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Influence of Naomai Ⅱ capsule on dynamic expression of protease-activated receptors-1 after acute intracerebral hemorrhage

脑脉Ⅱ号胶囊对急性脑出血大鼠PAR-1动态表达的影响



全 文 :Εστρογενιχιτψ οφ αδζυκι βεαν Πηασεολυσ ανγυλαρισ ωιγητ1 ανδ ιτσ εφφεχτ ον
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( Φιρστ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλ, Χολλεγε οφ Μεδιχινε , Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ, Ηανγζηου vtsssv , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ¬¨³¯²µ¨ ·«¨ ¶¨·µ²ª¨ ±¬¦¤¦·¬√¬·¼ ²© ·¨«¤±²¯ ¬¨·µ¤¦·©µ²° ¤§½∏®¬¥¨¤± Πηασεολυσ ανγυλαρι󤱧¬·¶ ©¨©¨¦·²± ³µ²2
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[ Κεψ ωορδσ] ¤§½∏®¬¥¨¤±~ ¶¨·µ²ª¨ ±¬¦¤¦·¬√¬·¼~ ≤ƒ2z ¦¨¯¯ ~³µ²¨ ¶·¨µ²±¨ µ¨¦¨³·²µ
≈责任编辑 古云侠 
≈收稿日期  ussx2s|2tz
≈基金项目  浙江省中医药管理局中西医结合脑血管病重点建设专科项目kussx2uss{l
≈通讯作者  3郑国庆 oר¯ }ksxzzl{{{z|twy o∞2°¤¬¯}ª´ ½«¨ ±ªƒ ¶¬±¤q¦²°
脑脉 µ号胶囊对急性脑出血大鼠 °„•2t
动态表达的影响
郑国庆t 3 o黄培新u
kt1 温州医学院 附属第二医院 o浙江 温州 vuxsuz ~
u1 广东省中医院 o广东 广州 xtustsl
≈摘要  目的 }探讨急性脑出血后蛋白酶激活的受体k°„•2tl的动态表达及脑脉 µ号胶囊k‘≤ µl的干预作
用 ∀方法 }将 zu只大鼠随机分为 |组k ν € {l o即正常组 !脑出血模型 y ouw «ov oz §组和 ‘≤ŒŒ y ouw «ov oz §组 ∀用
º 2≥型胶原酶诱导大鼠脑出血模型 ∀免疫组化方法测定各时间点大鼠脑出血后血肿周围水肿组织 °„•2t蛋白的
表达 ~• ×2°≤• 检测 °„•2t °• ‘„的表达 ∀结果 }正常组大鼠脑出血后可见有 °„•2t°• ‘„和 °„•2t蛋白表达 o模型
组大鼠脑出血后 y «表达明显增多 ouw «进一步增多 o于 v §时达到高峰 oz §时表达明显减少 ∀在 y ouw «ov oz §各
时间点 o模型组 !‘≤ŒŒ组 °„•2t °• ‘„吸光度及 °„•2t阳性细胞数升高 o与正常组比较均有显著性差异k Π s1sx
或 Π s1stl o‘≤ŒŒ组 °„•2t阳性细胞数 !°„•2t °• ‘„吸光度比值降低 o与模型组比较各时间点均有显著性差异
k Π s1sx或 Π s1stl ∀结论 }脑出血后 °„•2t受到凝血酶的持续活化 o脑出血后凝血酶的作用可能是通过 °„•2t
介导的 ~‘≤ŒŒ可抑制 °„•2t的表达 o这可能是其治疗学机制之一 ∀
≈关键词  急性脑出血 ~脑脉 µ号胶囊 ~凝血酶 ~蛋白酶激活受体2t
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第 vt卷第 tx期
ussy年 {月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tx
„∏ª∏¶·oussy
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltx2tuyx2sw
脑出血kŒ≤‹l后神经功能恶化的最重要的原因是
脑水肿的进展 !血肿周边神经细胞和轴突的损害及血
肿的扩大 o尤其脑水肿是Œ≤‹患者病情恶化和死亡的
主要原因 ∀新近的研究表明 o脑血肿的血凝块所产生
的凝血酶在这些过程中起了关键作用≈t  ∀已有研究
表明 o凝血酶的许多血管外效应是通过蛋白酶激活的
受体k°„•¶l介导的 o其中 °„•2t起主要作用 o但凝血
酶引起脑水肿和破坏血脑屏障的机制尚未清楚 ∀脑
脉µ号胶囊k‘≤µl是广东省中医院院内制剂 o国家科
技部/九五0≈u  o/十五0攻关高血压脑出血急性期主要
用药之一 o且前期临床研究表明 o其可加速高血压性
脑出血颅内血肿的吸收 o提高临床疗效≈v  o但其作用
机制和环节尚未阐明 ∀本研究旨在研究脑出血后
°„•2t的表达及其动态演变 o探讨凝血酶引起脑水肿
的机制 o以及 ‘≤ µ的干预作用 ∀
1 材料
111 药物
脑脉 µ号胶囊由人工牛黄 o虎杖 o益母草 o龙胆
草 o水蛭 o水牛角等药组成 o质量标准见文献≈w  ∀
112 动物
清洁级 •¬¶·¤µ大鼠 o雄性 o体重 uss ∗ uxs ªo广
州中医药大学动物实验中心提供 ∀
113 试剂及仪器
羊抗 °„•2t 抗体为 ≥¤±·¤ ≤µ∏½¨ 公司产品k≥≤2
{usul ~通用≥„…n Ž¬·r‹• ° o兔r鼠r羊k⁄„…n l试剂
盒为美国 ⁄¤®²公司产品kŽsyz|ttl ∀ °• ‘„提取试
剂盒k×µ¬½²¯l o胶原酶 º 2≥ o美国 ≥¬ª°¤公司 ∀ „ ∂ 一
步法 • ×2°≤• 试剂盒k上海生工生物工程技术服务
有限公司l ∀
2 方法
211 Œ≤‹大鼠模型的建立
采用任泽光等≈x 报道的 Œ≤‹ 模型复制方法 o注
射含 s1x ˜#ˏpt胶原酶 º 2≥ 的生理盐水 t1x ˜#
ˏpt复制 ∀正常组 }切开头皮 o然后缝合 ∀
212 分组与给药
将 zu只大鼠随机分为 |组 o每组 {只 o均术前 v
§开始灌胃给药 o每日 t 次 ∀正常组 }灌服蒸馏水
u1s °~脑出血模型 y ouw «ov oz §组 }灌服蒸馏水
u1s °~‘≤ŒŒ组 }按 t °t1{{ ª#®ªpt#§pt¬ª‘≤ŒŒ
溶液 o不足部分加蒸馏水至 u1s °∀
213 观察指标与方法
21311 °„•2t °• ‘„测定 各组动物在规定的各时
间点 o快速取脑 o放在 p zs ε 冰箱保存待测 ∀采用
异硫氰酸胍一步法 o提取大鼠大脑总 • ‘„ o紫外分
光光度计测定样品在 uys ±°和 u{s ±°的吸光度
kΑl o确定 • ‘„ 的质量 ∀按 t Αuys € ws Λª • ‘„ 计算
• ‘„ 的产率 ~ΑuysrΑu{s在 t1{ ∗ u1s视为抽提的 • ‘„
纯度很高 ~进行 t h琼脂糖凝胶电泳 o确定抽提脑总
• ‘„的完整性和 ⁄‘„ 的污染情况 ∀电泳条件 }|s
∂ owx °¬±∀
采用 „∂ 一步法 • ×2°≤• 试剂盒 o测定大鼠脑
°„•2t基因表达 }反应总体积为 xs ˏo根据文献≈y 
设计如下 °„•2t引物序列 }¶¨±¶¨ oxχ„≤ׄ×××≤×≤≤Š≤2
≤××≤×≤≤Š≤≤„× vχo¤±·¬¶¨±¶¨ oxχ ×≤„≤Š≤„Š„≤Š≤„2
Š„ŠŠ„ŠŠ„ŠŠ×„„Š≤ vχo片段长度 uzv ¥³∀内标 Β2
¤¦·¬±为参比对照 o上游 }xχ2××≤≤„Š≤≤××≤≤××≤≤׊Š2
vχo下游 }xχ2×׊≤Š≤×≤„ŠŠ„ŠŠ„Š≤„„×2vχ ∀操作流
程 }加 u ≅ • ×2°≤• …∏©©¨µ!模板 • ‘„ !大鼠 °„• 正义
及反义引物 !大鼠 Β2¤¦·¬±正义及反义引物 !• ×rפ´
¬¬倒置于冰上的小离心管中 ~轻轻混匀后 o稍加离
心 o然后在 °∞p |yss基因扩增仪上进行 • ×2°≤• 热
循环扩增 }vz ε ¦⁄‘„合成 vs °¬±~|w ε 预变性 x
°¬±ot个循环 ~|w ε 变性 vs ¶ox{ ε 变性 vs ¶ozu ε
延伸 t °¬±ovx个循环 ~zu ε 延伸 x °¬±ot个循环 ~
电泳 }取扩增产物 ts ˏ点样于 t1x h 琼脂糖凝胶
板 o在 ⁄ƒ2⁄电泳仪上进行恒压电泳分析 o电泳条
件 }tss ∂ ovs °¬±∀半定量测定 }紫外灯下观察 !电脑
照相储存 o在 …Œ’2• „⁄凝胶一次性成像系统上定性
分析及用 ²¯ ¦¨∏¯¤µ„±¤¯¼¶·×软件进行吸光度半定量
分析 ∀
21312 °„•2t蛋白检测 各组大鼠在出血后不同
时间点给予水合氯醛深度麻醉 o迅速打开胸腔 o经左
心室灌注磷酸盐缓冲生理盐水k°…≥ s1st °²¯#pt o
³‹ z1wlxs °冲洗血管 o继之以 uss °磷酸缓冲液
k°…≥ s1st °²¯#pt o³‹ z1wl配制的含 w h多聚甲醛
固定液灌注固定脑组织 o断头取脑 o置于中性福尔马
林中固定 ∀标本经脱水 o石蜡包埋 o在切片机上连续
切片 o片厚 v Λ° o作免疫组化染色 ∀按试剂公司推
荐三步法操作 ∀为确保实验结果的真实性和客观
性 o染色结果判定由专人单盲阅片 ∀ °…≥代替一抗
#yyut#
第 vt卷第 tx期
ussy年 {月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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„∏ª∏¶·oussy
作空白对照 o用已知阳性标本作阳性对照 ∀在
’¯ ¼°³∏¶≤‹u型显微镜kts ≅ usl下 o随机取每张脑片
y个不重叠视野 o计数 °„•2t阳性细胞数 o取 cξ ? σ
为 t只大鼠的结果 ∀
214 数据统计
计量资料以 cξ ? σ表示 o组间均值的比较采用 τ
检验 ∀
3 结果
311 脑出血后 °„•2t °• ‘„的表达
正常组大鼠脑出血后可见有 °„•2t °• ‘„ 表
达 o模型组大鼠脑出血后 y «°„•2t °• ‘„表达明显
增多 ouw « °„•2t °• ‘„表达进一步增多 o于 v §时
达到高峰 oz §组 °„•2t °• ‘„表达明显减少 ∀统计
结果表明 }在 y ouw «ov oz §各时间点 o模型组 !‘≤ŒŒ
组 °„•2t °• ‘„吸光度升高与正常组比较均有显著
性差异k Π s1stl o模型组 °„•2t °• ‘„表达的吸光
度自 y «已明显升高 ouw «进一步升高 ov §时 °„•2t
°• ‘„表达达到了高峰 o在 z §时吸光度值逐渐减
弱 ∀‘≤ŒŒ组 °„•2t °• ‘„吸光度降低与模型组比
较各时间点均有显著性差异k Π s1st o表 tl ∀
表 t 脑脉 µ号胶囊对急性脑出血大鼠 °„•2t °• ‘„表达k Αl的影响kcξ ? σ, ν € yl
分组
剂量
rª#®ªpt
°„•2t °• ‘„表达
y « uw « v § z §
正常对照 p s qux ? s qsx s qux ? s qsx s qux ? s qsx s qux ? s qsx
模型对照 p s qxu ? s qswul s qzv ? s qswul s q|w ? s qsvul s qwv ? s qswul
脑脉 µ号 t q{{ s qww ? s qsvt oul s qx{ ? s qsxt oul s qzy ? s qsyt oul s qvw ? s qsxt oul
注 }与模型组比较tl Π s qst ~与正常对照组比较ul Π s qst
312 脑出血后 °„•2t蛋白的表达
°„•2t蛋白的表达阳性细胞染色主要在胞膜 !
胞浆 o可清楚分辨胞核的形态 ∀正常大鼠大脑 °„•2
t蛋白表达轻度阳性 o模型 y «组 °„•2t表达强度
开始增强 ouw «组 °„•2t表达进一步增加 ov §组染
色反应最为强烈 o阳性细胞染色较深 o阳性细胞的数
量达到高峰 o然后开始下降 oz §组时明显下降 o向正
常对照组水平靠近 ∀统计结果表明 }在 y ouw «ov oz
§各时间点 o模型组 !‘≤ŒŒ组 °„•2t阳性细胞数升
高与正常组比较均有显著性差异k Π s1st或 Π
s1sxl o‘≤ŒŒ组 °„•2t阳性细胞数降低与模型组比
较均有显著性差异k Π s1st或 Π s1sx o表 ul ∀
表 u 脑脉 µ号胶囊对急性脑出血大鼠 °„•2t阳性细胞数的影响kcξ ? σ, ν € yl
分组
剂量
rª#®ªpt
°„•2t阳性细胞数变化
y « uw « v § z §
正常对照 p ty qss ? x qsy ty qss ? x qsy ty qss ? x qsy ty qss ? x qsy
模型对照 p z| q{v ? tu qvxwl t{v qss ? tu qyswl u|v qyz ? uw qwvwl xw qtz ? tv qyzvl
脑脉 µ号 t q{{ xu qss ? y qtvu owl tuv q{ ? | qvvu owl uts qx ? tv q{uu owl vs qyz ? y qu{v otl
注 }与模型组比较tl Π s qsx oul Π s qst ~与正常对照组比较vl Π s qsx owl Π s qst
4 讨论
新近研究表明 o凝血酶在脑出血后脑水肿的发
生中起关键的作用 o早期脑水肿k出血 uw «以内l是
由于凝血酶对脑细胞的毒性作用 o后期k出血 uw «
以后l则是由于凝血酶造成的血脑屏障破坏 o但其形
成机制亦尚未完全阐明 ∀近 us年来 o凝血酶的许多
血管外效应得到明确 o这些效应是通过 °„•¶家族
介导的 o°„•¶包括 w种 }其中 °„•2tk起主要作用l o
°„•2v和 °„•2w是凝血酶受体 o°„•2u是胰酶受体 o
血管外凝血酶在调节脑缺血 !脑出血和脑外伤损害
中的重要性近来已变得清晰≈z  ∀本研究结果表明 o
脑出血后脑组织 °„•2t表达增加 o提示 °„•2t高表
达可能介导了脑出血后神经损伤的过程 o且 °„•2t
的表达高峰与脑水肿的高峰一致 o均在脑出血 v §
左右 oz §仍未达正常 ∀因此 o凝血酶可能通过受体
途径激活神经元 !胶质细胞使之产生并释放大量的
细胞因子及毒性物质而损伤血脑屏障 ~而 °„•2t的
激活不仅是脑出血后脑水肿产生的始动因素 o而且
参与了脑水肿的发展过程 ∀
脑出血多急性起病 o临床多表现为阳热之候 o即
使病初无明显阳热表现 o亦很快转化为一派阳热之
象 ∀此乃风火痰瘀交阻脑髓 !闭阻神明清窍 o脑神被
扰 o甚至神昏 ∀因此 o对于脑出血阳热证患者 o有清
热平肝 !破瘀涤痰 !通腑醒神之共通治法 ∀ ‘≤ŒŒ方
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第 vt卷第 tx期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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中人工牛黄粉清肝熄风 !涤痰开窍 o水牛角清热凉
血 !安神定惊 o共为君药 ~配以龙胆草苦寒 o增强君药
之清肝泻火之功 o以直折火邪 o虎杖清热通腑 o又有
祛瘀生新之功效 o共为臣药 ~君臣诸药合用 o使痰热
得清 o风阳平熄 o气血得和 o切中病机 ~用水蛭 !益母
草活血破瘀 o其中水蛭逐瘀之力尤著 o二者合用以散
脑髓之瘀结 o以上共为佐使药 ∀初步药效学研究显
示 o‘≤ µ可显著改善高血压性脑出血大鼠脑血管
通透性 !减少脑组织含水量 !改善模型鼠神经症状 o
减少模型鼠大脑出血现象≈{  ∀本研究的结果表明 o
‘≤ µ可抑制 °„•2t活化 o这可能是 ‘≤ µ的主要
治疗机制之一 ∀同时 o‘≤ µ对脑出血 y ouw «ov oz §
各时间点均有作用 ∀考虑到脑脊液循环比血液循环
慢 o此外 o凝血酶能形成稳定的复合体 o从脑血肿缓
慢释放超过数周 ∀基于上述原因 o凝血酶的消除在
脑和脑脊液是非常缓慢的 ∀ ‘≤ µ抑制凝血酶受体
活化可能持续更长时间 o有待对更长的时间点作进
一步的研究 ∀
≈参考文献 
≈t  ¤·¶∏²®¤ ‹ o ‹¤°¤§¤ • q • ²¯¨²©·«µ²°¥¬±¬± ≤‘≥ §¤°¤ª¨ ¤¶¶²¦¬¤·¨§
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√ ±¨·¬²±q≤‘≥ ⁄µ∏ª¶oussu otyk{l }xs| q
≈u  刘茂才 o黄 燕 o杜宝新 o等 q中西医结合综合救治高血压性
中 !大量脑出血 ust例临床研究 q广州中医药大学学报 ousst o
t{ktl }tv q
≈v  杜宝新 o黄 燕 o黄培新 o等 q脑脉 u号胶囊对脑出血颅内血肿
吸收的影响 q广西中医学院学报 ousss otzkul }{ q
≈w  赵瑞芝 o丘小惠 o刘茂才 q脑脉 ŒŒ号胶囊鉴别和含量测定方法
的研究 q中国现代应用药学杂志 ousst ot{kvl }uuz q
≈x  任泽光 o吴建中 q大鼠脑出血模型 q中华神经外科杂志 ot||v o
|kwl }usx q
≈y  «²±ª ≤ o ‹¤¼½¨ µ⁄o≤²µ¶²±  „ o ·¨¤¯ q ²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ª²©·«¨ µ¤·
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·¬²± ¥¼ ¥¤¶¬¦©¬¥µ²¥¯¤¶·ªµ²º·«©¤¦·²µq …¬²¯ ≤«¨ ° ot||u ouyzkuwl }
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≈z  ÷¬Š o• ¬¨¶¨µŠ oŽ¨ ³¨ • ƒ q׫¨ µ²¯¨²©·«µ²°¥¬± ¤±§·«µ²°¥¬±µ¨¦¨³2
·²µ¶¬±¬¶¦«¨ °¬¦o«¨ °²µµ«¤ª¬¦¤±§·µ¤∏°¤·¬¦¥µ¤¬±¬±­∏µ¼}§¨¯¨ ·¨µ¬²∏¶²µ
³µ²·¨¦·¬√¨q ‘¨∏µ²¦«¨ ° oussv o{wktl }v q
≈{  刘茂才 o黄 燕 o刘晓俊 o等 q急性脑血管病 q见 }黄培新 o刘
茂才 q中医专科专病临床诊治丛书#神经科专病临床诊治 q北
京 }人民卫生出版社 ousss }wsz q
Ινφλυενχε οφ Ναοµαι µ χαπσυλε ον δψναµιχ εξπρεσσιον οφ προτεασε2αχτιϖατεδ
ρεχεπτορσ2t αφτερ αχυτειντραχερεβραλ ηεµ ορρηαγε
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(t . Χεντερ οφ Νευρολογψ, Σεχονδ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλ οφ Ωενζηου Μεδιχαλ Χολλεγε , Ωενζηου vuxsuz , Χηινα ;
u . Νευρολογψ ∆επαρτµεντ , Γυανγδονγ Προϖινχιαλ Ηοσπιταλ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Γυανγζηου xtusts , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ §¼±¤°¬¦ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©³µ²·¨¤¶¨2¤¦·¬√¤·¨§µ¨¦¨³·²µ2tk°„•2tl ¤©·¨µ¤¦∏·¨¬±·µ¤¦¨µ¨¥µ¤¯ «¨ °²µµ«¤ª¨
kŒ≤‹l ¤±§·«¨ ¬±©¯∏¨ ±¦¨ ²©‘¤²°¤¬¦¤³¶∏¯¨k‘≤ µl ²±·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬±µ¤·¶q Μετηοδ : zu µ¤·¶º µ¨¨ µ¤±§²°¯ ¼ §¬√¬§¨§¬±·²| ªµ²∏³¶k ν €
{ ¬± ¤¨¦«ªµ²∏³l q׫¨ ¼ º µ¨¨ ±²µ°¤¯ ªµ²∏³oŒ≤‹ °²§¨¯ªµ²∏³¶¤·y ouw «ov oz §¤±§‘≤ µ ªµ²∏³¶¤·y ouw «ov oz §qŒ≤‹ °²§¨ ¶¯º µ¨¨
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°„•2t°• ‘„ ¬± ¥µ¤¬±·¬¶¶∏¨ ¤µ²∏±§·«¨ «¤¨ °¤·²°¤¤·§¬©©¨µ¨±·ªµ²∏³¶qΡεσυλτ : °„•2t ³µ²·¨¬±¤±§°• ‘„ º µ¨¨ °¬¯§³²¶¬·¬√¨¬± ±²µ°¤¯ ªµ²∏³q
Œ± °²§¨¯ªµ²∏³¶o¬±·¨±¶¬·¼ ²©°„•2t ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¶·¤µ·¨§·² ±¨«¤±¦¨ ¤·y «o¤±§ ±¨«¤±¦¨§°²µ¨ ¤·uw «q°„•2t ¬¨³µ¨¶¶¬²± µ¨¤¦«¨ §·«¨ ³¨ ¤®¤·
v §¤±§¥¨ª¤±·² §¨¶¦¨±§q„·z §·«¨ §¨ ¦¨±·º¤¶²¥√¬²∏¶q„·y ouw «ov oz §·¬°¨³²¬±·1 ׫¨ °„•2t ³µ²·¨¬± ³²¶¬·¬√¨¦¨¯¯ ±∏°¥¨µ¤±§°„•2
t °• ‘„ ¤¥¶²µ¥¤±¦¨ µ¤·¬²¬±Œ≤‹ °²§¨¯¤±§‘≤ µ ªµ²∏³¶º µ¨¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ «¬ª«¨µ·«¤±·«²¶¨ ¬± ±²µ°¤¯ ªµ²∏³k Π s1sx ²µΠ s1stl q׫¨
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≈责任编辑 古云侠 
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第 vt卷第 tx期
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中 国 中 药 杂 志
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