全 文 ：金钱白花蛇及其混淆品高特异性 °≤• 的鉴别
冯成强t ow o唐晓晶t o黄璐琦t 3 o钱忠直u o张 继v o崔光红t
kt1 中国中医科学院 中药研究所 o北京 tsszss ~
u1 国家药典委员会 o北京 tsssyt ~
v1 中国药品生物制品检定所 o北京 tsssxs ~
w1 北京师范大学 资源药物与中药资源研究所 o北京 tsss{{l
≈摘要  目的 }建立一种实用 !简便的金钱白花蛇药材 ⁄‘„分子标记鉴别方法 ∀方法 }根据金钱白花蛇及常见
混淆品线粒体 ≤¼·β基因序列 o设计一对专门用于中药材金钱白花蛇的鉴别引物 ‹2t和 ‹‹2t ∀用不同的复性温
度 °≤• 扩增 o确立特异性反应条件 o并利用此方法鉴别从市场中购买的金钱白花蛇药材 ∀结果 }在 yz ε 复性温度
下进行 °≤• o正品金钱白花蛇均得到 uvs ¥³的扩增带 o而混淆品在同样的条件下无扩增带 ∀对市售金钱白花蛇药
材随机选取 t{块进行 °≤• 鉴别验证 o其中正品 tw块 o混淆品 w块 o检出率达 tss h ∀结论 }设计的鉴别引物对正品
金钱白花蛇有高度特异性 ∀可用于市售金钱白花蛇药材的鉴定 ∀ °≤• 稳定性高 o同种不同个体间的种内差异对鉴
定结果不会有影响 ∀
≈关键词  金钱白花蛇 ~高特异性鉴别 ~°≤•
≈中图分类号  • u{u1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltv2tsxs2sw
≈收稿日期  ussx2st2tu
≈通讯作者  3 黄璐琦 oר¯ }kstslywstwwtt2u|xx oƒ¤¬}kstsl
{wswwvws o∞2°¤¬¯}«∏¤±ª¯∏´¬ƒ uyv q±¨ ·
金钱白花蛇为5中国药典6ussx年版一部收载
的一种常用中药 o来源于眼镜蛇科动物金钱白花蛇
Βυνγαρυσ µυλτιχινχτυσ …¯¼·«的干燥体≈t  o有祛风 !通
络 !止痉之功效 ∀金钱白花蛇作为动物药材临床功
效确切 o但商品来源复杂 !药材形态鉴别困难 o而且
仅根据形态特征很难进行准确地鉴别 ∀王义权等≈u 
使用 °≤• 高特异性鉴别引物已鉴定出金钱白花蛇
的真伪 o但所报道的混淆品数量少 o有些通过形态特
征即可排除 o尚不能满足目前市场上混伪品的鉴定 ∀
为了深入研究金钱白花蛇类药材分子遗传标记鉴
别 o寻找到更为经济实用 !准确便捷 !稳定性高的鉴
别方法 o本研究用高特异性 °≤• 对金钱白花蛇药材
及其混淆品进行鉴别 ∀
1 材料和方法
111 材料 用于高特异性 °≤• 鉴别方法学研究的
实验材料见表 t ∀用于验证实验的金钱白花蛇药材
购自北京同仁堂 !北京金象大药房 !北京京隆堂 !北
京阳光同仁药房 ∀所有实验材料均经中国药品生物
制品检定所张继研究员鉴定 ∀
表 t 金钱白花蛇及其混淆品来源及数量
编号 材料名称 拉丁学名 数量
t 金钱白花蛇tl Βυνγαρυσ µυλτιχινχτυσ u
u 金钱白花蛇tl Β . µυλτιχινχυτυσ u
v 金钱白花蛇tl Β . µυλτιχινχυτυσ u
w 金钱白花蛇tl Β . µυλτιχινχυτυσ u
x 赤链蛇ul ∆ινοδον ρυφοζονατυµ u
y 赤链蛇ul ∆ . ρυφοζονατυµ u
z 赤链华游蛇ul Σινονατριξ αννυλαρισ u
{ 赤链华游蛇ul Σ . αννυλαρισ t
| 金环蛇ul Β . φασχιατυσ t
ts 金环蛇ul Β . φασχιατυσ u
tt 中国水蛇ul Ενηψδρισ χηινενσισ t
tu 中国水蛇ul Ε . χηινενσισ t
tv 双全白环蛇ul Λψχοδον φασχιατυσ u
tw 双全白环蛇ul Λ. φασχιατυσ t
tx 铅色水蛇ul Ε . πλυµβεα u
ty 铅色水蛇ul Ε . πλυµβεα t
注 }tl正品 ~ul混淆品 ~≠ t ox oz otv oty号样品购自江西樟树药材市
场 ~u oy o{ ots号样品购自河北安国药材市场 ~v otu号样品购自江西昌
北药材市场 ~w o| ott otw otx号样品购自中国药品生物制品检定所
112 金钱白花蛇高特异性 °≤• 鉴别引物的设计
对金钱白花蛇及其混淆品的 ≤¼·β基因片段使用通
用引物 tw{wt xχ„„„„„Š≤××≤≤„×≤≤„„≤„×≤×≤„Š
≤„׊„׊„„„ vχ和 ‹txtw| xχ „„„≤׊≤„Š≤≤≤≤×2
≤„Š„„׊„ׄ××׊×≤≤×≤„vχ进行 °≤• 扩增 o对 °≤•
#sxst#
第 vt卷第 tv期
ussy年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tv
∏¯¼ oussy
产物测定其序列约 vux ¥³o经 ⁄‘„„‘软件对位排
列分析正 !混品间 ⁄‘„ 序列差异 o设计出一对能特
异性扩增金钱白花蛇 ≤¼·β 基因片段的鉴别引物
‹2t xχ Š„≤×ׄŠ≤×××≤×≤„×≤׊׊„×≤≤„ׄ×ׄvχ
和 ‹‹2txχŠ≤≤׊≤„Š≤≤≤≤×≤„Š„„׊„ׄ××׊×≤≤
×≤„vχk上海生工生物公司合成l ∀序列见图 t ∀
图 t 金钱白花蛇及其混淆品的 ≤¼·β序列
斜体序列为金钱白花蛇特异性鉴别引物
113 模板 ⁄‘„的提取 取金钱白花蛇及混淆品原
动物干燥肌肉组织约 t ªo参照王义权等≈v 方法提取
⁄‘„模板 ∀
114 特异性 °≤• 鉴别方法 °≤• 反应体系 vs ˏo
含 ts °°²¯# pt×µ¬¶2‹≤¯ o³‹ {1s oxs °°²¯#ptŽ≤¯ o
s1t h ×µ¬·²± ÷2tss ot1x °°²¯ #pt ª≤¯ u ot1x °°²¯ #
pt§‘×°¶o高特异性鉴别引物 ‹2t和 ‹‹2t各 ts
³°²¯#pt ov˜ פ´ 酶和 ⁄‘„模板约 txs ±ª∀循环参
数 }|x ε 预变性 w °¬±~|x ε 变性 ws ¶oyz ε 退火 t
°¬±ozu ε 延伸 vs ¶~ux个循环 ~zu ε 延伸 x °¬±∀
°≤• 反应选用不同的复性温度以寻找合适的 °≤•
鉴别反应参数 ∀实验中设置无 ⁄‘„ 模板的阴性对
照 ∀取 x ˏ反应液经 t1{ h琼脂糖凝胶电泳 o∞…染
色 o紫外凝胶分析检测 o成像 ∀
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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同时用扩增约 vus ¥³的 ≤¼·β基因片段的通用
引物 o在 xx ε 的复性温度下对上述用于 °≤• 鉴别
的模板 ⁄‘„作阳性扩增对照 ∀
2 结果
211 模板质量的研究 金钱白花蛇药材及混淆品
原动物提取的 ⁄‘„ 模板用通用引物 tw{wt 和
‹txtw|扩增 o得到约 vus ¥³扩增带k图 ul ~表明样品
中模板 ⁄‘„质量符合 °≤• 反应的要求 ∀
图 u 通用引物 tw{wt和 ‹txtw|扩增k阳性对照l
样品编号同表 t ~‘1阴性对照 ~1⁄‘„ °¤µ®¨µk图 v ∗ x同l
212 高特异性 °≤• 鉴别 用鉴别引物 °≤• 扩增金
钱白花蛇原动物样品的 ⁄‘„ o当复性温度为 ys ε
时 o金钱白花蛇 !金环蛇 !中国水蛇 !双全白环蛇在
uvs ¥³处扩增出条带k图 vl ~当复性温度为 yx ε 时 o
金钱白花蛇 !中国水蛇同时扩增出一条弱带k图 wl ~
当复性温度升至 yz ε 时 o其反应具有高度特异性 o
仅正品金钱白花蛇有良好的单一扩增带 o其余样品
均无扩增带出现k图 xl ~当退火和延伸温度合并为
yz ε 时 o正品也未见扩增带出现 ~当复性温度升至
zs ε 时 o所有样品均无扩增带出现 ∀故特异性 °≤•
循环参数确定为 }|x ε 预变性 w °¬±~|x ε 变性 ws
¶oyz ε 复性 t °¬±ozu ε 延伸 vs ¶~ux个循环 ~zu
ε 延伸 x °¬±∀因此 o依据鉴别引物扩增模板 ⁄‘„
有无扩增条带即可确定受试样品是否为正品 ∀
图 v 鉴别引物高特异性 °≤• 鉴别kys ε 退火l
213 个体差异的研究 因物种种内存在变异 o本次
实验针对动物类药材不同产地间物种的变异是否会
影响 °≤• 特异性鉴别结果进行了验证 ∀将所有收
集到的金钱白花蛇正品及混淆品原动物的 ⁄‘„ 模

图 w 鉴别引物高特异性 °≤• 鉴别kyx ε 退火l
图 x 鉴别引物高特异性 °≤• 鉴别kyz ε 退火l
板进行 °≤• 鉴别 o结果显示不同来源的正品金钱白
花蛇在 uvs ¥³处出现扩增带 o而混淆品均未见扩增
带k图略l ∀表明金钱白花蛇及其混淆品同一物种的
种内差异不会影响高特异性 °≤• 鉴别的结果 ∀
214 市售金钱白花蛇药材特异性鉴别 用金钱白
花蛇鉴别引物 o对北京同仁堂药店 !北京金象大药
房 !北京阳光同仁药房 !北京京隆堂随机购买的金钱
白花蛇药材进行 °≤• 鉴别 o同时通用引物扩增作为
阳性对照k图 yl ∀结果显示样品 t ∗ x o{ ∗ ts otu o
tx ∗ t{在约 uvs ¥³处出现一条明亮的扩增带 o表明
为正品金钱白花蛇 ~而样品 y oz ott otw均无扩增带
出现 o表明是金钱白花蛇的混淆品k图 zl ∀本结果
与根据药材外观性状 !显微鉴别的鉴定结果完全一
致 ∀
图 y 通用引物 tw{wt和 ‹txtw|扩增k阳性对照l
对购买的金钱白花蛇药材样品编号k编号与表 t不同l }t ∗ x1 北
京同仁堂药店 ~y ∗ ts1 北京金象大药房 ~tt ∗ tw1 北京永安堂药
房 ~tx ∗ t{1 北京京隆堂药房k图 z同l
215 °≤• 方法稳定性考察 为了考察 °≤• 方法的
稳定性选取了¬±√¬·µ²ª¨± !°µ²°¨ ª¤公司 !生工公司 !华
美公司 !天为时代公司 !博大生物公司 פ´ ⁄‘„聚合
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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图 z 鉴别引物高特异性 °≤• 鉴别kyz ε 退火l
酶 o使用相同的 °≤• 仪k„…Œp |zssl进行 °≤• 高特
异性鉴别 ∀结果显示不同公司 פ´ ⁄‘„聚合酶都得
到了相同的鉴别结果k图略l ∀
3 讨论
311 不同文献报道的金钱白花蛇混淆品种类存在
较大差异≈u  ∀实际调查中发现 o有些混淆品在商品
流通中出现的频率极低 o一些则由于在外观上其形
态 !大小与金钱白花蛇相差甚远 o通过性状特征容易
区别 ∀所以寻找充伪频率最高 o来源相近 o外观形态
与金钱白花蛇相近的品种 o进行 °≤• 鉴别才具有重
要意义 ∀
312 细胞色素 βk≤¼·βl是动物体内编码蛋白质的
基因 o具有高度保守性 ∀而金钱白花蛇与其混淆品
的 ≤¼·β基因序列相近 o所以提高退火温度并减少
循环数来增加特异性就显得十分重要 ∀使用鉴别引
物在低温退火时会产生很多非特异性条带 o通过摸

索提高到 yz ε 时特异性最高 ∀由于退火温度已经
足够高 o实验中还尝试将退火延伸合二为一完成整
个扩增循环 o既省时又提高特异性 o但未得到期望的
结果 ∀
313 动物类药材与植物药不同的是它不会固定生
长 ∀金钱白花蛇产地遍及南方多省市 o是否不同省
市物种的种内差异会影响 °≤• 鉴别的结果 ∀取样
时分别从不同地方收集到同一种的不同个体 o有效
避免了每个物种只有一个样品的弊端 o从而消除了
出现假阳性的可能 ∀
314 °≤• 方法的稳定性一直以来倍受关注 ∀关于
°≤• 鉴别方法稳定性的报道并不多见 o但实际只有
重复性好 !稳定的方法才有可能得到广泛应用 ∀实
验中使用进口及国产 פ´ ⁄‘„聚合酶进行验证 ∀不
同的 פ´ 酶均得到相同的结果 o表明虽然不同的酶
活力不同 o但只要按各自的 °≤• 反应体系加入相应
的酶量 o则不会影响到鉴定结果 ∀
≈参考文献 
≈t  中国药典 1 一部 1ussx }txt1
≈t  王义权 o周开亚 o徐珞珊 o等 q金钱白花蛇及其伪品的 ≤¼·β
基因片段序列分析和 °≤• 鉴别研究 o药学学报 ot||{ ovvktulΒ
|wt q
≈u  王义权 o周开亚 q蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究 q药
学学报 ot||z ovukxl }v{w q
Ηιγη σπεχιφιχ ΠΧΡ ιδεντιφιχατιον οφ Βυνγαρυσ µυλτιχινχτυσ ανδ ιτσ αδυλτεραντσ
ƒ∞‘Š ≤«¨ ±ª2 ¬´¤±ªtow oׄ‘Š ÷¬¤²2­¬±ªt o ‹˜„‘Š ∏2 ¬´t o ±Œ„‘«²±ª2½«¬u o‹„‘Š ¬v o≤˜Œ Š∏¤±ª2«²±ªt
(t1 Ινστιτυτε οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα , Χηινα Αχαδεµψ οφ Χηινεσε Μεδιχιαλ Σχιενχεσ , Βειϕινγ tsszss , Χηινα ;
u1 Πηαρµαχοποεια Χοµ µισσιον οφ Πεοπλε. σ Ρεπυβλιχ οφ Χηινα , Βειϕινγ tsssty , Χηινα ;
v1 ΝατιοναλΙνστιτυτε φορτηε Χοντρολ οφ Πηαρµαχευτιχαλ ανδ Βιολογιχαλ Προδυχτσ , Βειϕινγ tsssxs , Χηινα ;
w1 Ινστιτυτε οφ Νατυραλ Μεδιχινε ανδ Χηινεσε Μεδιχινε Ρεσουρχεσ , Βειϕινγ Νορµαλ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsss{{ , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ §¨ √¨¯²³¤¦²±√ ±¨¬¨±·¤±§ ©¨©¨¦·¬√¨ ° ·¨«²§©²µ·«¨ ¬§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ²© Βυνγαρυσ µυλτιχινχτυσ. Μετηοδ : …¤¶¨§
²±·«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©≤¼·β ª¨ ±¨ ©µ¤ª° ±¨·²© Β . µυλτιχινχτυ󤱧¬·¶¤§∏¯·¨µ¤±·¶o¤³¤¬µ²©«¬ª«¯¼¶³¨¦¬©¬¦³µ¬° µ¨k‹2¤±§‹‹2l º µ¨¨ §¨¶¬ª±¨ §
©²µ§¬¶·¬±ª∏¬¶«¬±ª Β . υλτιχινχτυσ©µ²° ²·«¨µ¶³¨¦¬¨¶²©¶±¤®¨ qײ ¶¨·¤¥¯¬¶«¶³¨¦¬©¬¦°≤• µ¨¤¦·¬²±¦²±§¬·¬²±o·«¨ ³µ¬° µ¨¶º µ¨¨ °¨³¯²¼¨ §·²¤°³¯¬2
©¼·«¨ ⁄‘„ ·¨°³¯¤·¨¶ ¬¨·µ¤¦·¨§©µ²° Β . µυλτιχινχτυ󤱧y ²·«¨µ¶³¨¦¬¨¶²©¶±¤®¨ o∏±§¨µ§¬©©¨µ¨±·¤±±¨ ¤¯¬±ª·¨°³¨µ¤·∏µ¨ q˜¶¬±ª·«¬¶° ·¨«²§o
Β . µυλτιχινχτυσ º¤¶¬§¨±·¬©¬¨§©µ²° t{ ¶¤°³¯ ¶¨¥²∏ª«·©µ²° °¤±¼ §µ∏ª¶·²µ¨¶qΡεσυλτ : „ uvs ¥³⁄‘„ ©µ¤ª° ±¨·º¤¶¤°³¯¬©¬¨§©µ²° Β . µυλτι2
χινχτυσ¬± °≤• º¬·«¤±±¨ ¤¯ §¨·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ¤·yz ε oº«¨µ¨¤¶±² ⁄‘„ ©µ¤ª° ±¨·º¤¶¤°³¯¬©¬¨§©µ²° ²·«¨µ¶±¤®¨ ¶¤°³¯ ¶¨∏±§¨µ·«¨ ¶¤°¨µ¨¤¦·¬²±
¦²±§¬·¬²±o Β . µυλτιχινχτυσ¦²∏¯§¥¨ ¦¯ ¤¨µ¯¼ §¬¶·¬±ª∏¬¶«¨ §©µ²° ²·«¨µ¶¥¼ °≤• µ¨¤¦·¬²± º¬·«·«¨ «¬ª«¯¼ ¶³¨¦¬©¬¦³µ¬° µ¨¶qŒ±·«¨ ³µ¨¶¨±·¶·∏§¼o
t{ ¶¤°³¯¨o¥²∏ª«·©µ²° §¬©©¨µ¨±·§µ∏ª¶·²µ¨¶o º µ¨¨ ¤¯¶²¬§¨ ±·¬©¬¨§¥¼·«¨ «¬ª«¯¼ ¶³¨¦¬©¬¦°≤• º¬·«·«¨ ³µ¬° µ¨¶q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤·tw
¶¤°³¯ ¶¨º µ¨¨ Β . µυλτιχινχτυ󤱧·«¨ ²·«¨µw º µ¨¨ ¤§∏¯·¨µ¤±·oº«¬¦«º¤¶¦²±¶¬¶·¨±·º¬·«·«¨ ¦²±¦¯∏¶¬²± ²©¤∏·«¨ ±·¬¦¤·¬²± ¥¤¶¨§²± °²µ³«²¯²ª¬2
¦¤¯ q Χονχλυσιον : ׫¨ ³µ¬° µ¨¶§¨¶¬ª±¨ §¬±·«¨ ³µ¨¶¨±·¶·∏§¼ º µ¨¨ «¬ª«¯¼ ¶³¨¦¬©¬¦©²µ Β . µυλτιχινχτυσ.
[ Κεψ ωορδσ] Βυνγαρυσ µυλτιχινχτυσ; «¬ª«¶³¨¦¬©¬¦°≤• ~¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ≈责任编辑 张宁宁 
#vxst#
第 vt卷第 tv期
ussy年 z月
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