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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
金思维提取物对 APPV717I 转基因小鼠早期
学习记忆和突触结构与功能的影响
张雷明 1,3，田金洲 1∗，尹军祥 1，时 晶 1，王蓬文 1，王 蓉 2，
胡 泉 1，赵志炜 2，姬志娟 2，任 映 1
(1. 北京中医药大学 东直门医院，北京 100700；
2. 首都医科大学 宣武医院，北京 100053；
3. 烟台大学 药学院，山东 烟台 264005)
[摘要] 目的：研究金思维提取物(GEPT)对 APPV717I 转基因小鼠痴呆早期学习记忆的影响，并进一步探讨其可能的机
制。方法：将 3 月龄的 APPV717I 转基因小鼠随机分为模型组、多奈哌齐治疗组(0.92 mg·kg-1·d-1)、GEPT 低、中、高(0.075 ，
0.15 ，0.3 g·kg-1·d-1)剂量组，并以同月龄遗传背景相同的 C57BL/6J 小鼠作为正常组，每组 6 只，每天灌胃给药 1 次。给药
4 个月后（7 月龄）用 Morris 水迷宫进行行为学测试，用免疫组化方法测定海马 CA1 区突触相关蛋白 Shank1 的表达变化，
同时用透射电镜观察海马 CA1 区突触的超微结构变化。结果：行为学检测，GEPT 治疗组与模型组相比定位航行实验和空
间探索实验均有显著差异（P<0.05）。突触相关蛋白 Shank1，模型组小鼠大脑海马 CA1 区中 Shank1 阳性细胞总面积以及阳
性细胞积分吸光度与正常组相比明显减少，而 GEPT 治疗组与模型组相比能显著提高 Shank1 阳性细胞总面积以及阳性细胞
积分吸光度（P<0.05）。电镜结果显示，模型组小鼠可见突触数量减少，突触间隙增宽，突触界面曲率下降，突触后致密区
厚度减小，GEPT 治疗组能剂量依赖性的对突触损害起到修复作用。结论：GEPT 能通过修复突触损伤以及提高 Shank1 蛋白
的表达进而改善 APPV717I 转基因小鼠痴呆早期的学习记忆能力。
[关键词] 金思维提取物；APPV717I 转基因小鼠；Morris 水迷宫；Shank1；突触

阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知功
能障碍和记忆力损害为主的神经变性病。β 淀粉样
蛋白（β-amyloid protein，Aβ）是其病理改变的重要
起始因素。Aβ 在神经元周围沉积形成老年斑（SP），
进而促发炎症级联反应、神经元纤维缠结（NFT）、
轴突损伤和突触丢失，最终导致神经元凋亡和痴
呆[1]。
然而最近的研究表明，在AD早期，淀粉样斑
块出现以前就已经存在突触的损伤以及学习记忆
障碍，而这种损害可能与Aβ寡聚体（Aβ-derived

[收稿日期] 2008-06-12
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30672693,30772288)；北京市自然
科学基金重点项目(7071005)；新世纪优秀人才支持计划(NECT-07-0117)
及高等学校学科创新引智计划(B08006)
[通信作者] ∗田金洲，博士生导师，长江学者奖励计划特聘教授，研
究方向：脑病的中医药防治。Tel：(010)84013380，E-mail：johnsontian@
hotmail.com
[作者简介] 张雷明，男，北京中医药大学在读博士，烟台大学药学院
讲师，主要研究方向：中药药理。E-mail：zlm21st@yahoo.com.cn
diffusible ligands， ADDLs）的关系更密切。文献
报道在Aβ聚集为寡聚体时就已具有神经毒性作用，
并且ADDLs与AD脑神经元功能损害可能具有更为
直接的联系[2]。
金思维提取物(GEPT)由人参茎叶皂苷等有效
成分组合而成，具有补肾益气、化痰活血的功效。
前期研究表明，GEPT具有改善和延缓轻度认知损
害老年患者记忆衰退的作用[3-4]，提示其可能参与调
节了AD早期脑内的病理改变。本试验采用经典的
APPV717I转基因小鼠模型，通过观察GEPT对
APPV717I转基因小鼠痴呆早期空间学习记忆以及
突触结构与功能的影响，进一步揭示其可能的作用
机制。
1 材料与方法
1.1 动物
3 月龄 APPV717I 转基因小鼠 30 只，雌雄各半，
[中国医学科学院实验动物研究中心，许可证编号
SCXK（京）2004-0001]，同时购买同月龄遗传背景


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相同的 C57BL/6J 小鼠 6 只作为正常对照。所有小
鼠均饲养于北京中医药大学东直门医院药理实验
中心屏障环境实验动物室[许可证编号 SCXK（京）
2004-0009]。
1.2 药品、试剂及主要仪器
GEPT：主要由人参茎叶皂苷等组成（河南宛
西制药有限公司，批号 20010923）。使用时用双蒸
水配制成低、中、高剂量（7.5，15，30 g·L-1）。盐
酸多奈哌齐(donepezil)[卫材（中国）药业有限公司，
批号 060307A]，使用时研磨粉碎，用双蒸水溶解配
制成剂量 0.092 g·L-1。抗体：兔 Shank1 抗体（北京
中杉金桥生物技术有限公司，批号 PR-0306）。免
疫组化用 VECTASTAIN® ABC 检测试剂盒（北京
中杉金桥生物技术有限公司，批号 100308）。
CM1900 型冰冻切片机（LEICA 公司）；EM208s
型电镜（Philips 公司）。
1.3 分组与给药
APPV717I 转基因小鼠 30 只随机分为模型组、
多奈哌齐组（0.000 92 g·kg-1·d-1）、金思维低（0.075
g·kg-1·d-1）、中（0.15 g·kg-1·d-1）和高剂量组（0.3
g·kg-1·d-1），每组 6 只；同月龄遗传背景相同的
C57BL/6J 小鼠 6 只作为正常组。灌胃给药（0.01
mL·g-1 体重），每日 1 次。在给药 4 个月后进行行为
学检测。
1.4 Morris 水迷宫实验
测试程序包括：①定位航行（place navigation）
实验：每天训练 2 次，每次 120 s，共 5 d。从平台
所在象限的相邻象限中选择一个入水点，将动物面
向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时
间即逃避潜伏期(escape latency)。如果动物在 120 s
内未找到平台，则由实验者将其引至平台停留 20 s，
逃避潜伏期记为 120 s。②空间搜索实验( probe trial
testing)：第 6 天撤除平台，任选一个入水点将动物
放人水中，动物在水中游泳 120 s，测量 120 s 内动
物在目标象限(原平台所在象限)(target quadrant)游
泳时间，并以目标象限游泳时间与总游泳时间的比
值进行组间比较。
1.5 免疫组化染色
水迷宫实验结束后， 每组小鼠各取 5 只，4%
多聚甲醛灌注固定，取出鼠脑投入 20 %蔗糖多聚甲
醛后固定液中固定，至脑下沉后进行冰冻切片。脑
片厚度 40 μm，按照试剂盒说明书用漂浮法进行
Shank1 免疫组化染色。主要步骤包括：先用 PBST
洗涤 3 次，每次 5 min；吸干后加入 3 %过氧化氢处
理 15 min，蒸馏水洗 3 次，PBST 洗 3 次，每次 5 min；
吸干后加入 5%山羊血清室温下封闭 30 min；吸干
加入兔 Shank1 抗体(1∶4000)孵育过夜(4 ℃)；PBST
漂洗后，加入生物素结合的羊抗兔 IgG 二抗(1∶200)
孵育 2 h，PBST 漂洗后加入卵白素-辣根过氧化酶
复合物(1∶100)孵育 2 h(室温)。PBST 漂洗后进行
DAB 显色，自来水终止，贴片晾干，二甲苯透明，
中性树胶封片。
1.6 免疫组化定量分析
动物取海马 CA1 区相同位置脑片，在 10 倍物
镜下观察 CA1 区内 Shank1 阳性表达情况。并以
Image-pro Plus 图象分析系统采集图像和分析，记录
每组图像 Shank1 阳性细胞总面积和吸光度（A）。
1.7 电镜观察
水迷宫实验结束后，每组小鼠各取1只，4 %多
聚甲醛灌注固定，取海马CA1区脑组织，切成1 mm3
组织块投入电镜固定液内固定2 h后，磷酸缓冲液
(pH 7.2)冲洗3次，1%锇酸后固定2 h，双蒸水冲洗3
次，梯度乙醇脱水，环氧丙烷置换2次，环氧树脂
Epon812浸透包埋，修整后，半薄切片（1 μm），
天青-美蓝染色，普通光镜下定位，超薄切片，在透
射电镜下观察海马CA1区超微结构变化并拍照。
1.8 统计学处理
采用统计软件 SPSS 11.0 进行统计分析，数据
以 ±x s 表示，组间数据比较用单因素方差分析
（One-way ANOVA）。P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 空间学习记忆行为
2.1.1 定位航行实验 历时 5 d 的实验中，各组小
鼠的逃避潜伏期均呈下降趋势，前 3 天各组间没有
明显差异。第 4 天，模型组小鼠的逃避潜伏期与正
常组相比明显延长（P<0.05)。GEPT 高剂量组与多
奈哌齐组小鼠与模型组相比逃避潜伏期显著缩短
（P<0.05)，并且都接近正常水平；而 GEPT 低、中
剂量组与模型组比较未见显著差异。第 5 天，GEPT
中、高剂量组与模型组比较均出现显著差异
（P<0.05)。GEPT 各剂量组之间以及与多奈哌齐组
比较无显著差异(表 1)。


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2.1.2 空间探索实验 第 6 天撤除平台后，模型组
目标象限游泳时间占整个游泳时间的百分比与正
常组相比明显缩短（P<0.05)。GEPT 高剂量组与多
奈哌齐组小鼠与模型组相比目标象限游泳时间百
分比明显延长（P<0.05)，并且都接近正常水平；而
GEPT 低、中剂量组与模型组比较未见显著差异。
GEPT 各剂量组之间以及与多奈哌齐组比较无显著
差异(表 1)。
表 1 GEPT 对 APPV717I 转基因小鼠学习记忆行为的影响( ±sx ，n=6)
组别 剂量/g·kg-1 第 4 天/s 第 5 天/s 第 6 天/s
正常 – 34±16 34±17 43±10
模型 – 60±192) 60±162) 29±102)
多奈哌齐 0.000 92 37±121) 35±191) 45±101)
GEPT 0.075 49±26 46±22 36±8
0.15 44±18 39±141) 39±12
0.3 39±141) 35±151) 45±101)
注：与模型组比较 1)P<0.05；与正常组比较 2)P<0.05（表 2 同）。

2.2 Shank1的表达
用 Shank1 抗体对 APP 转基因小鼠脑片进行免
疫组化染色后，各组小鼠海马 CA1 区均可见阳性反
应物。模型组 Shank1 阳性细胞总面积较正常组明
显减少（P<0.05），GEPT 中、高剂量组与模型组比
较明显增加（P<0.05），与正常组比较无显著差异。
模型组 Shank1 阳性细胞吸光度较正常组明显减小
（P<0.05），GEPT 高剂量组吸光度与模型组比较明
显增加（P<0.05），GEPT 低、中剂量组与模型组比
较未见显著差异（表 2）。
表 2 GEPT 对 APPV717I 转基因小鼠海马 CA1 区 Shank1 蛋白表达的影响( ±sx ，n=5)
组别 剂量 /g·kg-1 总面积 /μm2 A
正常 – 11 485±2 387 236±76
模型 – 8 119±1 7712) 134±452)
多奈哌齐 0.000 92 8 085±1 9492) 172±45
GEPT 0.075 9 025±1 981 192±27
0.15 11 517±2 6671) 207±64
0.3 11 744±2 2471) 246±551)

2.3 超微结构的变化
以铜网为界，每个标本随机选取5个视野进行
镜下观察，结果发现，神经元：各组小鼠海马CA1
区神经元胞体边界清晰、完整，胞内细胞器都基本
正常，神经元数目也未见明显差异。突触：正常组
小鼠海马CA1区神经毡中突触结构清晰，数目多；
而模型组小鼠可见突触数量减少，突触间隙增宽，
突触界面曲率下降，突触后致密区（postsynaptic
density，PSD）厚度减小。GEPT各剂量组与模型组
比较存在剂量依赖性的修复作用，尤其是大剂量组
对突触的修复作用最为明显（图1）。
3 讨论
长期以来科学家一直认为 SP 是 AD 主要的病
理基础。最近研究发现脑内存在可溶性非纤丝状的
ADDLs，并且它在 AD 脑内明显增加[5]。Walsh 等[6]
发现，大鼠脑室内注射含人 ADDLs 的培养基能够
抑制海马突触传递的长时程增强(LTP)。ADDLs 可
通过黏附于神经元并特异性地作用于突触，进而干
扰神经元之间的信号传递而产生明显的学习记忆
损害。
APP 转基因小鼠模型为国际上研究 AD 发病机
制以及药物开发的经典模型。本实验采用的中国医
学科学院开发的APPV717I转基因小鼠，一般在 4～
6 月龄就出现空间学习记忆能力下降，10 月龄开始
出现明显的 β 淀粉样沉积[7-8]。因此本实验采用 3
月龄的 APPV717I 转基因小鼠给药 4 个月进行 AD
早期学习记忆的研究是合理的。
Morris 水迷宫实验结果显示：随着游泳训练次
数的增加，GEPT 能明显缩短 APPV717I 转基因小
鼠的逃避潜伏期（P<0.05）以及延长在目标象限的


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A. 正常组（×15 000）；B. 模型组(×17 000)；
C. 多奈哌齐组（×17 000）；D. GEPT 低剂量组（×17 000）；
E. GEPT 中剂量组（×17 000）；F. GEPT 高剂量组（×20 000）。
图 1 APPV717I 转基因小鼠海马 CA1 区突触超微
结构（图中箭头所示）

游泳时间（P<0.05），并且接近正常水平。提示 GEPT
能改善 APPV717I 转基因小鼠的学习记忆障碍。然
而其可能机制是什么，是否是通过调解突触的可塑
性而实现的，为此又进一步对突触相关蛋白 Shank1
以及突触超微结构进行了研究。
Shank 蛋白家族是一种在细胞信号转导中起重
要作用的蛋白。主要有 3 个成员：Shank1，Shank2，
Shank3。其中 Shank1 主要表达于脑组织。Shank 分
子含有多个蛋白结合位点，如 ankyrin，SH3，PDZ
结构域、脯氨酸富集区和 SAM 结构域，它通过分
子中 PDZ 结构域连接 PSD-95 相关蛋白 GKAP 的
C-末端，或将膜 NMDA 受体与细胞骨架联系，或
通过细胞内 Homer 蛋白与 mGluR 发生作用[9-10]。因
此，Shank 蛋白是突触后蛋白网络的核心部分，在
神经元突触发育、突触后膜受体锚定及细胞间信号
传递中发挥关键作用。
本实验研究发现，模型组 Shank1 阳性细胞总
面积与积分吸光度较正常对照组明显减少
（P<0.05）。GEPT 中、高剂量组 Shank1 阳性细胞
总面积与模型组比较明显增加（P<0.05），并且与正
常组比较无显著差异。GEPT 高剂量组 Shank1 阳性
细胞积分吸光度与模型组比较也明显增加
（P<0.05）。提示 GEPT 对受损的突触相关蛋白
Shank1 有保护作用。这也与前期的实验结果相一
致[11]。
此外，超微结构显示：APPV717I 转基因小鼠
在给药 4 个月后（7 月龄）海马 CA1 区神经元基本
正常，神经元数目也未见明显差异。然而可见突触
数量减少，突触间隙增宽，突触界面曲率下降，PSD
厚度减小。GEPT 组与模型组比较存在剂量依赖性
的修复作用，尤其是大剂量组对突触的修复作用最
为明显。提示 GEPT 对突触损伤有较好的修复作用。
综上所述，GEPT 能提高 APP 转基因小鼠痴呆
早期学习记忆的能力，并且这一作用可能通过改善
突触损伤以及提高突触相关蛋白 Shank1 的表达来
实现。然而根据前面提到的ADDLs相关理论，GEPT
是否会影响到脑内 Aβ 寡聚体的产生和代谢，进而
实现上述作用还不清楚，有待进一步研究。
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2009 年 2 月

Effect of GEPT extracts on spatial learning ability of APPV717I
transgenic mice at early stage of dementia and its possible mechanism

ZHANG Leiming1.3，TIAN Jinzhou1*，YIN Junxiang1，SHI Jing1，WANG Pengwen1，WANG Rong2，
HU Quan1，ZHAO Zhiwei2，JI Zhijuan2，REN Ying1
( 1. Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；
2. Xuanwu Hospital， Capital University of Medical Sciences， Beijing 100053， China；
3. Laboratory of Pharmacology， School of Pharmacy， Yantai University， Yantai 264005， China)

[Abstract] Objective：To investigate the effect of GEPT extracts on spatial learning ability of the APPV717I transgenic mice
at the early stage of dementia and its possible mechanism. Method：Thirty APPV717I transgenic mice were randomly divided into
three GEPT groups by intragastric administration at doses of 0.075，0.15，0.3 g·kg-1·d-1， and a donepezil group by intragastric
administration of 0.92 mg·kg-1·d-1， a APPV717I transgenic model group and a normal group by intragastric administration of
distilled water. A four-month treatment regimen with GEPT extracts was administered to APPV717I transgenic mice. Results showed
that Spatial memory ability was measured in Morris water maze. The total area covered by shank1 and integral optical density in
CA1 subfield within the hippocampus were determined using immunohistochemical stains and Image-Pro plus analysis. The
ultrastructure of synapses in the hippocampal CA1 region was observed by electronic microscope. Result：After a four-month of
GEPT treatment regimen， the mean escape latency period were significantly shortened (P<0.05)， and the target quadrant search
time were significantly increased (P<0.05) compared to the APPV717I transgenic model mice. There was a significant higher level in
the expression of shank1 detected in the hippocampal CA1 area of APPV717I transgenic mice associated with an increase in the
number of synapses treated with GEPT than the levels in the APPV717I transgenic model mice alone. The total area of positive cells
covered by shank1 and their integral optical density in the hippocampal CA1 area of the APPV717I transgenic mice treated with
GEPT were significantly increased more than those of the APPV717I transgenic model mice. Conclusion：GEPT extracts can
obviously improve the spatial memory ability of APPV717I transgenic mice at the early stage of dementia through enhancing the
number of synapses and the expression of shank1，and this might lead to development of novel treatment therapies for the memory
loss associated with AD.
[Key words] GEPT；APPV717I transgenic mice；Morris water maze；Shank1；synapse
[责任编辑 古云侠]