全 文 ：小毛茛内酯影响耐药结核患者外周血淋巴细胞
≥≥°和 ≥表达的研究
詹 莉t o戴华成u o杨治平v o易著文t o成诗明w
kt q中南大学 湘雅二医院 o湖南 长沙 wtsstt ~
u q美国新泽西医学 !牙学医学院 药物分子生物学研究所 ~
v q湖南农业大学 植物科学研究院 o湖南 长沙 wtstu{ ~
w q湖南省结核病防治所 o湖南 长沙 wtsssyl
≈摘要 目的 }研究小毛茛内酯k× µ¨±¤·²¯¬§¨ o× µ¨±l抗人 °
内结核休眠菌感染的分子免疫学机理 ∀方法 }用
× µ¨± uss °ª#p t体外分别培养 °
uw ovy ow{ oys ozu o{w «后 o采用 °≤ 方法检测 {w 例耐药 !多耐药结核患者体
外 °
内结核菌小热休克蛋白kty ⁄¤ ≥≥°l基因的表达 ~采用反转录聚合酶链反应半定量k± ≤2 ×2°≤ l方法 o
测定其 °
内颗粒裂解肽 kµ¤±∏¯¼¶¬± o≥l ° 的表达 ∀结果 }× µ¨±能显著减少耐药结核患者 °
内结核菌
ty ⁄¤≥≥°基因拷贝表达量k Π s qsstl o这种表达减少与培养时间成正比 ~同时显著增加了 °
≥ ° 的
表达水平k Π s qsstl ∀结论 }× µ¨±可能通过减少结核休眠菌 ty⁄¤ ≥≥°的表达 o激活休眠菌的同时促进 ≥
° 高水平的表达 o增强机体 ≤ ×杀菌能力 o达到抗耐药的作用 ∀
≈关键词 小毛茛内酯 ~颗粒裂解肽 ~结核 ~休眠菌 ~ty⁄¤ ≥≥°
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussuls|2syzz2sv
猫爪草 Ραδιξ Ρανυνχυλι Τερνατι系毛茛科植
物小毛茛 Ρανυχυλυσ Φερνατυσ ׫∏±¥q的干燥块根 o
在中医临床上用于治疗肺结核 !颈淋巴结结核 !咽喉
炎 !肿瘤等 ∀小毛莨内酯k·¨µ±¤·²¯¬§¨ o× µ¨±l是从猫
爪草中分离提取的一种 ∆2内脂类化合物 o鉴定为 Χ2
酮2∆2戍内酯kΧ2®¨ ·²2∆2√¤¯ µ¨²¯¤¦·¬²±¨ l≈t o其抗结核菌
k ×
l的机理尚未见报道 ∀本研究观察了 × µ¨±对
{w例耐药 !多耐药结核患者周围血淋巴细胞k° 2¨
µ¬³«¨µ¤¯ ¥¯²²§ ¼¯°³«²¦¼·¨¶o °
l中结核菌 ty⁄¤
小热休克蛋白 kty⁄¤ ≥°¤¯¯ «¨ ¤·¶«²¦® ³µ²·¨¬±o
ty⁄¤≥≥°l基因表达及与 °
颗粒裂解肽kªµ¤±2
∏¯¼¶¬±o ≥l ° 表达的相关关系 o旨在探索
× µ¨±抗结核休眠菌k§²µ°¤±··∏¥¨µ¦¯¨ ¥¤¦¬¯¯¬o ⁄×
l
作用的分子免疫学机理 ∀
1 材料和方法
1 q1 靶细胞 °
采集的试验对象 标本取自 t|||
≈收稿日期 usst2s{2s{
≈基金项目 国家自然科学基金资助项目 kv|vsstv| ~
v|yzsvvw ~v||zsvuyl
≈通讯作者 电话 }kszvtl xxuwuuuu2uvss 传真 }kszvtl
uuv{zty ∞2°¤¬¯}½¯ §²¦·²µ ³∏¥¯¬¦q¦¶q«±
年 x月至 usss年 v月长沙市就诊的 {w例肺结核患
者 o经至少 t 个疗程以上全程联合化疗后痰菌培养
阳性 o药敏试验示结核杆菌至少对异烟肼或利福平
耐药者 xy 例 ~或至少对异烟肼和利福平耐药k多耐
药l者 u{ 例 ∀
1 q2 药物 猫爪草k购自湖南省医药公司l经湖南
中医学院药学院中药鉴定室周天达教授鉴定系小毛
茛块根 ∀ × µ¨±由本课题组改进文献≈t 方法从猫爪
草提取分离 ∀化合物为白色针状晶 o°³ tsv ∗ tsx
ε o分子量为 ttw o分子式 ≤x y v o结构式
1 q3 患者 °
中结核菌 ⁄ 的提取 参照文献
≈u ∀
1 q4 结核菌 ty2⁄¤ ≥≥°基因的 °≤ 检测 引
物 设 计 } °µ¬° µ¨t x . 2× ≤≤ ≤≤ ≤≤≤ × × ≤≤≤
×2v . ~ °µ¬° µ¨u x . 2≤ × × × ≤≤ ×
≤ × 2v. ~°≤ 扩增条件参照文献≈v ∀
1 q5 人 °
细胞的获得 !体外培养和活化 {w 例
标本随机分为 z 种体外培养组合设计 ∀ ²qt 培养
前为对照组 o²qu ∗ ²qz 组体外活化条件均用
#zzy#
第 uz卷第 |期
ussu年 |月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o²q|
≥ ³¨·¨°¥¨µqoussu
° n × µ¨± uss °ª# pt k我们以前的研究证实
× µ¨± uss °ª#pt为最佳浓度之一l o培养时间分别
为 }uw ovy ow{ oys ozu o{w «∀每组 tu 例 ∀抽取外
周静脉血 x ∗ ts °o肝素抗凝 o用 ƒ¬¦²¯ 2¯«¼³¤´ ∏¨
k°«¤µ°¤¦¬¤
¬²·¨¦«o³³¶¤¯¤o≥º §¨¨ ±l分离 °
o用
° tyws 培养液 o置 vz ε ox h ≤ u 分别培养以
上设计的时间后 o调整细胞浓度至 t ≅ tsy °p t o高
速低温离心 o沉淀细胞作总 提取 ∀
1 q6 ± ≤2 ×2°≤ 检测 ≥ ° 的表达
1 q6 q1 主要试验和仪器 2 ∂ 反转录酶 o
酶抑制剂 oפ´ ⁄ 多聚酶 o§×°¶o ¬¯ª² §× 引物
k°µ²° ª¨¤l o׫¨ µ°²¨·∞ ∏´¬
¬² ⁄扩增仪 o凝胶分
析系统k° ≤ ª¨ ±¨ 公司l ∀
1 q6 q2 ± ≤2 ×2°≤ 检测 ≠人 °
总 的提
取 }用 ×µ¬½²¯ 快速抽提试剂提取靶细胞总
k方法见试剂操作步骤l ∀常规测定总 的浓度 o
uysru{s比值均在 t q{ ∗ u qs op zs ε 贮存 ∀ 引物 }
引 物 序 列≈w } 颗 粒 裂 解 肽 k ≥ l ¶¨±¶¨
≤ × ≤≤ × × × ≤ ≤≤ × o±·¬2¶¨±¶¨ × 2
≤ ≤ ≤ ≤≤ × ≤≤ × o°⁄ k磷酸
甘油醛脱氢酶 o内参对照 l o≥ ±¨¶¨ × 2
× ≤ × × ≤ ≤ o ±·¬2¶¨±¶¨ ≤ × × ≤ 2
≤ × × ≤≤ ∀ ≈ ×2°≤ 反应 }参照文献≈w o
反应参数为 |w ε t °¬±oxx ε vs ¶ozu ε vs ¶ozu ε
z °¬±延伸 o共进行 vx 个循环 ∀为了控制每次
提取和 °≤ 循环中的差异 o每一样本体系同时扩增
≥和 °⁄ 的¦⁄ o产物分别为 xt| ¥³和 wxy
¥³的两条片段 ∀ °≤ 产物于 u h琼脂糖凝胶电泳 ∀
…°≤ 产物半定量分析 }电泳产物经 ∞
染色后照
相 ~并用凝胶图象扫描仪测两电泳带吸光度值 o计算
每一样品 ≥ 与其内参对照 °⁄ 比值的相对
含量 o单位用 ³ª#Λpt表示 ∀
1 q7 统计学分析 实验结果用 ξ ? σ表示 o用 ≥³¶¶
| qs 统计软件完成 ∀
2 结果
2 q1 耐药 !多耐药结核患者 °
中结核菌 ty2⁄¤
≥≥°基因表达的 °≤ 检测结果 {w 例血标本
°
的检测结核菌 ty2⁄¤ ≥≥°基因 °≤ 反应产
物 u h琼脂糖电泳在 vzw ¥³处可见清晰的电泳带 o
结果见图 t ∀
2 q2 × µ¨±诱导结核休眠菌感染患者 °
体外 ≥
° 表达的 ± ≤2 ×2°≤ 检测结果 血样本 °
≥ ° 表达产物 u h琼脂糖电泳结果显示 }体
外培养前组未见明显的电泳条带 ~而阳性结果在
xt| ¥³处均可见一清晰的电泳带 o与预期的 ≥基
因片段长度相符 ∀同时 o在 wxy ¥³处亦可见一内参
°⁄ ° 的扩增产物电泳带 o说明 ≥ ° 2
扩增结果的可靠性 ∀结果见图 u ∀
图 t 患者血样本 °
的 ≥≥°表达电泳图
图 u × µ¨±诱导 °
体外 ≥° 表达电泳图
2 q3 × µ¨±对结核菌 ty2⁄¤ ≥≥°基因及 ≥基
因表达的作用 ty2⁄¤ ≥≥° °≤ 产物和 ≥
° ×2°≤ 产物用凝胶图象扫描半定量结果显
示 }用 × µ¨± uss °ª#pt浓度培养 zu «后 ty2⁄¤
≥≥°基因表达水平降至ks qty ? s qsxl与培养前对
照组表达水平ku qus ? s q{|l比较显著性降低k Π
s qsstl ~而 ≥基因表达水平为ks q{s ? s quwl与对
照组ks qsu ? s qstl比较显著性提高k Π s qsstl ∀
可见 uss °ª#pt浓度的 × µ¨±能减少耐药 !多耐药
结核患者体外 °
内结核菌 ty⁄¤ ≥≥°基因拷
贝的表达 ~同时 o促进内源性抗生素 ≥高水平的
表达 o见表 t ∀
表 t × µ¨±对结核菌 ≥≥°和 ≥基因表达的作用
k ξ ? σ, ν {wl
剂量
r°ª#p t
ty2⁄¤≥≥°
³ª#Λp t
≥r°⁄
³ª#Λp t
对照组 s qty ? s qsx s qsu ? s qst
× µ¨± uss u qus ? s q{| s qs{ ? s quw
#{zy#
第 uz卷第 |期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o²q|
≥ ³¨·¨°¥¨µqoussu
2 q4 × µ¨± 影响结核菌 ty2⁄¤ ≥≥°基因表达及
°
≥ ° 表达的动态相关分析 uss °ª#
pt浓度的 × µ¨±体外分别孵育 °
uw ovy ow{ oys o
zu o{w «后 o动态检测 ty ⁄¤ ≥≥°和 ≥ °
的表达 o结果显示 }随着孵育时间的延长 o结核菌 ty
⁄¤≥≥°表达递减降低 o当培养至 zu «oty ⁄¤
≥≥°基因拷贝量降至几乎看不到电泳带 ∀而 ≥
° 随着孵育时间增长而增加 o孵育至 zu «o达
最大量 ∀两者呈负相关 ∀见图 v ∀
图 v × µ¨±影响 ≥≥°及 ≥表达的动态分析
3 讨论 结核休眠菌的主要特征是细胞壁增厚和
ty ⁄¤ ≥≥° 的高度表达≈v ∀颗粒裂解肽kªµ¤±2
∏¯¼¶¬±o≥l是在细胞毒性淋巴细胞k≤¼·²·²¬¬¦¯ ¼°2
³«²¦¼·¨ o≤ ×l和天然杀伤细胞k¤·∏µ¤¯ ®¬¯¯ µ¨¦¨¯¯¶o
l激活晚期被诱导表达的一种多肽 o具有广谱抗
菌活性 o尤其是能杀死结核菌k ¼¦²¥¤¦·¨µ¬∏° ·∏¥¨µ2
¦∏¯²¶¬¶o ×
l≈x o经 ≥µu n预处理诱导去颗粒化及耗
尽细胞毒性颗粒后 o≤ ×就不能杀灭致病菌 o同时
≥基因表达减少≈y ∀
本实验首先研究了从湖南猫爪草提取的有效成
分 × µ¨±对临床耐药 !多耐药结核 o患者 °
中结核
菌 ty2⁄¤≥≥°基因表达及与 °
≥ ° 表
达的动态相关分析 ∀结果显示 × µ¨±在有效浓度时
能诱导免疫功能低下的结核休眠菌患者体外活化后
的 °
≥ ° 高水平的表达 o其表达产物与对
照组比较有显著性差异 ∀随着 ≥ ° 表达水
平的升高和 × µ¨± 培养时间的延长 o结核菌 ty2⁄¤
≥≥°表达却呈递减降低 o与培养前比较具有显著性
差异 ∀以上结果可能提示 }× µ¨±可能一方面通过减
少结核菌 ty2⁄¤≥≥°的表达 o激活结核休眠菌恢
复其对抗生素易感性 ~另一方面提高 ≤ ×的效应分
子 ≥ ° 表达的水平 o活化 ≤⁄{ n细胞 o促进其
以颗粒依赖的方式裂解感染了 ×
的 Υo从而对
休眠菌感染显示出抗菌作用 ∀若进一步研究 × µ¨± o
可望作为一种新型的内源性抗生素颗粒裂解肽的诱
导剂 o治疗耐药 !多耐药结核病 ∀
≈参考文献
≈t 郭学敏 o周单轮 o洪永福 q猫爪草化学成分的研究 q药学学报 o
t||x ovs ktul }|vt q
≈u ≤«¤±ª÷ oƒ¤± ≥ o• ∏±·¨µo ·¨¤¯ q¬³²¤µ¤¥¬±²°¤±±¤±¤°²¶¶¬2
¥¯¨ ∂¬µ∏¯ ±¨¦¨ ƒ¤¦·²µ±√²¯√ §¨¬± ° µ¨¶¬¶·¨±¦¨ ²© ¼¦²¥¤¦·¨µ¬¦∏±
×∏¥¨µ¦∏¯²¶¬¶ º¬·«¬± ¤¦µ²³«¤ª¨¶q±©¨ ¦·°°∏° ot||| ox| }
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≈v ƒ ≤∏±±¬±ª«¤° o ≤ ≥³µ¨¤§¥∏µ¼ q ¼¦²¥¤¦·¨µ¬¤¯ ≥·¤·¬²±¤µ¼
°«¤¶¨ ±§∏¦¨§ ¥¼ ²º ¬¼ª¨ ± × ±¨¶¬²±} ≤¨¯¯ • ¤¯¯ ׫¬¦®¨ ±¬±ª
¤±§²¦¤¯¬½¤·¬²± ²©·«¨ ty2®¬¯²§¤¯·²± Α2≤µ¼¶·¤¯ ¬¯± ²°²¯²ªq²©
¤¦·¨µ¬²¯²ª¼ ot||{ ot{skwl }{st q
≈w ≥ ·µ¨«¯¤∏o°¤√¯ ¤®¬¶ o¬³°¤± o¨·¤¯ q ±∏¤±·¬·¤·¬√¨ ⁄¨ ·¨¦·¬²±
²©°°∏±¨ ¦·¬√¤·¬²± ×µ¤±¶¦µ¬³·¶¤¶¤ ⁄¬¤ª±²¶·¬¦×²²¯ ¬± ¬§±¨ ¼
×µ¤±¶³¯¤±·¤·¬²±q°µ²¦¤·¯ ¦¤§≥¦¬≥ ot||z o|w }y|x q
≈x ≥·¨©©¨ ± ≥ o ⁄¨ ±±¬¶ o × ¬¨·¨¯ ¥¤∏° o¨·¤¯ q ± ±·¬°¬¦µ²¥¬¤¯
¦·¬√¬·¼ ²© ≤¼·²¯¼·¬¦ × ≤¨¯ ¶¯ §¨¬¤·¨§ ¥¼ µ¤±¤¯¼¶¬± q ≥¦¬¨±¦¨ o
t||{ ou{u }tu q
≈y ±§µ¨∏ ⁄o ≤¤µµ¨±² ≤ o ¬¯±§¨ ≤ o¨·¤¯ q§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ²©¤± ±·¬2
°¼¦²¥¤¦·¨µ¬¤¯ ⁄²°¤¬± ¬± 2¯ ¼¶¬± ¤±§ µ¤±∏¯¼¶¬±q
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≈责任编辑 方文贤
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t °«²µ¥²¯ ∞¶·¨µ¶ ƒµ²° ·«¨ ≥¨¨ §¶²© ≤µ²·²± ׬ª¯¬∏° q °«¼·²2
¦«¨ °¬¶·µ¼ ousss oxv }wxz q
≈责任编辑 古云霞
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