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Effect of Essential Oil of Radix Angelicae Dahuricae on β-endorphin,ACTH,NO and Proopiomelanocortin of Pain Model Rats

白芷总挥发油对疼痛模型大鼠的β-内啡肽、促肾上腺皮质激素、一氧化氮及前阿黑皮素的影响



全 文 :白芷总挥发油对疼痛模型大鼠的 Β2内啡肽 !
促肾上腺皮质激素 !一氧化氮及前阿黑皮素的影响
聂 红t o沈映君u
kt q南京中医药大学 o江苏 南京 utssu| ~u q成都中医药大学 o四川 成都 ytsszxl
≈摘要  目的 }探讨白芷总挥发油k ¶¨¶¨±·¬¤¯ ²¬¯ ²© • ¤§¬¬ „±ª¨ ¬¯¦¤¨ ⁄¤«∏µ¬¦¤¨ o∞’„⁄l对甲醛所致的伤害性疼痛
模型大鼠的 Β2内啡肽 !促肾上腺皮质激素k„≤ × ‹l !一氧化氮k‘’l及前阿黑皮素k°µ²²³¬²°¨¯¤±²¦²µ·¬±o°’  ≤l的影
响 ∀方法 }分别采用放射免疫法测定 Β2内啡肽 !„≤ × ‹ o化学法测定 ‘’ 的含量 ~并用原位杂交方法研究 ∞’„⁄对前
阿黑皮素信使核糖核酸k°’  ≤ °• ‘„l基因表达的影响 ∀结果 }∞’„⁄能显著升高甲醛所致的伤害性疼痛模型大
鼠下丘脑的 Β2内啡肽 !‘’ 含量 ~使下丘脑 !脑干 °’  ≤ °• ‘„ 表达阳性细胞数大幅度增加 ~而对血中的 „≤ × ‹ 没
有影响 ∀结论 }∞’„⁄可能通过增加中枢 °’  ≤ °• ‘„表达阳性细胞数和内源性镇痛物质含量 o激活内源性镇痛
机制而镇痛 o其作用部位可能在中枢 ∀
≈关键词  白芷总挥发油 ~疼痛模型 ~促肾上腺皮质激素 ~一氧化氮 ~前阿黑皮素
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussuls|2sy|s2sx
白芷始载于5神农本草经6 o性温 !味辛 o归胃 !大
肠 !肺经 o具有散风除湿 !通窍止痛 !消肿排脓的功
效 ∀用于感冒头痛 !眉棱骨痛 !鼻痛 !牙痛 !风湿痹
痛 !疮疡肿痛等症≈t  ∀其用于镇痛已有上千年的历
史 o临床上也有人因其良好的镇痛功效而将其归于
麻醉性镇痛药的范畴 o有报道其镇痛作用主要在脂
溶性部分 o其挥发油具有明显的镇痛效应≈u  ∀为了
探讨白芷总挥发油k ¶¨¶¨±·¬¤¯ ²¬¯ ²© • ¤§¬¬ „±ª¨ ¬¯¦¤¨
⁄¤«∏µ¬¦¤¨ o∞’„⁄l的作用部位及机理 o我们研究了
∞’„⁄对前阿黑皮素k°µ²²³¬²°¨¯¤±²¦²µ·¬±o°’  ≤l !
Β2内啡肽等疼痛相关肽类的影响 ∀
1 实验材料
1 q1 药物 实验用白芷购自成都市荷花池中药材
市场 o由成都中医药大学中药鉴定教研室贾敏如教
授鉴定为杭白芷 Ανγελιχα δαηυριχα k ƒ¬¶¦«q ¬¨
‹²©©° ql …¨ ±·«q¨·‹²²®q©q√¤µ φορµοσανα k…²¬¶¶ql
≥«¤± ·¨≠∏¤±的干燥根 ∀取白芷 zxs ªo粉碎成粗
粉 o浸泡过夜 o按5中国药典6kt||x年版l方法提取
挥发油 o静置后分离 o以硫酸钠除去水分 o棕色瓶装 o
p us ε 冰箱保存备用 o挥发油提取率为 t qv ϕ o每毫
升挥发油含 zzs ª原生药 o临用时以 s qx h 的吐温
≈收稿日期  usst2ts2vs
≈通信作者  电话 }ksuxlyz|{{ww 传真 }ksuxlyz|{t{w ∞2
°¤¬¯}«²±ª±¬¨ ƒ «²·°¤¬¯q¦²°
{s溶液配成 x ϕ kzz ª#®ªp tl ou qx ϕ kv{ qx ª#®ªp tl
两个剂量 o按 s qt °#®ªp t灌胃给药 ∀Β2内啡肽放
射免疫测定试剂盒由海军放免技术中心生产 o批号
||tsuu ~⁄ŒŠ标记 °’  ≤ 反意 • ‘„探针试剂盒 o由
第二军医大学组胚教研室提供 o批号 ||s{tx ~碱性
磷酸酶标记的抗地高辛抗体 o由 • ²¦«¨ 公司出品 o批
号 tutsuus ~‘’试剂盒由南京建成生物工程研究所
提供 o批号 ||tusx ∀
1 q2 动物 ≥⁄大鼠 o体重 vss ∗ vxs ªo动物合格证
号 }川实动管第k||2vul号 o由国家医药管理局四川
省抗菌素工业研究所实验动物中心提供 o检疫后备
用 ∀
1 q3 仪器 ≤ ’u孵箱 o  ¨¯µ²¶¨ °¤µ®公司出品 ~
• Ž{|t ≤≥≠ ƒ 恒温烘箱 o重庆生产 ~⁄2|xxy水平摇
床 o太仓市科教器材厂 ~‹2uu¶水浴恒温振荡器 o太
仓市科教器材厂 ~÷ ⁄≥2t倒置显微镜 o重庆光学仪器
厂 ~’≠  °˜≥ „÷{s 显微摄影照相系统 o日本生
产 ∀
1 q4 方法 ≥⁄大鼠 ws 只 oα ⎯ 各半 o随机分为 w
组 o每天分别灌胃s qx h 的吐温{s溶媒 !x ϕ 及
u qx ϕ ∞’„⁄o连续 w §k阳性组除外l o末次给药后
kt qx «后阳性组腹腔注射吗啡 s qst ª#®ªp tl o每只
大鼠左足跖皮下注射 x h甲醛 xs ˏ≈v ow  ou «后股动
脉取血 o分离血清按放射免疫法测定 „≤ × ‹ ∀随后
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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断头取脑 o置沸生理盐水中煮 x °¬±o取出迅速冷却 o
分离下丘脑 o称重 o用 s qt °²¯ #p t ‹≤¯制成匀浆 o
置 w ε 冰箱 u «后 o再用 s qt °²¯#pt ‘¤’ ‹ 中和 o
离心 tx °¬±o取上清液 p us ε 保存 o用放射免疫法
测 Β2内啡肽 o化学法检测 ‘’ ∀
1 q5 数据处理 各组数据以 ξ ? σ表示 o数据统计
采用 τ检验 ∀
2 结果与分析
2 q1 ∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模型大鼠下
丘脑 Β2内啡肽及血中 „≤ × ‹ 含量的影响 由表 t可
见 ∞’„⁄大剂量组能升高下丘脑的 Β2内啡肽含量 o
与吗啡组作用相似 o且含量相当 o而对血中的 „≤ × ‹
含量没有影响 ∀
表 t ∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模型大鼠下
丘脑 Β2内啡肽及血中 „≤ × ‹ 含量的影响k ξ ? σ, ν € tsl
组别 剂量rª#®ªp t Β2内啡肽r³ª#°ªp t „≤ × ‹r³ª#°ªp t
对照组 p ttxw ? vxt wy qv ? uz qs
吗啡组 s qst tzsx ? y|utl xs q| ? vy qv
∞’ „⁄ zz tzzt ? yy{tl vs qy ? t{ qx
v{ qx tsvv ? zts v| qu ? uy q|
注 }与对照组比较 tl Π s qsx
2 q2 ∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模型大鼠下
丘脑 ‘’ 的影响 由表 u可见 ∞’„⁄大 !小剂量组
均能升高下丘脑 ‘’ 的含量 o小剂量组效果更明显
k Π s qsstl o而吗啡对脑内 ‘’含量没有影响 ∀
表 u ∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模型
大鼠下丘脑 ‘’ 的影响 k ξ ? σ, ν € tsl
组别 剂量rª#®ªp t ‘’rΛ°²¯#p t
对照组 p ttw qw ? vy qt
吗啡组 s qst tvy qu ? wt q{
∞’ „⁄ zz twx q| ? u| qytl
v{ qx ut{ qt ? x{ qtul
注 }与对照组比较 tl Π s .sx u) Π s qsst
2 q3 ∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模型大鼠
°’  ≤ °• ‘„基因表达的影响≈x oy 
2 q3 q1 材料与方法 ≥⁄大鼠 o雄性 o随机分为 w
组 o每天分别灌胃 s qx h的吐温 {s溶媒 !x ϕ ∞’„⁄o
连续 w §k阳性组除外l o末次给药后kt qx «后阳性组
腹腔注射吗啡 s qst ª#®ªp tl o除对照组外 o每只大鼠
左足跖皮下注射 x h甲醛 xs ˏou «后即用 v h戊巴
比妥钠 vs °ª#®ªp t麻醉 o仰卧固定 o开胸 o进行主动
脉插管 o剪开右心耳 o迅速灌注无菌生理盐水 tss
°o然后灌注 w h多聚甲醛磷酸缓冲液 tss °o直
至动物出现四肢震颤 !僵硬等现象 ∀灌注后取大鼠
脑组织 o按照文献≈z 作大鼠脑图谱定位 o以恒冷箱
切片机k p us ε l对大鼠下丘脑 !脑干进行切片 o片
厚 { Λ° o用电吹风吹干后 p us ε 保存备用 ∀
2 q3 q2 原位杂交组织前处理 ≠ 切片用 w h多聚
甲醛k用 °…≥新鲜配制l固定 o室温 ous °¬±o°…≥洗
u ≅ x °¬±ov h ‹u ’u溶液中浸泡 us °¬±~切片浸入
s qt h ∗ s qu h·µ¬·²± ÷2tssr°…≥中重新水化 o°…≥洗
u ≅ v °¬±~≈ t ∗ u Λª#°ªp t蛋白酶 Žovz ε otx ∗ us
°¬±o消化浓度和时间应根据组织的种类 !厚度反复
试验调整 ~…在 s qt °²¯#p t甘氨酸 °…≥溶液中室
温孵育 x °¬±以终止消化 ~  w h多聚甲醛 °…≥固定
v °¬±o°…≥洗 v ≅ v °¬±~¡浸入新鲜配制的 s qux h
乙酸酐ks qt °²¯#p t三乙醇胺配制lts °¬±~Ž⁄∞2
°≤ 水中洗涤切片 o晾干切片 ∀
2 q3 q3 杂交 取 us ˏ含相应探针的杂交液滴于
标本上 o杂交混合液内含 xs h去离子甲酰胺 ots h
k Ω/ ςl硫酸葡聚糖 otss Λª#°p t变性鲑精 ⁄‘„ ox
≅ ≥≥≤ ox ≅ ⁄¨ ±«¤µ§·. ¶液kt ª葡聚糖 ot ª聚乙烯吡
咯烷酮 ot ª…≥„ ot sss °⁄∞°≤ 水l ∀切片加盖硅
化盖玻片 o置盛有 x ≅ ≥≥≤ 的湿盒中 xs ε o杂交 ty
∗ us «∀
2 q3 q4 显示 ≠ 杂交后 o将玻片浸入u ≅ ≥≥≤ o
s qt h ≥⁄≥ 溶液中洗去盖玻片 ~ u ≅ ≥≥≤ 洗 w ≅ x
°¬±~≈ s qt ≅ ≥≥≤ os qt h ≥⁄≥溶液中洗涤玻片 o在杂
交温度洗涤 u 次 o每次 ts ∗ ys °¬±~…°…≥中洗涤 x
°¬±~ 室温下将玻片浸入缓冲液 ´中 ts °¬±~¡擦
干玻片 o加入用缓冲液 ´配制的碱性磷酸酶标记的
抗地高辛抗体ktΒxss ∗ tΒx sssl o室温孵育 w «或 w
ε 孵育过夜 ~¢用缓冲液 ´洗涤 v次 o每次 v °¬±~£
玻片用缓冲液 ¶平衡 ts °¬±o室温下在 ‘…×r…≤Œ°
中显色 vs ∗ vys °¬±¤流水冲洗终止显色 o在 u h甲
基绿溶液中复染 x ∗ ys °¬±o流水冲洗玻片至水清
澈 ~‘固定玻片 o干燥 !透明 !封片 ∀
2 q3 q5 原位杂交对照试验 ≠ 组织对照采用已知
的阳性组织作阳性对照 o以无疼痛动物脑组织切片
为阴性对照 ~ 杂交反应对照采用省去标记的探针
或杂交前用 • ‘„酶处理 vs °¬±~结果以上对照试验
均检测不到明显的杂交信号 ∀
2 q3 q6 结果 从图 t ou ov ow 可见 }°’  ≤ °• ‘„
阳性细胞呈紫蓝色圆形或卵圆形颗粒 o°’  ≤ 阳性
信号位于胞浆内 o在细胞核周围呈紫蓝色或深棕色
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环状 o正常组大鼠的 °’  ≤ °• ‘„ 表达阳性细胞数
几乎没有 o只有核被复染成绿色 o胞浆不可见 ~模型
组大鼠的阳性细胞数稍多 o散在分布 o但信号较弱 o
已可看出圆环形的深染胞浆 ~∞’„⁄组大鼠的阳性
细胞数显著增加 o呈典型的外圈深浅不一紫蓝色的
圆环形 o核被复染成浅绿色 o而吗啡组 °’  ≤ °• 2
‘„ 表达阳性细胞数最多 o且信号最强 o呈典型的紫
蓝色深染圆环状 o依稀可见复染的核呈绿色 o二者均
主要分布在第三脑室尾端 o第四脑室头端及下丘脑
弓状核附近 ∀
图 t 前阿黑皮素 °• ‘„k对照组l ≅ uss
图 u 前阿黑皮素 °• ‘„k模型组l ≅ vss
图 v 前阿黑皮素 °• ‘„k∞’„⁄组l ≅ uys
图 w 前阿黑皮素 °• ‘„k吗啡组l ≅ vus
在每一动物的组织切片中随机抽样 w 张 o在显
微镜下用人工计数法统计每张切片上所有的阳性细
胞数 o取均数作为该动物的 °’  ≤ °• ‘„基因表达
数 ∀结果如表 v所示 }实验性甲醛疼痛动物模型组
下丘脑 !脑干 °’  ≤ °• ‘„ 表达阳性细胞数不多 o
但与对照组比较有显著性差异 o吗啡组 !∞’„⁄组的
下丘脑 !脑干阳性细胞数目明显增加 o与模型组比较
有极显著性差异k Π  s qsstl o但 ∞’„⁄组 °’  ≤
°• ‘„表达不及吗啡显著 ∀
表 v ∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模型大鼠下丘脑 !
脑干 °’  ≤ °• ‘„基因表达的影响k ξ ? σ, ν € wl
组别
剂量
rª#®ªp t
°’  ≤ °• ‘„表达阳性细胞r个
下丘脑 脑干
对照组 p s s
模型组 p tu qx ? x qwtl x qv ? v qztl
吗啡组 s qst v{v q| ? vtx quvl vuw q| ? uxv qwvl
∞’ „⁄ zz z| qv ? vx qzul yx qv ? vw qxul
注 }与对照组比较 tl Π s .sst 与模型组比较 u) Π  s .st
v) Π s qsst
3 讨论
本课题的前期研究结果表明 ∞’„⁄对各种物
理 !化学性刺激所致的疼痛动物模型具有确切的镇
痛作用≈{  o因而选取镇痛效果最好的 zz ª#®ªp t和
v{ qx ª#®ªp t两个剂量组进行镇痛作用机理的研究 ∀
已知的阿片肽分为内啡肽 !脑啡肽 !强啡肽三大类 o
每一类都由一种特定的巨型前体分子衍化而来 o
°’  ≤是内啡肽的前体 o其蛋白由下丘脑弓状核区
的神经细胞合成后 o被特殊的酶在毗邻的两个碱性
氨基酸之间切断 o降解成较小的肽如 „≤ × ‹ oΒ2内啡
肽等 o在突触部位释放 o起神经递质或神经调质的作
用 ∀因此 °’  ≤ oΒ2内啡肽 o„≤ × ‹ 等与疼痛的关系
相当密切 o本实验利用原位杂交技术 o观察到 ∞’„⁄
能显著增强 °’  ≤ °• ‘„的基因表达 o强度虽不及
吗啡 o但分布范围与吗啡类似 o说明其镇痛作用机理
确实与吗啡有一定的相似性 ∀由于 Β2内啡肽在体内
起着痛觉感受的调控或与阿片受体结合产生镇痛效
应的作用 o是目前公认的对疼痛进行调整的抑制性
神经递质 ~而 „≤ × ‹ 能刺激肾上腺皮质类固醇而影
响免疫功能 ∀ ∞’„⁄显著升高下丘脑 Β2内啡肽的含
量 o与吗啡ks qst ª#®ªp tl的作用相当 o可能通过与
阿片受体结合k特别是 Λ受体和 ∆受体l而激活了脑
内由脑啡肽神经元 !脑啡肽及阿片受体共同组成的
/抗痛系统0 o阻断痛觉传导 o从而产生中枢性镇痛作
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用≈|  ∀其对血中的 „≤ × ‹ 没有影响 o估计是对
°’  ≤降解酶的作用差异所致 o或 „≤ × ‹ 只在突触
部位释放 o在局部起作用 o对全身的影响不大 ∀
°’  ≤的变化与其降解产物是否成比例 o还需要有
更多的实验数据来论证 ∀此外 o‘’ 在神经系统内
具有类似神经递质的信息传递功能 o参与疼痛刺激
的中枢过程 o可增强阿片的镇痛作用≈ts  o∞’„⁄明
显升高下丘脑 ‘’ 的含量 o对镇痛作用的发挥是有
利的 ∀
综上所述 o∞’„⁄对甲醛所致的伤害性疼痛模
型大鼠的镇痛作用确切 o能使脑内 °’  ≤ °• ‘„表
达阳性细胞数显著增加 o下丘脑中 Β2内啡肽和 ‘’
升高 o与之对行为实验的镇痛效应是一致的 o说明这
些指标与疼痛具有相关性 o∞’„⁄可能通过激活内
源性的镇痛机制而发挥作用 ∀由于甲醛所致疼痛的
产生主要涉及脑干以上的脑区 o包括间脑和大脑边
缘系统≈tt  o故推测 ∞’„⁄的镇痛部位可能在脑干以
上 ∀
≈参考文献 
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≈x  汪 谦 q现代医学实验方法 q北京 }人民卫生出版社 ot||z qzu q
≈y  ‹ ˜ ¬¤±ª2¼∏¤± oŒ‘ Š∏²2½«¤±ªq ∞©©¨ ¦·²© × ·¨µ¤«¼§µ²³¤¯ °¤·¬±¨
„±¤¯²ª¶²± ƒ²¶∞¬³µ¨¶¶¬²±Œ±§∏¦¨§¥¼ ƒ²µ°¤¯¬±2³¤¬± q„¦·¤°«¤µ2
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• ¤·…µ¤¬±q °¯ ±¨∏° °∏¥¯¬¶«¬±ª ≤²µ³²µ¤·¬²±ot|z| qus q
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药药理与临床 ot||| otxkyl }t{ q
Εφφεχτ οφ Εσσεντιαλ Οιλ οφ Ραδιξ Ανγελιχαε ∆αηυριχαε ον
Β2ενδορπηιν ,ΑΧΤΗ ,ΝΟ ανδ Προοπιοµελανοχορτιν οφ Παιν Μοδελ Ρατσ
‘Œ∞ ‹²±ªt o≥‹∞‘ ≠¬±ª2­∏±u
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¦²µ·¬¦²·µ²³¬¦«²µ°²±¨ k„≤ × ‹l !‘¬·µ¬¦²¬¬§¨ k‘’l ¤±§ °µ²²³¬²°¨¯¤±²¦²µ·¬± k°’  ≤l ²© ³¤¬± °²§¨¯µ¤·¶¬±§∏¦¨§¥¼ ©²µ°¤¯§¨ «¼§¨ q
Μετηοδ :Β2 ±¨§²µ³«¬± ¤±§ „≤ × ‹ º µ¨¨ §¨·¨¦·¨§ º¬·«µ¤§¬²2¬°°∏±¬·¼ o·«¨ ¤°²∏±·²© °¤¶¦∏¯¬±¨ ¦¨¯¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© °µ²²³¬²°¨¯¤±²¦²µ·¬±
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∞’ „⁄¦²∏¯§¬±¦µ¨¤¶¨ Β2 ±¨§²µ³«¬±o‘’ ¤±§·«¨ ¤°²∏±·²© °¤¶¦∏¯¬±¨ ¦¨¯¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©°µ²²³¬²°¨¯¤±²¦²µ·¬± °• ‘„ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼¬± «¼2
³²·«¤¯¤°∏¶¤±§¥µ¤¬±¶·¨° ²©µ¤·¶qΧονχλυσιον :∞’ „⁄ º«¬¦« °¤¼ ¥¨ ¦¨±·µ¤¯ ¤±¤¯ª¨¶¬¦o¬¶¤¶¶²¦¬¤·¨§ º¬·« ±¨§²ª¨ ±²∏¶²³¬¤·¨2¯¬®¨ ¶∏¥2
¶·¤±¦¨ ¶∏¦«¤¶°’  ≤ ¤±§Β2 ±¨§²µ³«¬±q
[ Κεψ ωορδσ] ¶¨¶¨±·¬¤¯ ²¬¯ ²© • ¤§¬¬ „±ª¨ ¬¯¦¤¨ ⁄¤«∏µ¬¦¤¨ ~³¤¬± °²§¨¯~¤§µ¨±²¦²µ·¬¦²·µ²³¬¦«²µ°²±¨ ~ ±¬·µ¬¦²¬¬§¨ ~ ³µ²²³¬²° 2¨
¤¯±²¦²µ·¬±
≈责任编辑 方文贤 
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