全 文 ：黑大豆乙醇提取物的雌激素样作用及其机制研究
赵青威t ou o楼宜嘉t 3
kt1 浙江大学 药学院 o浙江 杭州 vtssvt ~u1 浙江大学 医学院 附属第一医院 o浙江 杭州 vtsssvl
≈摘要  目的 }评价黑大豆乙醇提取物k¥¯¤¦®¶²¼¥¨¤± ·¨«¤±²¯ ¬¨·µ¤¦·o…≥∞l的雌激素样作用及其作用机制 ∀方
法 }采用富含雌激素受体的雌激素依赖性人乳腺癌细胞株  ≤ƒ2z细胞 o分别以 ∞2≥≤• ∞∞‘法观察 …≥∞对其增殖的影
响 !以 • ×2°≤• 法观察 …≥∞对其雌激素效应基因 °• ‘„表达的影响 o并以雌激素受体拮抗剂 Œ≤Œt{u oz{s为工具药来
评价 …≥∞发挥雌激素样作用的机制 ∀结果 }与溶剂对照组相比较 o…≥∞kts ∗ uss Λª#°ptl能显著促进  ≤ƒ2z细胞的
增殖 otss Λª#°pt时作用达到最大 ~…≥∞能明显诱导 ≤ƒ2z细胞 ³≥u o孕激素受体k°• l基因 °• ‘„的表达 o并与药物
浓度有一定相关性 ~以上作用均能被雌激素受体拮抗剂所完全拮抗 ∀结论 }…≥∞能促进 ≤ƒ2z细胞的增殖 o诱导雌
激素效应基因 °• ‘„的表达 o即 …≥∞能通过雌激素受体发挥雌激素样作用 ∀
≈关键词  黑大豆 ~雌激素样作用 ~≤ƒ2z细胞 ~雌激素效应基因
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussylts2s{ux2sw
≈收稿日期  ussx2sz2tw
≈基金项目  国家自然科学基金2德意志研究联合会基金k‘≥2
ƒ≤2⁄ƒŠl项目≈Šsxt2vktwzl 
≈通讯作者  3 楼宜嘉 o ר¯rƒ¤¬}ksxztl {zutzusy o ∞2°¤¬¯}¼¬2
­¬¤¯²∏ƒ ½­∏1 §¨∏1¦±
黑大豆为豆科植物的成熟种子 o是传统中药淡
豆豉的主要原料 ∀制成淡豆豉后 o归肺 !胃经 o具有
解表 !除烦 o宣发郁热等功效 ∀中医临床多用于治疗
感冒 !寒热头痛 o烦躁胸闷 o虚烦不眠等症≈t  ∀已有
资料表明黑大豆主要成分包括脂肪 !蛋白质和酶等 o
具有滋补强身 !消炎解毒 !补肾利水 !活血化瘀 !明目
等功效≈u  o但迄今未见有关对黑大豆含有其他药用
成分的系统研究报道 ∀近些年来有关同类植物的研
究表明 o其不同种的大豆含有异黄酮成分 o具有植物
雌激素样作用≈v ow  ∀为了明确黑大豆是否也同样含
有类似成分 o并发挥相关作用 o本研究采用雌激素依
赖性乳腺癌 ≤ƒ2z细胞株 o研究黑大豆乙醇提取物
的雌激素样作用及其作用机制 o为丰富中药材黑大
豆药用价值提供实验依据 ∀
1 材料
111 细胞系
人乳腺癌 ≤ƒ2z细胞株k雌激素受体阳性l购
自中国科学院细胞生物研究所细胞库 ∀
112 药材与试剂
黑大豆购于杭州粮油食品批发市场 o由浙江大
学农学院蔬菜研究所汪炳良教授鉴定为 Γλψχινε µαξ
k1l  µ¨µ1 ~雌二醇ktzΒ2 ¶¨·µ¤§¬²¯ o∞ul o⁄∞ 和无酚
红 ⁄∞ 培养液 !噻唑蓝 k ××l k≥¬ª°¤公司l ~
Œ≤Œt{u oz{skײ¦µ¬¶公司l ~小牛血清为浙江四季青生
物制品公司生产 ~引物 !×µ¬½²¯ 细胞裂解液 !פ´ ⁄‘„
聚合酶k上海生工生物工程公司l ~2∏∂ 逆转录
酶 !• ‘„酶抑制剂kƒ µ¨°¨ ±·¤¶公司l ∀
113 主要仪器
台式酶标仪k…¬²2× ®¨公司l o°≤• 扩增仪k∞³2
³¨ ±§²©公司l o台式高速冷冻离心机k≥¬ª°¤公司l o
∞≤°vsss三恒电泳仪k北京六一仪器厂l o凝胶成像
系统 !核酸蛋白测定仪k…¬²2•¤§公司l ∀
2 方法
211 乙醇提取物的制备
取干燥原料 o粉碎 o以 {倍量 zs h乙醇于 {x ε
回流提取 u次kt1x ot «l o合并滤液 o减压浓缩至终
体积约为 w o且无醇味 ∀w sssµ#°¬±pt离心 ts °¬±o
留取上清液 ∀
聚酰胺ktss ∗ uss目l用 |x h乙醇浸泡装柱成 x
¦° ≅ tss ¦°聚酰胺柱 o先用 |x h乙醇洗去醇溶物 o
再用水洗至无醇味 ∀取上述上清液 o石油醚萃取 v
次 o水相上样 o用 x倍柱体积量水洗去未吸附成分 o
再先后用 xs h o|x h乙醇进行洗脱 o收集并合并醇
洗脱液 o蒸去乙醇 o于 p xu ε 冷冻干燥得粗提物 ∀
212 细胞常规培养
≤ƒ2z细胞在含 ts h胎牛血清kƒ…≥l !青霉素
#xu{#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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ktss ˜#°ptl !链霉素ktss Λª#°ptl o‘¤‹≤’vkv1z
ª#ptl的 ⁄∞ 培养液中 ovz ε kx h ≤’u o|x h空
气l o饱和湿度下常规培养 o待细胞生长至 {s h左右
融合 o用胰酶2∞⁄ׄ溶液ks1ux h胰蛋白酶和 s1su h
∞⁄ׄ otΒtl消化 !传代 ∀
213 血清去激素处理≈x 
为免除血清中内源性雌激素的影响 o小牛血清
用葡聚糖包被的活性炭进行了去激素处理 ∀x ª活
性炭水洗 u次后 o加入到溶有 s1x ª葡聚糖k×2zsl的
tss °三蒸水中 o调节 ³‹至 w1u o并于 w ε 搅拌 uw
«∀离心后 o将所得葡聚糖包被的活性炭与 tss °
小牛血清 vz ε 温浴搅拌 t «o滤过 o除菌 o即得去激
素小牛血清 ∀ p us ε 保存 o备用 ∀
214 促细胞增殖实验k∞2≥≤• ∞∞‘法l≈y 
≤ƒ2z细胞以每孔 t ≅ tsw个接种于 uw孔培养
板 o每孔体积 t °o常规培养 u §使细胞完全贴壁 o
更换为实验培养液k无酚红 ⁄∞ 培养液内含 z h
去激素小牛血清l o继续培养 u §后换为含药培养液
k无酚红 ⁄∞ oz h去激素小牛血清和不同浓度受
试药l ∀实验分别设溶剂对照组ks1x h ⁄≥’l o阳
性对照组k∞u os1t ±°²¯#ptl o…≥∞给药组k药物终
浓度为 t ots otss ouss oxss ot sss Λª#°ptl o每组设 v
个复孔 ∀药物作用 y §后 o以 ×× 比色法测定各孔
吸光度k Αl o计算平均 Α和增殖率 k³µ²¯¬©¨µ¤·¬√¨ ©¨2
©¨¦·o°∞l ∀
215 细胞增殖拮抗实验
为验证受试物促 ≤ƒ2z细胞的增殖是否通过
雌激素受体k∞•¶l发生作用 o∞u和 tss Λª#°pt …≥∞
组中同时加入终浓度为 ts ±°²¯#pt的雌激素受体
完全拮抗剂 Œ≤Œt{u oz{s ∀并另设溶剂对照组 !∞u组
和 Œ≤Œt{u oz{skts ±°²¯ #ptl组 o每组设 v个复孔 ∀
培养及检测方法同上 ∀
216 • ×2°≤• 方法分析提取物对雌激素效应基因
³≥u o°• °• ‘„表达的影响
21611 细胞培养和药物处理 ≤ƒ2z细胞以 { ≅
tsx个细胞接种在 xs °塑料培养瓶中 o常规培养 u
§后 o以实验培养液继续培养 ty «后给药 ∀实验设
溶剂对照组 !阳性对照组 !…≥∞各给药组kts otss o
uss Λª#°ptl以及 tss Λª#°pt …≥∞和 ts ±°²¯#pt
Œ≤Œt{u oz{s共存组 o给药 w{ «后收获细胞 ∀
21612 总 °• ‘„提取 利用 ×µ¬½²¯ 试剂提取 • ‘„ o
参照试剂说明书 ∀取上述细胞 o加入 t °×µ¬½²¯ 试
剂裂解细胞 o移入经 s1t h ⁄∞°≤预处理的 ∞³³¨ ±§µ²©
管中 o加 s1u °氯仿 o剧烈振荡 tx ¶o室温放置 u ∗ v
°¬±ow ε tu sss µ#°¬±p t离心 tx °¬±~取上清加入等
体积的异丙醇微混匀 o室温静置 ts °¬± 后 w ε
tu sss µ#°¬±pt离心 x °¬±以沉淀 • ‘„ ∀弃上清 o用
zx h乙醇 t °洗涤沉淀 u次 o挥干乙醇 ∀沉淀用 xs
ˏs1t h ⁄∞°≤ 水溶解 oyx ε 变性 tx °¬±∀通过核
酸蛋白测定仪分别测量 Αuys吸光度和 ΑuysrΑu{s比值
确定总 °• ‘„的浓度和纯度 ∀总 °• ‘„保存在 p {s
ε 低温冰箱中备用 ∀
21613 逆转录k• ×l 逆转录条件 }总 °• ‘„ z ˏo
随机引物 u ˏos1t h ⁄∞°≤水 v ˏo先在 yx ε 变性
tx °¬±~然后在反应体系中加入 w ˏx ≅逆转录缓冲
液kuxs °°²¯ #pt ×µ¬¶2‹≤¯ ~³‹ {1v ovzx °°²¯ #pt
Ž≤¯ ~tx °°²¯#pt ª≤¯ u ~xs °°²¯#pt ⁄××l ov ˏts
°°²¯# pt §‘×° ot ˏ 2∏∂ 逆转录酶 kws ˜#
ˏptl os1x ˏ• ‘„酶抑制剂 o按 ux ε ts °¬±owu ε
t «ozu ε tx °¬±逆转录得到 ¦⁄‘„ ∀
21614 聚合酶链反应k°≤• l 以上述 ¦⁄‘„为模板
扩增目的基因片断 ∀扩增条件 }采用手工热启动
°≤• o即在首轮 |w ε 变性 u °¬±后再加入 u1x ˜ פ´
⁄‘„聚合酶 o然后进行 °≤• 循环k|w ε wx ¶o退火 wx
¶ozu ε wx ¶l o末次循环后 zu ε 延长为 |s ¶ow ε 冷
却保存 ∀各引物序列 o退火温度 o循环次数及扩增产
物长度见表 t ∀ °≤• 反应产物以 t1x h琼脂糖凝胶
电泳 o溴化乙锭染色 oŠ¨ ¯ ⁄²¦usss型凝胶成像系统
观察结果 o以 Β2¤¦·¬±为内参照 o±∏¤±·¬·¼ ’±¨ א w1u1u
k…¬²2•¤§l软件分析条带 ∀
表 t 各引物序列
目的基因 引物序列 退火温度r ε 循环次数 产物长度r¥³
Β2¤¦·¬± ˜³xχ2׊„≤ŠŠŠŠ×≤„≤≤≤„≤„≤׊׊≤≤≤„×≤ׄ2vχ xy qt uy yys
⁄²º± xχ2≤ׄŠ„„Š≤„××׊≤ŠŠ×ŠŠ„≤Š„׊Š„ŠŠŠ2vχ
³≥u ˜³xχ2׊Š„Š„„≤„„ŠŠ×Š„×≤׊≤2vχ xy qt uy v{u
⁄²º± xχ2„×≤׊׊×׊׊„Š≤≤Š„ŠŠ2vχ
°• ˜³xχ2„Š×׊׊„Š„Š≤„≤׊Š„׊≤2vχ x| qx vs wzx
⁄²º± xχ2Š„×≤׊≤≤„≤„׊Š×„„ŠŠ≤2vχ
#yu{#
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217 数据分析
°∞k h l €实验组 Αr溶剂对照组 Α≅ tss h
所有实验至少重复 v次 o所得结果以 cξ ? σ表
示 ∀采用 τ2·¨¶·对数据进行统计学分析 ∀
3 结果
311 对 ≤ƒ2z细胞株增殖的影响
≤ƒ2z细胞表达 ∞•¶o能特异性地受雌激素或
雌激素样活性物质调节而增殖 ∀计算各组的增殖
率 o见表 u o与 ∞u类似 o…≥∞在 ts ∗ uss Λª#°pt含量
时 o有显著促进 ≤ƒ2z细胞增殖作用 otss Λª#°pt
达到最大k°∞为 twz1{| h l o与溶剂对照组比较有显
著性差异k Π s1stl ∀
表 u …≥∞对  ≤ƒ2z细胞增殖的影响kcξ ? σ, ν € vl
组 别 Α 增殖率r h
⁄≥’ks1x h l s qs|w ? s qsu tss qss
∞uks qt ±°²¯#ptl s qtxz ? s qsvul tyy qsz
…≥∞kt Λª#°ptl s qs{z ? s qsu |u quw
kts Λª#°ptl s qtts ? s qsstl tty q{v
ktss Λª#°ptl s qtws ? s qswul twz q{|
kuss Λª#°ptl s qttx ? s qsutl tuu qst
kxss Λª#°ptl s qts{ ? s qsu ttw qst
kt sss Λª#°ptl s qttv ? s qst tt| qtu
注 }与溶剂对照组比较tl Π s1sx oul Π s1st
312 细胞增殖拮抗实验
Œ≤Œt{u oz{s为一种实验用雌激素受体完全拮抗
剂 o能完全阻断 ∞u等雌激素样物质由 ∞•¶介导的一
系列生物效应 o包括促增殖作用 ∀tss Λª#°pt…≥∞
诱导 ≤ƒ2z细胞增殖作用能被 ts ±°²¯#pt Œ≤Œt{u o
z{s完全拮抗 ∀与同浓度无拮抗剂组比较 o当与
Œ≤Œt{u oz{s 共孵育时 o其增殖率显著降低 k Π 
s1stl o此作用与阻断 ∞u组ks1t ±°²¯#ptl类似 ∀
313 对雌激素效应基因 ³≥u o°• °• ‘„表达的影响
利用 • ×2°≤• 法分析黑大豆乙醇提取物对 ≤ƒ2
z细胞 ³≥u o°• °• ‘„表达的影响 o并以与 Β2¤¦·¬±表
达量的比值进行半定量分析 ∀如图 t所示 o°≤• 产
物分别为 Β2¤¦·¬± yys ¥³o³≥uv{u ¥³o°• wzx ¥³∀与溶
剂对照组比较 o…≥∞能明显诱导 ³≥u o°• 基因 °• ‘„
的表达水平k Π s1stl o并与药物含量有一定相关
性 o在 tss Λª#°pt时 o其增加 ³≥u o°• 基因 °• ‘„分
别为溶剂组的kt1vw ? s1t|l倍≈∞u组为kt1yy ? s1uxl
倍 和ku1ss ? s1ttl倍≈∞u组为ku1t{ ? s1tsl倍  ∀以
上诱导作用均能被 Œ≤Œt{u oz{s完全抑制 ∀
4 讨论
∞2≥≤• ∞∞‘法是一种非常经典的体外评价化合

图 t ³≥u o°• 基因扩增的电泳结果
1 对照 ~t1 溶剂对照组 ~u1 阳性对照组 ~v1 ts Λª#°pt
…≥∞组 ~w1 tss Λª#°pt…≥∞组 ~x1 uss Λª#°pt…≥∞组 ~
y1 tss Λª#°pt…≥∞n ts ±°²¯#pt Œ≤Œt{u oz{s组
物雌激素样活性的方法 o由 ≤ƒ2z细胞生物学行为
特征作为评价指标≈z  ∀其中 ≤ƒ2z细胞是 ∞•Α阳
性的人乳腺癌细胞株 o能特异性地受雌激素或雌激
素样活性物质调节而增殖 ∀ ≤ƒ2z细胞雌激素样增
殖试验非常灵敏 o简便易行 o还可区分激动剂和拮抗
剂 o因而被广泛应用于快速筛选和评价环境雌激素
和植物雌激素≈{ o|  ∀植物雌激素还可因剂量及机体
的甾体激素状态不同而发挥拟雌激素作用或抗雌激
素作用 ∀研究结果显示 o…≥∞能在去激素培养条件
下显著促进 ≤ƒ2z细胞的增殖 o此作用与 ∞u作用相
同 o表明 …≥∞具有雌激素样作用 ∀且实验中发现
…≥∞在 tss Λª#°pt时促增殖作用最强 o可能与高含
量的 …≥∞表现出抗雌激素作用有关 ∀
Œ≤Œt{u oz{s作为一种实验用雌激素受体完全拮
抗剂 o能完全阻断 ∞u等雌激素样物质由 ∞•¶介导的
一系列生物效应 o包括促增殖作用≈ts  o故被选作工
具药来探讨提取物雌激素样作用的机制 ∀实验中设
计了提取物与雌激素受体拮抗剂共孵育 o来观察效
应的变化 ∀结果发现 o…≥∞的诱导 ≤ƒ2z细胞增殖
作用能被 Œ≤Œt{u oz{s完全拮抗 ∀在 Œ≤Œt{u oz{s存在
时 o其相对增殖率降至溶剂对照组的水平 o此作用与
阻断 ∞u类似 o提示其促 ≤ƒ2z细胞增殖作用是通过
∞•¶所介导的 ∀
另外 o雌激素受体k∞•¶l所介导的分子机制表
明≈tt  o配体与 ∞•¶特异性地结合形成 ∞•¶与雌激素
复合物 o与位于目标基因启动区的雌激素反应元件
k∞• ∞l相互作用 o调控雌激素反应性目标基因的转
录活性 o从而调节目标基因的 °• ‘„表达 o最终调节
目标基因蛋白水平的表达 ∀定量分析这些内源性基
因的表达水平可用于评价化合物的拟雌激素活性 o
#zu{#
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目标基因的 °• ‘„水平和蛋白水平都可作为检测的
终点≈tu2tw  ∀因此进一步选用 ³≥u和 °• 两个雌激素
效应基因 o通过观察受试物处理 ≤ƒ2z细胞后 °•2
‘„水平表达的差异 o来验证提取物雌激素样作用经
∞•¶介导的机制 ∀ • ×2°≤• 分析结果表明 o与溶剂对
照组比较 o黑大豆乙醇提取物与 ∞u一样能显著诱导
³≥u o°• 基因 °• ‘„的表达水平 o且这种诱导作用能
被 Œ≤Œt{u oz{s完全抑制 ∀提示了有雌激素样作用的
…≥∞通过 ∞•¶途径调控了 ³≥u o°• 基因的表达 ∀
因此 o本研究发现黑大豆乙醇提取物能通过
∞•¶介导而发挥弱雌激素样作用 o为黑大豆药用价
值的揭示提供了强有力的理论依据 ∀
≈参考文献 
≈t  中国药典 q一部 qusss quy| q
≈u  刘丽君 o高明杰 o吴俊江 o等 q黑大豆的综合利用与开发 q黑
龙江农业科学 ot||| ow }wv q
≈v  李 琳 o钱忠明 q大豆异黄酮的药理作用和保健功能的研究
进展 q中国药学杂志 oussu ovzktsl }zuw q
≈w  …¤µ±¨ ¶≥ q≥²¼¬¶²©¯¤√²±¨ ¶) ) ) ³«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ±¶¤±§º«¤·¨ ¶¯¨ ‚ ϑ Νυτρ,
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Εστρογενιχ αχτιϖιτψ ανδ ιτσ µεχηανισµ οφ ετηανολ εξτραχτ φροµ βλαχκ σοψβεαν
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(t . Χολλεγε οφ Πηαρµαχευτιχαλ Σχιενχεσ , Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ, Ηανγζηου vtssvt , Χηινα ;
u . Τηε Φιρστ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλ, Χολλεγε οφ Μεδιχινε , Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ, Ηανγζηου vtsssv , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ¬¨³¯²µ¨ ·«¨ ¶¨·µ²ª¨ ±¬¦¤¦·¬√¬·¼ ¤±§¬·¶° ¦¨«¤±¬¶° ²© ·¨«¤±²¯ ¬¨·µ¤¦·©µ²° ¥¯¤¦®¶²¼¥¨¤± k…≥∞l q Μετηοδ :
׫¨ °²§¬©¬¨§ ≤ƒ2z ¦¨¯¯ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ¤¶¶¤¼ º¤¶∏¶¨§·² √¨¤¯∏¤·¨·«¨ ¶¨·µ²ª¨ ±¬¦¤¦·¬√¬·¼ ²©…≥∞q„±§·«¨ ³²¶¶¬¥¯¨ ° ¦¨«¤±¬¶°¶º µ¨¨ ¤§§µ¨¶¶¨§
∏¶¬±ª • ×2°≤• ° ¤¨¶∏µ¨° ±¨·¶¬± º«¬¦«³∏µ¨ ¶¨·µ²ª¨ ± µ¨¦¨³·²µ¤±·¤ª²±¬¶·Œ≤Œt{u oz{s º¤¶ °¨³¯²¼¨ §¤¶¤·²²¯ qΡεσυλτ : ׫¨ ¶¨·µ²ª¨ ±¬¦¤¦·¬√¬·¼ ²©
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≈责任编辑 方文贤 
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第 vt卷第 ts期
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中 国 中 药 杂 志
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