全 文 :梓醇对过氧化氢诱导的星形胶质细胞
氧化损伤的保护作用
张自强,刘玉梅,薛帮群,位兰
(河南科技大学 动物科技学院,河南 洛阳 471003)
[摘要] 目的:研究梓醇对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠脑星形胶质细胞氧化性损伤的保护作用。方法:采用1,10,100
μmol·L-1的梓醇预处理星形胶质细胞24h后,再用300μmol·L-1H2O2损伤细胞。倒置显微镜观察各组细胞形态变化,
MTT法检测细胞存活率的改变,比色法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量变化以及细胞内的超氧化物歧化酶(T
SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活性变化和丙二醛(MDA)的含量变化。结果:梓醇可明显改善细胞的形态变化,提高
了星形胶质细胞的存活率,维持了细胞膜的完整性,并对 H2O2诱导的星形胶质细胞内 TSOD,GSHPX活性降低和 MDA含量
升高有显著的抑制作用。结论:梓醇对H2O2诱导的星形胶质细胞氧化性损伤具有保护作用。
[关键词] 梓醇;星形胶质细胞;氧化损伤
[收稿日期] 20081120
[通信作者] 刘玉梅,Email:lymzq@126.com
[作者简介] 张自强,硕士研究生,讲师;研究方向:主要从事神经
生物学方面的研究。Email:zzq828929@163.com
自由基是机体许多生化反应的中间代谢产物,
在正常情况下处于产生和消除的动态平衡中。然
而,过量的自由基会导致细胞损伤,引起机体衰老
及功能障碍。脑组织比其他任何组织器官更易受自
由基的攻击,这是由于脑组织具有较高的需氧量、
高水平的不饱和脂质、极高的代谢率,而抗氧化防
御系统相对较缺乏(各种抗氧化酶活力低)[12]。梓
醇(catalpol)是地黄最主要的有效成分之一,具有
利尿、缓泻、降血糖及保肝等多种药理作用[3]。
近年研究表明,梓醇具有显著的神经保护作用,其
能保护 L谷氨酸、Aβ2535及缺氧缺糖诱导的 PC12
细胞损伤[46]、改善鱼藤酮损伤小鼠的记忆能
力[7]、缓解 D半乳糖诱导的小鼠脑组织氧化损
伤[8],并能促进大鼠大脑皮质神经元轴突的生
长[3]。为了进一步证实梓醇的神经保护功能,本
研究通过体外实验初步研究了梓醇对星形胶质细胞
氧化损伤的保护作用,为梓醇防治神经系统疾病提
供实验依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
梓醇(中国药品生物制品检定所,纯度 >
98%);DMEM/F12培养基(GIBCO);胎牛血清(杭
州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶试剂
盒(碧云天生物技术研究所);四甲基偶氮唑盐
(MTT),(GIBCO);TSOD,GSHPX,MDA和 LDH
检测试剂盒(南京建成生物研究所)。
1.2 主要仪器
MCO15ACCO2培养箱(日本 Sanyo公司);
CKX41倒置荧光显微镜(日本 Olympus公司);
Model550酶标仪(BIORAD公司);318K超速低温
离心机(Sigma公司);UV1102型紫外可见光分光
光度计(上海天美科学仪器有限公司)。
1.3 动物
出生1d的SD大鼠6只,购自第四军医大学实
验动物中心,动物质量合格证号 SCXK(军)2002
005。
2 方法
2.1 星形胶质细胞的原代培养
无菌条件下,断颈剪下脑组织,用弯镊轻轻撕掉
脑膜和血管后从大脑纵裂处分离大脑皮质。剪碎,
吹打分散细胞,在37℃水浴箱中以025%的胰蛋
白酶消化 30min。然后加入含 10%胎牛血清的
DMEM/F12培养基,稍加吹打至胰酶与培养基混
匀,离心5min(1000r·min-1),弃上清,重新加入
含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,轻轻吹打至
细胞团块消散,制成细胞悬液,接种于75cm2细胞培
养瓶中,置37℃、含5%CO2的细胞培养箱内培养。
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每3d换液1次,第9天时,将培养瓶置于恒温摇床
内以260r·min-1振摇过夜,以除去小胶质细胞和
少突胶质细胞。
2.2 分组
将纯化后的星形胶质细胞消化、离心后分为5
组,即正常组、H2O2损伤组、梓醇Ⅰ组(1μmol·
L-1)、梓醇Ⅱ组(10μmol·L-1)和梓醇Ⅲ组(100
μmol·L-1)。当各组细胞生长到接近于融合状态
时,进行药物处理,其中梓醇各组预先给予相应浓度
的药物作用24h,然后与损伤组一起加入300μmol
·L-1H2O2继续培养4h后,进行指标测定。
2.3 检测指标及方法
2.3.1 星形胶质细胞形态学观察 每组细胞相应
处理结束后,吸去细胞培养液,用 PBS液洗3次,将
细胞培养板放置在显微镜下观察并拍照。
2.3.2 细胞存活率检测 MTT法检测细胞存活
率,将每组细胞处理前的细胞悬液接种于 96孔板
中。待细胞贴壁并生长近融合状态时,每组按22
项下进行分组和相应的处理后,加入 MTT(5g·
L-1)10μL,继续培养4h,吸去培养基,用无血清培
养基洗涤细胞1次,加入 DMSO100μL,37℃,5%
CO2培养箱中孵育10min,紫色结晶完全溶解后,用
酶标仪检测各组细胞490nm处的吸光度(A)。为
消除培养板和培养基本底吸光值,本试验同时设立
空白组(加入200μL无血清培养基)。
细胞存活率 =(A实验组 -A空白组)/(A正常组 -A空白组)×
100%
2.3.3 LDH释放量的测定 取每孔细胞上清液20
μL,按照LDH测定试剂盒说明,用紫外分光光度计
检测LDH的含量,结果以U·L-1表示。
2.3.4 TSOD,GSHPX活性和 MDA含量的检测
各组细胞相应处理结束后,吸去培养液,以冰生理盐
水洗涤细胞2次,用细胞刮板刮下细胞,然后将细胞
置于-80℃超低温冰箱中冰冻,室温溶解,反复3
次后,按照试剂盒说明测定细胞内 TSOD,GSHPX
活性和MDA含量,结果分别以 U· mg-1及 μmol·
g-1表示。
2.4 数据处理
实验结果采用 SPSS130软件分析,各组数据
以 珋x±s表示,P<005为有统计学意义。
3 结果
3.1 梓醇对星形胶质细胞形态变化的影响
正常组的星形胶质细胞呈扁平多边形,核形态
饱满,折光率高,活力旺盛,周围具有放射状的细长
突起,呈明显的星形;模型组的星形胶质细胞大量突
起消失,皱缩,细胞失去结构完整性;梓醇Ⅲ组细胞
皱缩,但是部分细胞的大量突起依然存在,细胞形态
基本完整(图1)。
A正常组;B模型组;C梓醇Ⅲ组
图1 梓醇对H2O2诱导的星形胶质细胞形态变化的影响(×400)
3.2 梓醇对星形胶质细胞存活率的影响
模型组的 细 胞 存 活 率 较 对 照 组 下 降 了
5898%,差异显著(P<005)。采用梓醇进行预处
理后,细胞存活率均较模型组有所改善,其中梓醇Ⅱ
组和梓醇 Ⅲ组与模型组相比,细胞存活率分别提高
了4518%和5432%,差异达到显著性水平(P<
005)(图2)。
3.3 梓醇对星形胶质细胞膜完整性的影响
由图3可知,模型组的 LDH释放量显著升高,
表明细胞膜明显损伤。而1,10和100μmol·L-1的
梓醇可降低LDH的释放量,其中以100μmol·L-1
的梓醇组保护作用最强,LDH较模型组降低了
5458%,差异显著(P<005)。
3.4 梓醇对星形胶质细胞内抗氧化酶活力和脂质
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a.与正常组比P<005;b.与模型组比 P<005(图3同)。
图2 梓醇对星形胶质细胞存活率的影响
过氧化产物含量变化的影响
模型组抗氧化酶活力均显著低于正常组,而
MDA含量则显著升高(P<005)。采用梓醇进行
图3 梓醇对星形胶质细胞膜完整性的影响
预处理后,3个剂量组的抗氧化酶活力均较模型组
显著增强(P<005);MDA含量均较模型组减弱,
其中梓醇Ⅱ组和梓醇Ⅲ组与模型组相比差异显著
(P<005)(表1)。
表1 梓醇对H2O2诱导的星形胶质细胞内TSOD,GSHPX,MDA的影响(珋x±s,n=3)
分组 浓度/μmol·L-1 TSOD/U·mg-1 GSHPx/U·mg-1 MDA/nmol·mg-1
正常 - 22400±1721 21207±1329 611±094
模型 - 7960±8371) 8508±6701) 4832±2021)
梓醇Ⅰ 1 16545±8791,2) 12558±10961,2) 3701±6161)
梓醇Ⅱ 10 18927±16322) 17419±1881,2) 1953±3191,2)
梓醇Ⅲ 100 20266±12022) 19811±12842) 1344±3262)
注:与正常组比1)P<005:与模型组比2)P<005。
4 讨论
星形胶质细胞是脑组织中数量最多的细胞类
型。研究表明,其除具有支持、营养神经细胞,分泌
多种细胞因子的功能外,还可调控神经元的生物电
活性、提高突触间隙信息传递的效率[910]。此外,星
形胶质细胞作为血脑屏障的构成部分在维持脑实质
微环境稳态方面发挥重要作用,也是脑组织防御血
液中活性氧攻击的第一道屏障。因此星形胶质细胞
已成为近年来神经保护机能方面的重要研究靶点。
地黄是滋阴、补血、填精、补髓的代表中药,研究
表明,“补肾填髓”中药可促进神经元细胞能量代谢
和利用,增加内源性神经营养因子生成,抑制神经毒
素的生成,从而减少神经元死亡,促进神经元存活与
再生[3,11]。但地黄对体外培养的神经胶质细胞的保
护作用目前还未见报道。因此本研究观察了地黄的
主要活性成分梓醇对损伤因素作用下的星形胶质细
胞的影响。
H2O2是一种活性氧分子,它参与了许多神经系
统疾病的发病机制,常用作神经细胞氧化损伤的诱
导剂[12]。LDH释放量可反应细胞膜对LDH的渗漏
程度,即反映细胞膜的通透性和完整性。在H2O2刺
激下,细胞膜的完整性遭到破坏,LDH的渗透率也
相应增加,导致了细胞培养液中LDH的含量大幅升
高。本实验结果显示,梓醇可以逆转H2O2所致的星
形胶质细胞活力下降和 LDH渗漏率增强。高浓度
的梓醇组LDH渗透率较正常组仅有轻微升高。SOD
是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶类之一,主要
功能是清除体内有氧代谢所产生的超氧阴离子自由
基,使机体和细胞免受损害[13]。GSHPX是机体内广
泛存在的一种重要的过氧化氢分解酶,在 CAT含量
极少的脑组织中,主要靠 GSHPX来清除过氧化
氢[14]。丙二醛是脂质过氧化产物,随年龄而增高,反
映机体脂质过氧化程度,间接反映细胞损伤情况[15]。
本实验结果表明,H2O2可引起TSOD,GSHPX活力下
降和MDA含量升高,而预先采用梓醇干预后TSOD,
GSHPX活力和 MDA含量均较模型组明显改善,且
中、高剂量的梓醇组与正常组无显著差异。提示梓醇
具有清除自由基和抗脂质过氧化作用。
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众所周知,在细胞凋亡的诸多诱因中自由基是
一个重要因素,本研究证实了梓醇能够抑制星形胶
质细胞的氧化损伤,然而梓醇对星形胶质细胞的存
活率和LDH的显著影响是否是通过抗氧化作用而
抑制细胞凋亡来实现还有待于进一步研究。本研究
初步探讨了梓醇对星形胶质细胞氧化损伤的影响,
认为其神经保护功能可能与其抗氧化作用有关。并
推测梓醇对星形胶质细胞的正常形态和功能的维持
可能促进了其对神经元的间接保护作用。
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ProtectiveefectsofcatalpolagainstH2O2inducedoxidative
damageinastrocytes
ZHANGZiqiang,LIUYumei,XUEBangqun,WEILan
(ColegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China)
[Abstract] Objective:TostudytheprotectiveefectsofcatalpolagainstH2O2inducedoxidativedamageinastrocytes.Meth
od:Astrocyteswerepretreatedwith1,10,100μmol·L-1catalpolandthenexposedtoH2O2.Efectsofcatalpoloncelmorphous
wereobservedbyinvertedmicroscope.CelviabilityweredetectedbyMTTassay.LDHcontentinthecelculturefluid,andintracelu
larTSOD,GSHPxactivityandMDAcontentwereassessedbycolorimetricmethod.Result:Theresultsshowedthatcatalpolevident
lyamelioratedcelmorphous,improvedcelviability,andmaintainedintegralityofcelmembrane.Furthermore,catalpolcouldsignifi
cantlyinhibitthedecreaseofintracelularTSODandGSHPXactivity,andtheincreaseofMDAcontent.Conclusion:Catalpolhave
protectiveefectsagainstH2O2inducedoxidativedamageinastrocytes.
[Keywords] catalpol;astrocytes;oxidativedamage
[责任编辑 古云侠]
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