全 文 ：白香丹胶囊对 E98肝气逆证模型大鼠海马 F3G3
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!
*
亚基蛋白分布模式及表达水平的影响
陈志恒! 孙世光!*! 张惠云!
,山东中医药大学 中医药经典理论教育部重点实验室! 山东 济南 *$)%
*,山东中医药大学 第二附属医院 药剂科! 山东 济南 *$$$#
$摘要%!目的&探讨中药复方白香丹胶囊!GKI对经前期综合征!ACM/M1O@CTBSO51QC./M$E98肝气逆证模型大鼠海马中
7
4氨基丁酸3受体!F3G3
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*
亚基蛋白分布模式及表达水平的影响) 方法&阴道涂片镜检法和旷场实验筛选合适大鼠$随
机分为正常组&肝逆组和肝逆给药组!GKI给药剂量 $ D.ZDe.Q e$给药 Q*电刺激法复制E98肝气逆证模型$同时采用
宏观行为学观察和旷场实验来评价模型*免疫荧光技术和蛋白印迹技术!XMO@MC1 GS.@测定大鼠海马神经元中 F3G3
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亚
基蛋白分布模式及表达水平) 结果&与正常组相比$肝逆组大鼠旷场实验得分明显增加$海马神经元 F3G3
3
>较集中分布于
组织边缘$
!
*
亚基蛋白表达水平显著升高!>o$g$*而造模同时给予 GKI后$大鼠旷场实验得分明显减少$海马神经元
F3G3
3
>分布模式无明显变化$而
!
*
亚基蛋白表达水平显著降低!>o$g$) 结论&大鼠海马神经元F3G3
3
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*
亚基蛋白表
达水平上调可能是与E98肝气逆证密切相关的重要微观机制之一*中药复方GKI可对F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白表达水平变化起
到纠正作用)
$关键词%!经前期综合征*肝气逆证*电刺激*白香丹胶囊*免疫荧光技术*XMO@MC1 \S.@*

4氨基丁酸
$稿件编号%!*$$$$&$$*
$基金 项 目 % ! 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 ! 7%) 项 目
!*$$#$通信作者%!!张惠云$教授$博士生导师$主要研究方向为情志病
症动物模型与调肝方药药理$RMS#!$)(7#*(7#$U4/BNS#W??TN5T1
2*#,-./
!!经前期综合征!E98是指经常发生在经前$影
响妇女日常生活和工作$涉及身体&精神和行为方面
的症候群) 其中$肝气逆证是E98 的主证之一+4*, )
国外研究表明$E98 症状的发生与中枢神经系统 4
YR$F3G3和孕酮代谢有关*F3G3是哺乳动物中枢
神经系统!<;8重要的抑制性神经递质$其通过特
异性结合F3G3
3
>来控制神经元兴奋性*而F3G3
3
>
!
*
亚型在整个大脑中表达很高$且在海马内含量
丰富+), )
经前平颗粒是作者所在团队根据全国名老中医
张珍玉多年临床经验研发的国内第一个上市的&治
疗E98 肝气逆证的中药复方新药*白香丹胶囊
!GKI是由经前平颗粒精简而成$主要由白芍&香
附和丹皮 ) 味中药之主要药效成分芍药苷&香附挥
发油和丹皮酚组成$其有效组分清楚$处方配伍简
练$临床研究表明对治疗 E98 具有良好的疗效$但
其作用机制尚未完全明确+&, ) 因此本研究采用免
疫荧光技术和XMO@MC1 \S.@检测E98 肝气逆证模型
大鼠F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白分布模式及表达水平的
变化$研究 E98 肝气逆证发病的中枢机制$初步探
讨中药复方GKI预防治疗E98肝气逆证与F3G3
3
>相关的中枢作用机制)
!材料
U!动物!雌性健康未孕 8I大鼠$) k& 日龄$
体重 ($ k*$$ D$8EH级$山东中医药大学实验动物
中心提供$许可证号 8U!药品与试剂!GKI!实验室自制$临床批号
$&$*$*羊抗鼠F3G3
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!847$
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4B-@N1 多克隆
抗体!美国 8B1@B:DF抗体&辣根过氧化酶标记山羊抗兔:DF!Yl` &
辣根过氧化酶标记兔抗山羊 :DF!Yl` &正常山羊
血清&I3G显色增强剂!北京中山生物技术有限公
司*石蜡!上海华永石蜡有限公司)
U&!仪器!8R43型数字脉冲生物刺激仪!山东中
医药大学与济南军区空军司令通信修配厂联合研
制*9N1NEC.@MB1 ::电泳仪 !美国伯乐公司*
R台式高速冷冻离心机!上海生美生化仪器
设备工程有限公司*荧光显微镜!上海宙山光学仪
.*&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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VT1M$ *$$
器厂*>9*$ 转轮式切片机! U`:<3)
!方法
U!动物筛选!大鼠饲养于昼夜颠倒环境$每日于
*#$$ 开灯$7#$$ 关灯$试验前预适应环境 周) 采
用旷场实验筛选得分相近大鼠进入实验*采用阴道
涂片镜检法+,确定正常未孕大鼠的动情期$同时大
鼠动情周期评定辅助采用宏观行为药理学观察方
法$即将雌鼠引入雄鼠笼中$观察大鼠动情行为!跳
跃$奔走$摇耳$弓背$雄鼠击打雌鼠背部确定大鼠
动情周期$同时阻止雄鼠爬跨雌鼠) 大鼠动情前期=
动情期!也即动情周期接受期动情行为活跃$而动
情间期=动情后期!也即动情周期非接受期动情行
为减退或消失$中间间隔约 * Q 左右) 最后选取旷
场得分相近&动情行为规则出现且活跃&处于动情周
期非接受期的大鼠纳入本试验)
U!造模给药!根据筛选结果$选取合适大鼠 #$
只$分为 ) 组$每组 *$ 只!$ 只用于免疫荧光技术
实验$$ 只用于XMO@MC1 \S.@$分别为正常组&模型
组&给药组)
$
正常组#不给予任何刺激$放入鼠笼
内$每天给予相同剂量的无菌饮用水)
%
模型组#采
用 8R43数字脉冲生物刺激仪!底部及四周均有电
栅$以刺激足部及躯体制备肝气逆证大鼠模型$刺
激条件#电压 * %$$ k) )$$ [$电流 $g /3$脉宽
$g) O$间隔时间白天 /N1&夜间 $ /N1$刺激时间
Q*造模同时给予与正常组相同剂量的无菌饮用水)
&
给药组#按
%
造模$同时给予GKI$给药剂量为 $
D.ZD
e
.Q
e
$给药时间为 Q) 造模完成后即进行
宏观行为学观察以及旷场实验进行模型评价)
U&!旷场实验+#,!旷场实验箱 $$ -/m$$ -/m
$ -/$周壁底面为黑色$底面用白线划分为面积相
等的 * 块$沿墙格称外周格$其余为中央格) 操作
者握住大鼠尾根部 =) 处$小心放入旷场正中格$用
摄像系统记录动物 ) /N1 的行为变化$
$
水平得分#
动物穿越底面方块数为水平活动得分!四爪均进入
的方格方可记数$为水平运动得分*
%
垂直得分#
直立次数为垂直活动得分!两前爪腾空或攀附墙
壁$为垂直运动得分*旷场实验总分 f
$
l
%
) 试
验前动物筛选和造模后模型评价各进行 次测定)
U_!免疫荧光技术测定 F3G3
3
>分布模式!常规
方法制备大鼠海马石蜡切片*二甲苯脱蜡$不同浓度
乙醇!($jk$$j脱脂$柠檬酸盐缓冲液热修复$自
然冷却后用 $g$ /.S.`eEG8 清洗*滴加正常山羊
血清室温封闭 )$ /N1*去血清$直接加一抗!i$&$

$`湿盒中 & h过夜*$g$ /.S.`eEG8清洗*避光加
入H:R<标记的二抗!i$$&$

$`)% h温浴 )$ /N1*
$g$ /.S.`
e
EG8清洗并浸泡* ?左右*滴加缓冲甘油
少许!约 *$

`封片) 阴性对照用 &$

的` $g$ /.S
.`
e
EG8代替一抗$其他实验步骤相同) 荧光共聚焦
显微镜检测$激发波长 &(( 1/$发射波长 )$ 1/)
U$!XMO@MC1 \S.@测定F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白表达水
平!大鼠迅速断头$剥离海马$蛋白提取液冰上研磨
匀浆$低温高速离心 !& h$ * $$$ C./N1e$
/N1$上清沸水变性 /N1$考马斯亮蓝法进行蛋白
测定) 取预染蛋白9BCZMC

`和 &$

D蛋白上样
电泳!$j 8I84E3FU凝胶$电压 $$ [) 转印至
E[IH膜!$$ [$g ?$)j脱脂奶粉室温封闭 ?$
加一抗!i*$$室温孵育 * ?$二抗!i* $$$室温
孵育 ?$I3G显色$将印迹膜用凝胶图象处理系统
拍照并分析目标带相对净吸光度值)
U)!统计分析!利用 838 (g 统计软件进行单因
素方差分析$实验数据采用
#
?p&表示$>o$g$ 为
有显著性差异)
&!结果
&U!大鼠行为学观察!与正常组比较$模型组大鼠
活动量大$对外界刺激敏感$用电笔较易激惹$易出
现怒目而视&毛竖立&相互追逐或撕咬等现象*而给
予GKI预防治疗后大鼠变化不明显)
&U!大鼠旷场实验得分比较!旷场实验水平得分
反映动物的兴奋性$垂直得分反映动物对环境的适
应程度$旷场实验总分是动物探索行为及兴奋性的
总体反映) 结果表明$较正常组大鼠$造模后大鼠水
平得分&垂直得分及旷场总分均显著性增加!>o
$g$$说明模型大鼠活动兴奋性及认知能力均有
显著性升高$结合宏观行为学观察初步判定模型制
备成功*较模型组大鼠$造模同时给予 GKI预防治
疗后$大鼠水平得分&垂直得分及旷场总分均显著性
减少!>o$g$$说明GKI对E98肝气逆证模型大
鼠有明显预防治疗作用$从侧面初步反映中药复方
GKI具有抗焦虑样作用$见图 )
&U&!免疫荧光技术检测大鼠海马 F3G3
3
>分布模
式!正常组大鼠海马 F3G3
3
>分布较弥散*而模型
组大鼠海马F3G3
3
>分布较集中$主要分布在脑组
织的边缘*给予GKI预防治疗后大鼠海马F3G3
3
>
分布模式未见明显变化)
.)&.
第 ) 卷第 期
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与正常组比较>o$g$$*>o$g$*
与模型组比较)>o$g$$&>o$g$!图 * 同
图 !各组大鼠旷场实验得分
&U_!XMO@MC1 \S.@测定大鼠海马 F3G3
3
>
!
*
亚基
蛋白表达量!与正常组相比$模型组大鼠海马
F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白表达水平显著性升高 !>o
$g$*与模型组相比$造模同时给予GKI预防治疗
后$大鼠海马F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白表达水平显著降
低!>o$g$$见图 *)
Bg正常组*\g模型组*-g给药组)
图 *!XMO@MC1 \S.@测定各组大鼠海马
F3G3
3
>
!
* 蛋白表达
_!讨论
中医药理论认为$情志病的发病与治疗$与中医
肝藏象理论密切相关#肝主疏泄$调畅情志$具有调
节情绪反应&保持心情舒畅的作用) 乔明琦等对不
同职业女性人群 E98 临床症状进行了流行病学调
查$发现E98以肝气逆&肝气郁为主要证型$肝失疏
泄是其主要病机改变$情志刺激则是其主要致病因
素$而/多情交织共同致病首先伤肝0是情志致病的
主要方式+*$&, )
现代研究表明$E98 病理生理改变与甾体类性
激素周期性改变及 <;8 神经递质!4YR$F3G3传
递有关*而国际公认的治疗 E98 的 * 个主要靶点#
一是作用于下丘脑4垂体4卵巢这一性腺轴*二是作
用于大脑神经递质传递+), ) 4YR递质系统与焦虑
情绪关系最为密切$是情绪研究尤其是抑郁症研究
中的热点*F3G3是成熟哺乳动物 <;8 最重要的抑
制性神经递质$在神经元兴奋性调节中具有重要的
作用$其所介导的突触传导的增强是各种神经精神
疾病药物疗法的基础$并已发现它涉及大量各异的
神经和精神紊乱$包括焦虑&癫痫&昏迷和认知损伤
等) 孕酮体内代谢产物四氢孕酮是 F3G3
3
>激动
剂$可与F3G3
3
>4苯二氮卓类受体!GI_>4氯离子
通道复合物相互作用而表现出抗焦虑样的生物效
应*而其对负性情绪的影响是呈双向的$即大剂量具
有抗焦虑&抗攻击行为&镇静麻醉和抗癫痫作用$而
小剂量则出现情绪逆反反应$包括抑郁情绪&易激
惹&攻击性和其他E98典型症状+%, )
GKI主要由白芍&香附和丹皮 ) 味中药之主要
药效成分芍药苷&香附挥发油和丹皮酚组成) 现代
研究发现芍药苷可促进皮层神经元生长$其主要代
谢产物
#
具有抗惊厥作用+(47, *香附挥发油具有雌激
素样作用$其中的异莪术醇具有GI_>激动剂作用*
宏观行为学评价表明丹皮酚具有抗焦虑样作
用+$4, )
本实验采用电刺激造模方法复制 E98 肝气逆
证动物模型$旷场实验结果并结合宏观行为学观察
初步判定模型制备是成功的$且GKI具有抗焦虑样
作用*免疫荧光技术检测表明肝逆组大鼠海马
F3G3
3
>分布模式相对集中$而GKI对此未见明显
影响*XMO@MC1 \S.@测定表明肝逆组大鼠海马F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白表达水平显著性升高$而 GKI预防治
疗后蛋白表达水平则显著性降低$提示E98 肝气逆
证发病与 F3G3
3
>密切相关$而 GKI预防治疗
E98与调节大鼠海马 F3G3
3
>
!
*
亚基蛋白表达水
平密切相关$这也与文献报道的GKI各组成成分药
理活性相一致)
$参考文献%
+ ,! M`.1 8AMC.P$>.\MC@YFSBOO$;B@?B1 FJBOM,临床妇科内分泌
学与不孕+9,,李继俊译,济南#山东科学技术出版社$*$$)#
&#,
+ * ,!乔明琦$张珍玉$徐旭杰$等,经前期综合征证候分布规律的流
行病学调查研究+V,,中国中医基础医学杂志$77%$)!)#),
+ ) ,!a.1ZMCOJ3$LcGCNM1 E98$UCNZOO.1 U,ECM/M1O@CTBSO51QC./M
+V,,`B1-M@$*$$($)%!7#7#*$$,
+ & ,!孙世光,白香丹胶囊治疗经前期综合征肝气逆证模型大鼠的
药理机制研究%%%含药血清对原代培养皮层神经元细胞相
对活力及F3G3
3
>介导氯离子通道的影响+I,,济南#山东
中医药大学$*$$7,
.&&.
第 ) 卷第 期
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!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
+ ,!施新猷,实验动物方法学+9,,北京#人民卫生出版社$7()#
&,
+ # ,!孙世光$张惠云,经前舒颗粒对 E98 肝气郁证大鼠额叶皮层
和海马 4YR3受体结合活性的影响+V,,中国中药杂志$
*$$7$)&!##),
+ % ,!E98?BTD?1 LcGCNM1$ 31QCMBV>BAZN1$ EM@MCV8-?/NQ@,R?M
ACM/M1O@CTBSO51QC./MO#E98 B1Q E9II+9,,` .1Q.1#:1P.C/B
YMBS@?-BCM$*$$%#77,
+ ( ,!LSB3?/MQ YU:J3` $ RMCTBZN3J3L$ 8?TN-?NR3JUI3$ M@BS,
E?BC/B-.ZN1M@N-O@TQ5.P.BM.1N/M@B\.SN1 :$B/B0.C/M@B\.SN@M.P
ABM.1NPS.CN1 PC./ ABM.15C..@O+V,,GN.SE?BC1 GTS$77%$*$
!#%,
+ 7 ,!3\QMS4YBPMW33$ ;BZB/TCB;$ YB@.CN9$ M@BS,31@N-.1dTS4
OB1@B-@NdN@5.PABM.1N/M@B\.SN14:BQQT-@O.\@BN1MQ \5N1-T\B@N.1
.PABM.1NPS.CN1 B1Q @?N.S-./A.T1QO+N@? SB-@.\B-NSTO\CMdNO+V,,
GN.SE?BC/GTS$ 777$**!#&7,
+$,!黄险峰$彭国平,香附的化学成分及药理研究进展+V,,中药
材$*$$)$*#!##,
+,!温东婷$张蕊$陈世忠,香附化学成分的分离及对未孕大鼠离
体子宫肌收缩的影响+V,,北京大学学报#医学版$*$$)$)
!#$,
+*,!RBZBBZNaBOTQB$ >N1Z.J.1$ RBZB?NC.;BZBWB+B$ M@BS,9M@B\.4
SNO/.PABM.1.SN1 CB@O+V,,V;B@EC.Q$777$#*!(#&*,
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DC.TA +N@? SNdMC4bNN1dBON.1 B1Q E98 GKI4BQ/N1NO@CB@N.1 DC.TA +N@? SNdMC4bNN1dBON.1 !GKI+BOBQ/N1NO@MCMQ +N@? .CBSQ.OBDM.P$ D
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PST.CMO-M1-M/N-C.O-.A5B1Q +MO@MC1 \S.@CMOAM-@NdMS5,8?IG/B# <./ABCMQ +N@? @?M1.C/BSDC.TA$ @?M.AM1 PNMSQ O-.CMOB1Q F3G3
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M6ACMOON.1 .PE98 /.QMSCB@O+N@? SNdMC4bNN1dBON.1 +MCMN1-CMBOMQ OND1NPN-B1@S5$ B1Q @?MQNO@CN\T@N.1 .PF3G3
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CM-MA@.CNO/.CM-.14
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M6ACMOON.1 .PE98 GKI4BQ/N1NO@CB@N.1 DC.TA +N@? SNdMC4bNN1dBON.1 +MCMQM-CMBOMQ
/BCZMQS5,<./ABCMQ +N@? @?ME98 /.QMSDC.TA @?MS.-B@N.1 ?BQ 1.OND1NPN-B1@-?B1DM,0@AR/GI.@A# L1M.P/N-C.4/M-?B1NO/O.PE98
/.QMSCB@O+N@? SNdMC4bNN1dBON.1 /B5\MCMSB@MQ +N@? @?M?ND? M6ACMOON.1 .PF3G3
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OT\T1N@N1 ?NAA.-B/ATO$ B1Q @?M1MOM/MQN-N1BSP.C/TSB$ GKIDCB1TSM$ ?BQ B1 BQ0TO@.1 @?MB\.dMB\1.C/BS-?B1DMO,
+ ?^D Z@EFI,!ACM/M1O@CTBSO51QC./M* SNdMC4bNN1dBON.1* MSM-@CN-O@N/TSB@N1D* GBN6NB1DQB1 -BAOTSM* PST.CMO-M1-M/N-C.O-.A5*
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$责任编辑!张宁宁%
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第 ) 卷第 期
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