４１
Ａ３（２２０℃，３０ｍｉｎ） ００１１５０ ０００４１６６ ０００３５９４
Ｂ１（２５０℃，１０ｍｉｎ） ００１６５５ ０００５９６２ ０００４５４５
Ｂ２（２５０℃，２０ｍｉｎ） ０００７３７３ ０００２７１７ ０００２３４３
Ｂ３（２５０℃，３０ｍｉｎ） ０００６７１５ ０００２５９８ ０００２２２８
Ｃ１（２８０℃，１０ｍｉｎ） ０００８２６５ ０００３２０４ ０００２５０９
Ｃ２（２８０℃，２０ｍｉｎ） ０００２９５９ ０００１３３７ ０００１０５１
Ｃ３（２８０℃，３０ｍｉｎ） ０００２９７７ ０００１１３７ ００００９１５０
Ｄ１（３２０℃，１０ｍｉｎ） ０００２２８７ ００００９９４０ ００００８３８０
Ｄ２（３２０℃，２０ｍｉｎ） ０００３７４２ ０００１４６８０ ０００１３５８
Ｄ３（３２０℃，３０ｍｉｎ） ０００２６８９ ０００１１２８ ００００８０８０
３　讨论
本实验结果表明，丹皮各炮制品饮片中槲皮素、
山柰素与异鼠李素的含量随炒制程度的变化而变
化，总体而言，随着炮制温度的升高含量随之降低，
同一温度下随着炒制时间的增加其含量均随之降
低。文献表明槲皮素是侧柏炭止血的指标性成
分［７］，但由本实验结果可知，生丹皮中槲皮素等黄
酮类成分含量较丹皮炭中的稍高，初步推测可能在
丹皮炒炭过程中槲皮素等黄酮类成分有所损失。因
此槲皮素等黄酮类成分是否是丹皮炭止血的指标性
成分，其炒炭前后含量的变化是否有助于丹皮炭炮
制机制的揭示还有待进一步深入研究。
经过紫外扫描得知槲皮素、山柰素与异鼠李素
在３６０ｎｍ有最大吸收，故检测波长选择为３６０ｎｍ。
前期的实验结果表明，超声、回流、索氏３种提
取方式均可将槲皮素等黄酮类成分提取完全，考虑
到超声提取操作简便，因此提取方式选择超声提取。
对超声提取次数的考察结果表明，超声提取２次已
可将槲皮素等黄酮类成分基本提取完全，因此提取
次数选择２次。对每次提取时间的比较结果表明，
每次提取３０ｍｉｎ即可将槲皮素等黄酮类成分提取。
完全。对提取溶剂的比较结果表明，甲醇和乙醇提
取效率相当，故选择低毒价廉的乙醇。
对供试品溶液是否经聚酰胺柱纯化的考察结果
表明，因丹皮炭中成分复杂，且槲皮素等黄酮类成分
含量较低，若不经聚酰胺柱纯化则干扰过大，因此供
试品溶液制备采用聚酰胺柱纯化的方法。对聚酰胺
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柱纯化条件进行了考察，供试品分别经湿体积为６，
８，１０，１２，１５ｍＬ的聚酰胺柱纯化，结果表明当聚酰
胺湿体积为１２ｍＬ时，３个待测成分含量最高。因
此聚酰胺装柱湿体积选定为１２ｍＬ。对水洗脱的考
察结果表明，以１００ｍＬ水为初洗脱液即可将杂质基
本洗脱完全且不影响槲皮素等黄酮类成分的含量，
故水洗脱量选定为１００ｍＬ。对甲醇洗脱量的考察
结果表明，样品经甲醇１００ｍＬ洗脱，３种待测成分
已基本洗脱完全，故甲醇洗脱量确定为１００ｍＬ。
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［７］　孙立立，杨书斌，江　波，等．炮制对侧柏叶化学成分的影响
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Ｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ＇ｃｏｎｔｅｎｔｉｎｖａｒｉｏｕｓｅｘｔｅｎｔｏｆｃｏｒｔｅｘ
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