全 文 ：中国生态农业学报 2014年 1月 第 22卷 第 1期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Jan. 2014, 22(1): 63−71


* 通讯作者: 李霞, 主要研究方向为逆境胁迫下植物根系的可塑性发育。E-mail: xli@genetics.ac.cn
杨磊, 研究方向为逆境胁迫下植物根系的可塑性发育。E-mail: yangleiilove@126.com
收稿日期: 2013−04−23 接受日期: 2013-09-30
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2014.30396
拟南芥 DA1-Related Protein 2基因参与调控植物
对盐胁迫的响应
杨 磊 1,2 赵红桃 1 王志娟 1 李 霞 1*
(1. 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050022; 2. 中国科学院大学 北京 100049)
摘 要 土壤盐渍化是目前农业生产面临的主要问题之一, 同时种子萌发转绿作为植物幼苗形态建成的基础
对盐胁迫最为敏感。本研究以 Col-0、Ler野生型拟南芥和 osr1短根突变体拟南芥为试验材料, 通过图位克隆
方法得到调控根生长的 DAR2(DA1-Related Protein 2)基因。本研究利用 RT-PCR方法, 发现生长 10 d的 Col-0
幼苗在 200 mmol·L−1氯化钠条件下处理 6 h和 12 h, DAR2基因受盐胁迫诱导; 200 mmol·L−1氯化钠处理后, 组
织化学染色结果显示, 萌发 1 d的根尖韧皮部和 3 d的叶片 pDAR2::GUS的表达上升, 进一步表明 DAR2基因
受到盐胁迫的诱导。统计不同 MS培养基[0(CK)、100 mmol·L−1氯化钠、150 mmol·L−1氯化钠、200 mmol·L−1
氯化钠、150 mmol·L−1氯化钾、200 mmol·L−1甘露醇]上 Col-0和 dar2-3的萌发率和转绿率发现: 随着氯化钠
浓度的逐渐增大, 突变体无论萌发还是转绿时间明显比野生型晚。在 150 mmol·L−1氯化钾和 200 mmol·L−1甘
露醇培养条件下, 萌发和转绿的时间也比野生型要晚。这些结果表明突变体在萌发和转绿期对盐胁迫的敏感
性比野生型明显增强, 进一步证明了突变体对盐胁迫的敏感性并不是对离子的特异响应。这些研究结果为深
入了解逆境胁迫下植物早期生长发育的可塑性调控机制奠定了基础, 同时也为通过生物技术改良作物抗逆性
提供了理论依据。
关键词 拟南芥 DAR2 盐胁迫 萌发和转绿 离子胁迫 渗透胁迫
中图分类号: Q37 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2014)01-0063-09
Functional analysis of DA1-Related Protein 2 in Arabidopsis under salt stress
YANG Lei1,2, ZHAO Hongtao1, WANG Zhijuan1, LI Xia1
(1. Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,
Shijiazhuang 050022, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract Salt stress inhibits plant growth and development, resulting in low crop yield. Therefore, the mechanism of plant response
to salt stress has received much attention in plant science research. Early development (including seed germination and greening) is
not only critical for seedling establishment and subsequent plant growth and development, but is also more sensitive to salt stress.
However, the molecular mechanisms underlying plant salt tolerance during this developmental stage has remained largely unknown.
In this study, we identified a gene, DAR2 (DA1-Related Protein 2), which regulated primary root growth by map-based cloning in
Arabidopsis. We noted that DAR2 gene was induced by 200 mmol·L−1 NaCl in 10-day-old Col-0 seedlings. GUS staining showed that
the expression of pDAR2::GUS was altered, suggesting that DAR2 gene was induced in root tip and leaf apex phloem. We counted
the Col-0 and dar2-3 seed germination and greening rates in different MS medium — 0 (CK), 100 mmol·L−1 NaCl, 150 mmol·L−1
NaCl, 200 mmol·L−1 NaCl, 150 mmol·L−1 KCl and 200 mmol·L−1 mannitol. These results showed that compared with the wild type,
either seed germination or greening of dar2-3 mutant obviously delayed with gradual increase in NaCl concentration. Under 150
mmol·L−1 KCl and 200 mmol·L−1 mannitol treatments, dar2-3 mutant seed germination and greening delayed in relation to the wild
type. Interestingly, the mutant exhibited increased sensitivity to NaCl, KCl and mannitol treatments during seed germination and
greening compared with the wild type. These results suggested that while DAR2 was effective in mediating plant response to
general osmotic stress, it was not specific to ion stress in the early growth and development phase. Our findings provided novel
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insights into salt tolerance and enhanced crop resistance to salt stress.
Keywords Arabidopsis; DAR2; Salt stress; Germination and greening; Ion stress; Osmotic stress
(Received Apr. 23, 2013; accepted Sep. 30, 2013)
盐胁迫严重抑制植物的生长和发育, 是造成农
作物减产的一个重要环境胁迫因子。据报道, 全世
界 80多亿公顷的陆地面积都遭受着盐胁迫, 约占全
球陆地面积的 7%[1−2]。中国盐渍土总面积约为
7.5×105 km2, 其中沿海各省、市、自治区约 1.8×104 km2
的滨海地区和岛屿的沿岸分布着各种滨海盐碱土 ,
总面积超过 5.0×106 hm2。在这些地区由于淡水资源
缺少, 地下水位较低并且水质较差, 土壤盐渍化严
重[3−4]。随着人口急剧增加, 粮食生产也成为了不容
忽视的问题。滨海盐碱土作为重要的土地后备资源,
亟待开发利用, 而通过生物技术手段, 培育改良抗
盐碱作物是最有效的途径之一。
种子萌发和转绿是植物生长发育过程中最为关
键的两个时期, 容易受到外部环境因子的影响以及
内部生长物质的调控作用[5]。盐分对种子萌发和转
绿的影响一般分为渗透胁迫和离子胁迫, 先是溶液
渗透势降低而使种子吸水困难, 接着溶液中积累过
多离子(Na+、K+等), 造成离子毒害而抑制种子萌发
及转绿[6]。植物为了在不断变化的环境中生存繁衍,
演化出一套精细的分子调控网络来应对盐胁迫[5,7]。
当受到非生物胁迫时, 许多植物激素如脱落酸、赤
霉素、油菜素内酯和水杨酸等都会参与到种子萌发
转绿的过程。生长素、细胞分裂素和脱落酸等都参
与调控根尖细胞的分裂和伸长区细胞生长[8]。其中
ABA信号通路在调控种子萌发转绿以及根在渗透缺
水的响应中发挥主导作用[9]。在遭遇盐胁迫时, 拟南
芥(Arabidopsis thaliana )通过激活 SOS 信号途径包
括质膜上的离子通道如 SOS1(salt overly sensitive 1)
和液泡膜反向运输通道 NHX1(Na+/H+ exchanger)将
有害离子运到细胞外 [9−10]或隔离到液泡中, 从而控
制细胞质中过多离子的积累。此外, 在应对干旱和
盐胁迫时, 在种子和幼苗中会增加渗透保护剂如脯
氨酸、多元醇、糖类和甲胺等的合成, 通过渗透调
节来维持种子萌发和转绿过程中的吸水能力, 保证
早期幼苗的生长[11]。
在过去的 20年中, 虽然植物种子在盐胁迫下的
研究很多 , 但有关其耐盐的分子机制还是知之甚
少。近年来发现, 1 个拟南芥 NAC 转录因子 NTM2
受高盐条件诱导表达后 , 促进生长素信号通路中
IAA30基因的表达, 从而参与调节种子的萌发[12]。拟
南芥乙烯信号通路中的 EIN3 转录因子激活盐诱导
基因 ESE1 的表达, 后者参与调控种子萌发和转绿
对盐胁迫的响应[13]。本研究从中国科学院遗传与发
育生物学研究所左建儒实验室构建的拟南芥 T-DNA
插入突变体库中[14], 通过盐胁迫处理后筛选出了 1
个拟南芥短根突变体, 通过图位克隆得到该短根突
变体的突变基因 DAR2(DA1-Related Protein 2)。根据
已有的报道, 该基因编码了 1 个含有 LIM 结构域和
锌指作用元件的蛋白, 调控了韧皮部向根尖卸载糖
分的能力, 来调控植物根系的可塑性发育[15−16]。由
于 dar2-3 是作为盐敏感的突变体筛选而来, 那么
DAR2 除了控制根生长外, 是否也参与植物对盐胁
迫的响应呢？在本研究中, 我们以 Col-0、Ler 野生
型和 dar2-3 短根突变体拟南芥种子为试验材料, 用
不同浓度的氯化钠、氯化钾和甘露醇溶液进行处理,
来探究 DAR2 基因在盐胁迫条件下的种子萌发及转
绿过程中发挥的调控作用。这可对今后进一步阐明
盐胁迫下植物种子萌发转绿的分子作用机制奠定一
定的基础, 同时也为改良植物的耐盐性、培育耐盐
农作物提供一定的指导意义。
1 材料和方法
1.1 拟南芥材料
野生型拟南芥材料: ①Columbia生态型(Col-0);
②Landsberg erecta生态型(Ler)。转基因拟南芥材料:
pLRD3::GUS (Jocelyn E. Malamy, 芝加哥大学, 背
景野生型为 Col-0)。突变体材料: ①dar2-3 (DA1-
Related Protein 2-3, 背景野生型为 Col-0); ② lrd3
(Jocelyn E. Malamy, 芝加哥大学, 背景野生型为 Ler)。
1.2 试验方法
1.2.1 拟南芥的种子消毒、播种及培养
拟南芥种子用 50%商业用立白漂白水浸泡 5 min,
随后用无菌水漂洗 4~5 次; 将消毒的种子播在固体
MS 培养基 [2%蔗糖 , 0.8%琼脂粉 (Sigma USA),
1×MS 盐 (Phyto-Technology Laboratories, 货 号 :
M519), pH用 1 mol·L−1 KOH调至 5.7左右]; 将播好
的种子放置冰箱中, 4 ℃低温处理 2~3 d, 使种子萌
发整齐; 将促萌发后的种子转入生长室中, 培养 8 d
(22 ℃, 16 h 光照 8 h 黑暗); 幼苗移栽到浸透 1/3
Hogland 营养液的蛭石营养土中继续培养(22 ℃, 16 h
光照 8 h黑暗), 每周浇水 1~2次并适当补充 Hogland
营养液, 至长角果成熟收获种子。
1.2.2 拟南芥 DNA提取
CTAB法: ①取 3周龄的叶片于 1.5 mL离心管
第 1期 杨 磊等: 拟南芥 DA1-Related Protein 2基因参与调控植物对盐胁迫的响应 65


中, 用玻璃棒研磨样品; ②加入 400 mL CTAB提取
液(100 mmol·L−1 Tris-HCl pH 8.0, 4 mol·L−1 NaCl,
20 mmol·L−1 EDTA, 2% CTAB), 混匀; ③ 65 ℃水浴30 min,
中间轻微振荡几次; ④加等体积的氯仿∶异戊醇(24︰1),
轻轻混匀; ⑤12 000 r·min−1冷冻离心 15 min取上清加
2倍体积冰乙醇, 混匀, 静置10 min; ⑥12 000 r·min−1冷
冻离心 15 min, 弃上清; 70%⑦ 乙醇漂洗 2次, 晾干,
无菌水 20 μL 溶解 DNA, 然后放在−20 ℃冰箱长期
保存。
1.2.3 图位克隆
1.2.3.1 构建作图群体
首先用 osr1(Col-0)突变体与 Ler 野生型杂交
(osr1 x Ler)得到 F1代种子。F1代自交得到 F2代作
图群体。
1.2.3.2 突变基因的粗定位
分别提取具有短根表型的 F2代植株的 DNA并
利用分子标记进行基因型分析。首先在拟南芥的 5
条染色体上设计 25个遗传标记(平均 20~30 cM设定
1 个标记), 然后根据选定的遗传标记设计引物分别
以具有短根表型的 F2 代植株的 DNA 为模板进行
PCR和凝胶电泳, 统计各个分子标记处的重组率(重
组率=重组配子数/配子总数×100%), 将突变基因粗
定位在重组率明显小于自由组合比例 50%的两个分
子标记之间(越靠近目的基因, 重组率越小)。粗定位
先将目的基因定位在 20 cM 的范围内, 再在 20 cM
的遗传间隔之间设定遗传标记, 按照相同的定位方
法将基因缩小到 4 cM范围内。
1.2.3.3 突变基因的精细定位
在粗定位之后播种 3 000~4 000 株 F2 代群体,
从中筛选出纯合突变体表型的植株, 提取DNA用于
精细定位。并收获重组个体的种子(F3), 播种F3代植物,
观察其短根表型, 确定 F2 代目的基因的基因型。最
终将突变基因精确定位于约 20 kb(约为 0.12 cM)遗
传间隔。
1.2.3.4 突变基因鉴定
从多个候选基因中筛选目的基因是图位克隆的
最后一个关键步骤, 通过对这段序列进行扩增测序,
然后与野生型的序列进行比较, 找到发生突变的候
选基因。
1.2.4 突变体的表型观察
取同期收获且完全干燥的野生型 Col-0和突变体
种子(每个基因型约 30 粒), 消毒后均匀点播在不同
处理的MS培养基上, 4 ℃放置 3 d, 放于 22 ℃、16 h
光/8 h黑暗的温室中培养。每种基因型均在 MS及处
理培养基上播种, 每种培养基做 3个重复。
1.2.4.1 萌发观察
每 24 h 观察 1 次, 记录萌发情况, 以胚根突破
种皮为标准, 统计各个株系种子的萌发率。
1.2.4.2 子叶转绿观察
对不同处理萌发的种子继续培养, 以子叶完全
打开并转绿为标准, 统计每 24 h各个基因型株系的
子叶转绿情况, 并照相。
1.2.4.3 GUS染色
①取带有GUS标签的新鲜材料在 90%的丙酮中
4 ℃固定 30 min; ②吸去丙酮, 加配制好的GUS染液
37 ℃放置至少 4~5 h, 将反应液吸出, 加入 75%的酒
精即可终止反应; ③叶片部分的观察需用 75%的酒
精进行过夜脱色后观察, 根部再用 75%的酒精清洗
后可以直接观察。
配方: 1)20 mmol·L−1 X-Gluc(DMSO或N.N-二甲
基甲酰胺溶解); 2)50 mmol·L−1磷酸缓冲液(pH=7.0),
A液: 3.12 g NaH2PO4·2H2O溶于无菌蒸馏水, 定容
到 100 mL, B液: 7.17 g Na2HPO4·12H2O溶于无菌蒸馏
水, 定容到 100 mL, 取 39 mL A液与 61 mL B液混合;
3)GUS 染液, 包括 5 mmol·L−1铁氰化钾、5 mmol·L−1
亚铁氰化钾、10 mmol·L−1 EDTA、50 mmol·L−1磷酸缓
冲液(pH=7.0)、1 mmol·L−1 X-Gluc。
1.2.4.4 RT-PCR
(1)试验材料
M-MLV 逆转录酶(Promega); dNTP(dATP, dGTP,
dTTP, dCTP, 浓度均为 2.5 mmol·L−1); oligo (dT)
(25 μmol·L−1) (Tiangen); RNase inhibitor (40 U·μL−1,
Promega, 美国)。
(2)反转录方法
①在DEPC处理过的 200 μL EP管中顺序加入 6 μg
RNA和 3 μL oligo(dT); ②70 ℃温育 5~10 min后迅
速置于冰上冷却; ③按表 1 中成分顺序加入到上一
步的 200 μL EP管中。④将上述反应液混匀, 42 ℃反
应 2 h; ⑤反应结束后, 70 ℃处理 10 min灭活逆转录
酶活性。反应合成的 cDNA 第 1 条链可用作 PCR
反应模板。
表 1 RNA反转录体系
Table1 RNA reverse transcription system
组分 Constituent 用量 Volume (μL)
5xM-MLV buffer 4.0
dNTPs 4.0
RNA酶抑制剂 RNase inhibitor 0.5
M-MLV 0.5
合计 Total 9.0
66 中国生态农业学报 2014 第 22卷


PCR反应程序:
94 ℃ 4 min
94 ℃ 30 s
58 ℃ 40 s
72 ℃ 1.5 min
72 ℃ 10 min
(3)PCR反应
PCR反应体系见表 2。本试验 RT-PCR所用引物
序列 : P1: ATGGATTCTTCTTCCTCTTCCTCT; P2:
TCACAAAGGAAAAGTTCCAGTTA; P3: GTTCGC-
AGCTACAACAACG; LB-A: CTGGTTTTATATACA-
GCAGTCGACG。
表 2 RT-PCR反应体系
Table 2 RT-PCR reaction system
组分 Constituent 用量 Volume (μL)
cDNA模板 cDNA template 1.0
10×Taq buffer 2.0
dNTPs (2.5 mmol·L−1 each) 1.6
正向引物 Forward primer (10 μmol·L−1) 0.5
反向引物 Reverse primer (10 μmol·L−1) 0.5
Taq (Tiangen) (2.5 U·μL−1) 0.2
dd H2O 14.2

电泳检测: PCR 扩增产物在 1.0%的琼脂糖凝
胶中电泳(缓冲液为 TAE), 在长光波紫外灯下拍照
检测。
TAE buffer配方: Tris碱 4.84 g·L−1, 1.14 mL·L−1
乙酸, 100 mL·L−1 0.5 mol·L−1 EDTA(pH 8.0)。
2 结果与分析
2.1 osr1突变体的图位克隆
从拟南芥 T-DNA插入突变体库中, 通过盐胁迫
处理后筛选出了 1 个拟南芥短根突变体, 根据其短
根表型将其命名为OSR1(Over Short Root 1), 其缺失
突变体为 osr1(图 1)。此后试验证明, 该突变体短根
性状是由单个核基因控制的隐性突变。
采用图位克隆的技术克隆这个突变基因。首先
通过对拟南芥 5条染色体上 SSLP标记的筛选, 挑选
16对基本均匀分布于 1、2、3、4、5号染色体上的
SSLP 标记。粗定位将目的基因定位到第 2 条染色
体上, 进一步的精细定位利用 1 324 株个体将突变
位点定位到 T5I7-2和 T28M21两个标记间的 52 kb
区间内(图 2)。该区间共有 14个候选基因, 在 TAIR网
站上利用生物学分析, 最终通过测序将突变位点定
位到 At2G39830 基因(图 3), 该基因为 DAR2 (DA1-
Related Protein)/ LRD3(Lateral Root Development 3)。

图 1 osr1突变体的表型鉴定
Fig. 1 Identification of osr1 mutant
A: 野生型 Col-0 和突变体 osr1 在 MS 培养基上生长 12 d
后, 其幼苗根长的比较; B: MS培养基上生长 8 d的野生型 Col-0
和突变体 osr1 幼苗根尖分生区的差别, 黑箭头和白箭头之间的
距离为根尖分生区大小, 比例尺代表 25 µm。A: Root of osr1
(Col-0 background) showing a reduction in length with respect to
control (Col-0) of 12 DAG (day after germination) seedlings on MS
medium. B: Root meristem of osr1 (Col-0 background) showing a
reduction in meristem size with respect to control (Col-0) of 8 DAG
seedlings. White and black arrowheads indicate root meristem size.
Scale bar represents 25 µm.

图 2 基因定位重组子筛选电泳图
Fig. 2 Gene mapping recombinant screening electropherogram
2.2 dar2-3等位突变体分析
图 4所示, 克隆得到的基因命名为 DAR2/LRD3,
且有 3个突变体 dar2-1、dar2-2和 lrd3已被报道[15−16],
所以 osr1突变体改为 dar2-3。DAR2/LRD3基因组全
长 4 030 bp, cDNA为 1 908 bp, CDS为 1 587 bp, 有
12个外显子, 11个内含子, 通过将测序结果与 DAR2
的基因组 DNA序列进行比对, 证明 DAR2第 2内含
子上有 T-DNA 片段插入。随后在 RNA 水平上检测
DAR2 基因的表达, 结果证明 dar2-3 中没有全长转
录(图 4C), 说明 dar2-3 是一个功能缺失的突变体。
为进一步证明 dar2-3和 lrd3是同一个基因的等位突
变体, 将 dar2-3 分别与 Ler 和 lrd3 杂交观察后代的
表型, 发现 dar2-3×lrd3 F1表型与 dar2-3和 lrd3的
表型相似, 说明这两个突变体是同一基因的等位突
变(图 5)。
2.3 DAR2突变对氯化钠胁迫的响应
为进一步确定 DAR2 在盐胁迫中的功能, 对盐
胁迫下 DAR2的基因表达进行检测。首先取在正常
MS 培养基上生长 10 d 的拟南芥野生型幼苗, 用
200 mmol·L−1氯化钠处理 0、0.5 h、1 h、3 h、6 h
和 12 h后取样, 提取 RNA, 用半定量 RT-PCR方法检
30个循环
第 1期 杨 磊等: 拟南芥 DA1-Related Protein 2基因参与调控植物对盐胁迫的响应 67



图 3 OSR1突变基因的图位克隆
Fig. 3 Map-based cloning of OSR1

图 4 DAR2基因的 T-DNA插入位置及分子水平鉴定
Fig. 4 T-DNA insertion and transcription detection of DAR2 gene
A: DAR2基因结构及 T-NDA插入示意图, 从 ATG到 TAG是基因编码区, T-DNA插入到两个不同位置得到 dar2-3和 lrd3 2个突
变体, P1、P2和 P3是 DAR2基因上特异的引物序列, 箭头代表引物方向, LB-A是 T-DNA上的特异引物; B: 在 DNA水平上鉴定 dar2-3
突变体; C: 对突变体中 DAR2全长检测, UBQ是看家基因作为对照。A: Schematic representation of the DAR2 gene. UTRs are shown in
white, exons in black boxes, and introns as thick lines. Triangle indicates the T-DNA insertion site in DAR2. Arrows represent the location of
primers (P1, P2 and P3, LB-A as specific primer of T-DNA) used for RT-PCR. B: Identification of dar2-3 in DNA level. C: Transcription
detection of DAR2 gene in dar2-3 mutant. UBQ is house keeping gene as control.

测 DAR2的基因表达。图 6显示 DAR2在正常条件下
表达量比较低, 但受氯化钠诱导, 并在6 h和12 h时诱
导最强。这说明 DAR2是一个响应盐胁迫的基因。
为进一步了解氯化钠处理后 DAR2 的表达模式,
将 pDAR2::GUS 转基因拟南芥在正常 MS 上分别培
养 1 d和 3 d后, 分别用MS液体培养基(未处理的平
行对照)和含有 200 mmol·L−1氯化钠的 MS液体培养
基处理 3 h, 取样进行组织化学染色。GUS染色结果
显示正常萌发 1 d 时, DAR2 表达主要集中在胚根,
而在氯化钠处理后, DAR2 表达向胚轴扩散(图 7A,
7B); 正常萌发 3 d时, DAR2在根及子叶叶脉中表达
(图 7C), 而氯化钠处理后, DAR2 在子叶叶片表达明
显增强(图 7D)。DAR2 在种子的胚根和子叶中的表
达受到氯化钠胁迫的诱导, 暗示着该基因可能在植
物萌发转绿这个早期幼苗生长阶段响应盐胁迫的应
答中发挥作用。
2.4 dar2-3突变体在萌发和转绿期对盐胁迫敏感
在盐胁迫处理下, 萌发 1 d的种子胚根和萌发 3 d
的幼苗根、子叶中 DAR2基因表达受诱导, 这说明该
基因的缺失很可能会影响到植物在萌发转绿期对盐
胁迫的响应。为了验证上面的假设, 首先将 Col-0以及
dar2-3突变体种子分别点播在添加 0、100 mmol·L−1和
150 mmol·L−1氯化钠的MS培养基上, 对种子的萌发
进行统计。在正常 MS培养基上, 突变体萌发情况和
野生型无明显差异(图 8A)。在不同浓度氯化钠处理
后, dar2-3突变体和野生型种子的萌发较MS对照都
受到了氯化钠的抑制。但在 100 mmol·L−1氯化钠处
理条件下 , 突变体萌发受抑制的情况要比野生
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图 5 dar2-3与 lrd3突变体的等位分析
Fig. 5 Allelic analysis of dar2-3 and lrd3
在 MS上生长 8 d的 Col-0、dar2-3、lrd3、Ler、dar2-3 × lrd3
F1以及 dar2-3 × Ler F1幼苗根长的比较。Roots of dar2-3 (Col-0
background), lrd3 (Ler background), dar2-3 × lrd3 F1 generation and
dar2-3 × Ler F1 generation showing a reduction in length with respect
to controls (Col-0 and Ler) of 8 DAG seedlings on MS medium.

图 6 氯化钠诱导 DAR2基因的表达
Fig. 6 Expression of DAR2 induced by NaCl
野生型 Col-0 在正常 MS 培养基上生长 10 d 后, 将幼苗用
200 mmol·L−1氯化钠分别处理 0、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h。
The wild type Col-0 was grown in normal MS medium for 10 days,
then the seedlings were treated with 200 mmol·L−1 NaCl for 0, 0.5 h,
1 h, 3 h, 6 h and 12 h six time points.

型略明显(图 8B)。当氯化钠浓度提高到 150 mmol·L−1
时, 可以观察到 dar2-3 突变体种子萌发受抑制程度
明显高于野生型(图 8C), 尤其是在第 2 d 突变体萌
发率仅为 10%, 而 Col-0的萌发率高达 60%。该结果
说明 DAR2 基因参与了拟南芥种子萌发阶段对盐胁
迫的响应。

图 7 氯化钠胁迫诱导 DAR2的组织表达
Fig. 7 Tissue expression of DAR2 induced by NaCl
A: pDAR2::GUS转基因拟南芥在正常MS上分别培养 1 d后,
进行 GUS 染色的结果。B: pDAR2::GUS 转基因植物在正常 MS
上培养 1 d后, 用 200 mmol·L−1氯化钠处理 3 h进行 GUS染色的
结果。C: pDAR2::GUS 转基因植物在正常 MS上培养 3 d后, 进
行 GUS染色的结果。D: pDAR2::GUS转基因植物在正常 MS上
分别培养 3 d后, 用 200 mmol·L−1氯化钠处理 3 h进行 GUS染色
的结果。A−D: GUS activity at different stages of germination. A:, 1
DAG seedling; B:, 1 DAG seedling with NaCl; C, : 3 DAG seedling;
D, : 3 DAG seedling with NaCl.

盐胁迫下萌发种子的子叶能否转绿是幼苗形态
建立的前提。为了解 DAR2是否参与盐胁迫下子叶的
转绿过程, 分析了氯化钠对 dar2-3突变体子叶转绿的
影响。如图 9A所示, 在正常生长条件下, 突变体和野
生型的转绿没有明显差异。在浓度为 100 mmol·L−1
氯化钠处理之后, dar2-3 突变体和 Col-0 野生型种子
的转绿都受到抑制。但突变体在 100 mmol·L−1氯化
钠条件下转绿与野生型相比要向后推迟 1 d, 第 8 d
时总转绿率较野生型降低 20%, 表明 dar2-3突变体转
绿对氯化钠的抑制作用更敏感(图 9B)。在氯化钠

图 8 萌发期野生型 Col-0和 dar2-3突变体对氯化钠的响应
Fig. 8 Wild type Col-0 and dar2-3 mutant response to NaCl during germination stage
本研究记录的是种子萌发 1~6 d的数据。A: 在 MS培养基上 Col-0和 dar2-3的萌发率随时间的变化。B: 在 100 mmol·L−1氯化钠上
Col-0和 dar2-3的萌发率随时间的变化。C: 在 150 mmol·L−1氯化钠上 Col-0和 dar2-3的萌发率随时间的变化。共 3次生物学重复, 每个
点代表平均值±标准差。Germination rates of Col-0 and the dar2-3 mutant in response to increasing concentration (A, 0; B, 100 mmol·L−1; C, 150
mmol·L−1) of NaCl were shown in the figures. Germination was recorded at 1−6 days after stratification. Three independent experiments were
conducted, each point represented mean ± standard deviation.
第 1期 杨 磊等: 拟南芥 DA1-Related Protein 2基因参与调控植物对盐胁迫的响应 69



图 9 子叶转绿期野生型 Col-0和 dar2-3突变体对氯化钠的响应
Fig. 9 Wild type Col-0 and dar2-3 mutant response to NaCl during greening stage
本研究记录的是种子转绿 1~8 d的数据。A: 在 MS培养基上 Col-0和 dar2-3的转绿率随时间的变化; B: 在 100 mmol·L−1氯化钠
上Col-0和 dar2-3的转绿率随时间的变化。共 3次生物学重复, 每个点代表平均值±标准差。Greening rates of Col-0 and the dar2-3 mutant
in response to increasing concentration (A, 0; B, 100 mmol·L−1) of NaCl were shown in the figures. Greening rate was recorded at 1−8 days
after stratification. Three independent experiments were conducted, each point represents mean ± standard deviation.

浓度增大为 150 mmol·L−1 时, 由于浓度过高, 野生
型和突变体均不能转绿(结果没有显示)。以上结果表
明 DAR2 基因缺失也会导致拟南芥在转绿期对氯化
钠敏感性增强。
2.5 dar2-3突变体在萌发和转绿期对渗透胁迫敏感
性增强
盐胁迫对植物会造成离子胁迫和渗透胁迫两种
危害。为进一步确定 dar2-3突变体是对渗透胁迫还
是特异对离子胁迫的敏感性发生了改变 ,检测了突
变体对氯化钾和甘露醇的响应。由于在前期预试验
中发现, 在 150 mmol·L−1氯化钾和 200 mmol·L−1甘
露醇处理时, dar2-3突变体与 Col-0野生型种子萌发
有最明显差异, 所以这两个浓度被用于种子萌发以
及幼苗转绿时在氯化钾和甘露醇处理下表型观察试
验中。如图 10B所示, 在 150 mmol·L−1氯化钾处理
后, 可以观察到 dar2-3 突变体种子萌发受抑制程度
明显高于野生型, 尤其是在第 1.5 d 时萌发率仅为
40%, 而 Col-0的萌发率高达 80%。而且在萌发后 6 d
时, 突变体只有 80%的种子萌发, 而野生型 100%种
子萌发。这与之前氯化钠处理的结果类似, 说明突
变体种子萌发不是特异对氯化钠或氯化钾的敏感性
发生了变化。进而在 200 mmol·L−1 甘露醇处理时,
dar2-3 突变体种子萌发受抑制情况较 Col-0 野生型
更明显, 尤其是在 2.5 d 时突变体萌发率仅为 38%,
而 Col-0的萌发率高达 70% (图 10C)。说明突变体的
种子萌发对甘露醇造成的渗透胁迫敏感性增强。由
此可以得出, DAR2可能参与萌发过程中对渗透胁迫
而非特异离子胁迫的响应。
预试验表明 150 mmol·L−1的氯化钾和 200 mmol·L−1
的甘露醇处理时突变体和野生型转绿受抑制的差异
最明显, 而 150 mmol·L−1氯化钾由于浓度过高几乎
全部抑制 dar2-3突变体与 Col-0野生型转绿(数据未
出示)。因此, 接下来的试验中选择 150 mmol·L−1的
氯化钾和 200 mmol·L−1的甘露醇处理进行突变体的
表型分析。如图 11所示, 在 150 mmol·L−1氯化钾和
200 mmol·L−1甘露醇处理时, dar2-3突变体和 Col-0
野生型种子的转绿也受到抑制。在 150 mmol·L−1氯
化钾处理的第 3~3.5 d 时, dar2-3 突变体转绿率比
Col-0野生型降低 30%~40%(图 11B)。此外, 在甘露
醇处理后的第 3~3.5 d dar2-3 种子转绿受抑制程度

图 10 萌发期野生型 Col-0和 dar2-3突变体对渗透胁迫的响应
Fig. 10 Wild type Col-0 and dar2-3 mutant response to osmotic stress during germination stage
本研究记录的是种子萌发 1~6 d的数据。A: 在 MS生长的 Col-0和 dar2-3的萌发随时间的变化情况。B: 在 150 mmol·L−1氯化
钾上生长的 Col-0和 dar2-3的萌发随时间的变化情况。C: 200 mmol·L−1甘露醇上生长的 Col-0和 dar2-3的萌发随时间的变化情况。
共 3次生物学重复, 每个点代表平均值±标准差。Germination rates of Col-0 and the dar2-3 mutant in response to different treatments (A.
control; B. 150 mmol·L−1 KCl; C. 200 mmol·L−1 mannitol) were shown in the figures. Germination rate was recorded at 1−6 days after strati-
fication. Three independent experiments were conducted, each point represents mean ± standard deviation.
70 中国生态农业学报 2014 第 22卷



图 11 转绿期野生型 Col-0和 dar2-3突变体对渗透胁迫的响应
Fig. 11 Wild type Col-0 and dar2-3 mutant response to osmotic stress during greening stage
A: 在 MS 生长的 Col-0 和 dar2-3的转绿随时间的变化情况。B: 在 150 mmol·L−1 氯化钾上生长的 Col-0 和 dar2-3的转绿随时间
的变化情况。C: 在 200 mmol·L−1甘露醇上生长的 Col-0和 dar2-3的转绿随时间的变化情况。共 3次生物学重复, 每个点代表平均值±
标准差。Greening rates of Col-0 and the dar2-3 mutant in response to different treatments (A. control; B. 150 mmol·L−1 KCl; C. 200
mmol·L−1 mannitol) were shown in the figures. Greening rate was recorded at 1−6 days after stratification. Three independent experiments
were conducted, each point represents mean ± standard deviation.

也比野生型大(图 11C)。由此可以得出, dar2-3突变
体在转绿期对氯化钠、氯化钾和甘露醇所造成的胁
迫均表现出敏感的表型, DAR2可能参与转绿过程中
对渗透胁迫而非特异对离子胁迫的响应。
2.6 氯化钠胁迫下主根的生长发育
DAR2调控正常条件下拟南芥幼苗主根生长[15−16]。
为了检测 DAR2 是否也参与盐胁迫下植物主根的可
塑性发育, 观察了不同浓度盐处理对 dar2-3和Col-0
野生型主根生长的抑制情况。将在 MS 培养基萌发
生长 7 d的突变体和野生型幼苗, 分别转至对照 MS
培养基及添加 100 mmol·L−1 和 150 mmol·L−1 氯

图 12 氯化钠处理下野生型 Col-0和 dar2-3突变体主根
的生长
Fig. 12 Wild type Col-0 and dar2-3 mutant primary root
growth under NaCl stress
将在 MS上培养 7 d的 dar2-3和 Col-0拟南芥幼苗转移到
MS、100 mmol·L−1氯化钠和 150 mmol·L−1氯化钠上竖直培养
5 d 后统计的主根相对生长。共 3 次生物学重复 , 每个点代表平
均值±标准差, *代表显著性差异P<0.05, **代表显著性差异 P<0.01。
7 DAG dar2-3 and Col-0 on MS medium were transferred to in-
creasing concentrations (A: 0; B: 100 mmol·L−1; C: 150 mmol·L−1)
of NaCl, and primary roots were analyzed at 5 days. Three inde-
pendent experiments were conducted, each point represents
mean ± standard deviation. Asterisks indicate a significant differ-
ence (Student’s t test, * P < 0.05, ** P < 0.01) between Col-0 and
the mutant.
化钠的 MS 培养基上, 竖直培养 5 d 后统计主根长
度。统计结果显示, 在正常 MS培养基上, dar2-3突
变体与 Col-0 相比主根生长被抑制 30%(图 1A)。以
二者各自在 MS上生长长度为 1, 100 mmol·L−1氯化
钠处理时, dar2-3突变体相对生长比野生型 Col-0降
低 20%; 而 150 mmol·L−1氯化钠处理时, dar2-3主根
相对生长长度比 Col-0 降低 50%。以上结果表明,
DAR2 基因不仅参与了植物根系在正常条件下的可
塑性发育过程, 还参与了植物根系在盐胁迫条件下
的可塑性发育过程。
3 讨论
在我们的研究中, dar2-3 突变体最初是从盐胁
迫处理条件下筛选出来的具有短根表型的突变体 ,
之后我们研究了突变体在早期发育的种子萌发和转
绿过程中是否参与了对盐胁迫的响应。本试验中首
先在氯化钠处理下 , DAR2 基因半定量检测和
pDAR2::GUS 表达分析, 结果表明经过氯化钠处理
可以诱导 DAR2基因表达。进一步的结果显示 dar2-3
突变体对氯化钠、氯化钾和甘露醇的胁迫处理敏感,
这是由于非特异性的离子胁迫和渗透胁迫造成的。
而且在前期的摸索阶段我们也已经证明, dar2-3 突
变体这种非特异性离子胁迫和渗透胁迫的敏感表型
是不依赖于 ABA 的(文中没有出示结果)。DAR2 在
种子萌发和转绿过程中促进了植物对盐胁迫的耐受,
DAR2 基因很可能作为植物早期发育过程中, 应对
外界盐胁迫逆境的一个重要的调控因子, 保证植物
在早期发育过程中更好地抵抗盐胁迫, 从而完成整
个生命周期。
我们在对 dar2-3突变体盐胁迫下根系发育的研
究结果显示, DAR2基因缺失不仅导致 dar2-3突变体
在正常生长条件下主根生长受到抑制, 在盐胁迫下
主根受抑制程度更加明显。这表明该基因不仅参与
第 1期 杨 磊等: 拟南芥 DA1-Related Protein 2基因参与调控植物对盐胁迫的响应 71


调控了拟南芥在正常条件下的根系可塑性发育, 同
时也参与到了在盐胁迫条件下根系可塑性发育的调
控。结合其在种子萌发转绿阶段的调控作用, 推理
DAR2 基因很可能参与调控植物生长发育过程中多
个时期对盐胁迫的响应, 是植物应对盐胁迫机制中
一个具有广泛作用的调控因子。推测 DAR2 基因很
可能参与调控植物生长发育过程中多个时期对盐胁
迫的响应。
DAR2 蛋白是一个含 LIM 结构域和锌指结构域
的蛋白。该 DAR2 可能介导蛋白与蛋白间相互作用
和蛋白质的泛素化降解过程[17−18]。在促进植物对盐
胁迫的耐受响应时, 可能是通过介导盐胁迫下种子
萌发转绿过程中一系列相关蛋白的互作和蛋白的降
解来调控植物在盐胁迫下的早期生长发育。此外 ,
该蛋白还参与调控正常条件下和盐胁迫下植物根系
的生长发育。因此 DAR2 蛋白很可能通过调控根尖
激素的合成和分布来调控植物根系逆境下的可塑性
发育, 从而可能会促进植物整个生命周期对盐胁迫
的耐受。所以, 未来的工作应通过同源克隆, 将该基
因的同源蛋白在作物, 如水稻、小麦和大豆等中进
行过表达, 并对其在盐胁迫条件下的耐盐性进行分
析, 为改良农作物性状提高抗逆能力提供更加完善
的理论基础, 最终达到改良作物对盐胁迫耐受的目
的, 以期为世界盐渍土壤的利用起到一定的指导作
用, 最终解决由于人口增多、可耕地面积减少造成
的粮食问题。
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