全 文 ：·药材与资源·
基因枪转化双价防卫基因获得抗立枯病白术
毛碧增, 孙　丽, 刘雪辉Ξ
(浙江大学生物技术研究所, 浙江 杭州　310029)
摘　要: 目的　通过基因工程育种获得抗病转基因白术株系。方法　在已建立的高效白术茎尖再生体系基础上, 利
用基因枪介导法转化水稻几丁质酶基因 (R CH 10) 和苜蓿Β21, 32葡聚糖酶基因 (A GL U ) , 对所获得的转基因株系进
行PCR 分析、GU S 染色以及抗病性检测。结果　获得了25 个PCR 检测阳性的转基因株系, 其中5 个株系对白术立
枯病抗性增强。结论　利用转基因技术获得抗病新株系, 可以缩短抗病品种育种年限, 同时拓宽了白术抗病育种的
基因库。
关键词: 转基因白术; 几丁质酶; Β21, 32葡聚糖酶; 立枯病抗性
中图分类号: R 28211　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2008) 01 0099 04
Tran sgen ic A tracty lodes m acrocep ha la w ith double defen se genes exh ib it ing resistance
to R h izocton ia solan i
M AO B i2zeng, SUN L i, L IU Xue2hu i
( Inst itu te of B io techno logy, Zhejiang U niversity, H angzhou 310029, Ch ina)
Abstract: Objective　T he tran sgen ic A tracty lod es m acrocep ha la resistance to R h iz octon ia solan i w as
ob ta ined by gene engineering1 M ethods　O n the base of the eff icien t regenera t ion system of Baizhu via
shoo t o rganogenesis, the rice ch it inase gene (R CH 10) and the alfa lfa Β21, 32glucanase gene (A GL U ) w ere
tandem 2in serted in to the tran sfo rm at ion vecto r pB 101, w h ich w as tran sfo rm ed in to A 1 m acrocep ha la w ith
gene gun1 T ran sfo rm an ts w ere confirm ed by PCR , GU S assay, and disease resistan t1 Results　Tw en ty2
f ive independen t t ran sfo rm an ts po ssessed desired genes w ere ob served by PCR detect ion, and among them
five tran sfo rm an ts exh ib it ing resistance to R h iz octon ia solan i1 Conclusion　T he disease resistan t variety
has been ob ta ined by tran sfo rm at ion, w h ich p rovides a sho rten avenue fo r the direct in t roduct ion of novel
t ra its in to A 1 m acrocep ha la th rough genet ic engineering w ithou t the need fo r num erou s back2cro ssing in
b reeding p rogram s that slow dow n cu lt ivar imp rovem en t, m eanw h ile it imp roves disease resistan t
gene poo l1
Key words: t ran sgen ic A tracty lod es m acrocep ha la Ko idz1; ch it inase; Β21, 32glucanase; resistance to
R h iz octon ia solan i
　　白术是菊科苍术属植物白术 A tracty lod es
m acrocep ha la Ko idz1 的干燥根茎, 主产于浙江、安
徽等地, 在《神农本草经》中列为上品。白术属补益类
中药, 具健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效[1 ]。
随着研究深入, 发现白术还具有抗炎[2 ]、抗肿瘤[3, 4 ]、
止腹泻[5 ]等作用。
中药的安全、有效和稳定是实现中药现代化的
关键。在中药材规范栽培中, 病害防治是最关键的环
节。随着栽培规模的扩大, 白术受到病原物的危害逐
渐增强, 立枯病、根腐病、白绢病等病害都是白术生
长各阶段的重要病害。一般病虫害可导致减产
20%～ 30% , 严重的高达50% , 甚至绝收[6 ]。目前, 化
学防治是常用手段, 但农药的长期及不规范使用, 在
造成了环境污染、农药残留超标以及病害的抗药性
同时, 也降低了中药材的质量, 影响着药理品质, 已
成为我国药用植物持续发展和中药材出口创汇的重
·99·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2007204209
基金项目: 浙江省科技厅2005 年重点和重大课题资助项目 (2005C13016, 2005C22080)
作者简介: 毛碧增 (1972—) , 女, 副研究员, 硕士生导师, 在职博士生, 主要从事植物组织培养以及抗病分子育种, 承担了多项省部级课
题, 获得2006 年农业部农牧渔业丰收奖三等奖 (第一完成人)。　T el: (0571) 86971678　E2m ail: m aobz@zju. edu. cn
要障碍。
在病害防治策略中, 抗性品种的应用是最为经
济有效的方法, 而基因工程育种是解决这一问题的
理想手段。笔者通过基因枪转化几丁质酶基因
(R CH 10)和苜缩Β21, 32葡聚糖酶基因 (A GL U ) 双价
表达盒, 得到了抗立枯病的转基因白术株系, 增加了
白术抗立枯病育种的基因资源。
1　材料与方法
111　药材: 白术A tracty lod es m acrocep ha la Ko idz1
由浙江省磐安县中药材研究所提供。转化质粒为
pZ100 (图 1) , 为 R CH 10 和 A GL U 串联构建于
pB I101, 分别由 35S 启动子和 35S 增强子启动基因
表达 (由朱群博士惠赠) ; 基因枪为B io list icR PD S—
1000öH e (B IO 2RAD ) ; 立枯病菌R h iz octon ia solan i
Kuhn1 株由浙江大学植保系真菌研究室提供的强
致病力菌株A G2122B。
图 1　转基因pZ100 质粒图谱
F ig. 1　M ap of tran sgen ic pZ100 plasm id
112　基因枪介导的白术遗传转化
11211　白术苗对卡那霉素 (kanam ycin, Kan) 的本
底抗性: 取 2～ 3 cm 高的小苗分别接种到含Kan 不
同质量浓度 (0、10、20、30、40、50 m göL ) 的增殖培养
基 (M S+ 0. 5 m göL TD Z+ 0. 2 m göL NAA ) 上, 每
个浓度 6 瓶, 每瓶 5 株苗, 重复 3 次。数据统计采用
D uncan 的新复极差测验的多重比较法 (SSR ) [7 ]。
11212　基因枪轰击茎尖组织及转化子的筛选: 利用
本实验室已建立的高效基因枪转化体系, 把质粒
pZ100 导入白术茎尖, 轰击转化参数参考文献的方
法[8 ]。经轰击的茎尖组织接种到增殖培养基 (M S+
0. 5 m göL TD Z+ 0. 2 m göL NAA ) 恢复培养一周,
然后接种于含Kan 的筛选培养基筛选抗性转化子。
113　转基因植株的PCR 检测
11311　转基因植株的DNA 提取: 称取0. 1 g 叶片放
入1. 5 mL 的离心管中, 加入400 ΛL 提取缓冲液T PS
(100 mmo löL T ris2HC l pH 8. 0; 10 mmo löL ED 2
TA pH 8. 0; 1. 0 mmo löL KC l) , 用1 mL 的枪头将
叶片捣醉后放置 75 ℃的水浴锅温浴 20 m in,
12 000 röm in离心 10 m in, 取上清液加入等体积的
异丙醇, 轻轻混匀, 8 000 röm in 离心 10 m in, 取沉
淀, 加入 200 ΛL 70% 的乙醇, 8 000 röm in 离心 5
m in, 弃上清, 将沉淀干燥, 溶于T E 缓冲液, 经RNA
酶消化后, 再经沉淀纯化。制备的DNA 样品用于
PCR 分析。
11312　转基因植株的 PCR 扩增: N P T II 基因的引
物为FP: 5’CTCGA CGT T GTCA CT GAA G 3’; R P:
5’TCGTCCA GA TCA TCCT GA TC 3’, 扩增条件:
94 ℃ 1 m in, 58 ℃ 1 m in, 72 ℃、30 s。A GL U 基因的
引物为 FP: 5’GGT GT GCCTAA T TCCGA CCT TC
3’; R P: 5’GTA GCCCAA GGCCT TCT T GGA G 3’,
扩增条件: 94 ℃ 1 m in, 61 ℃ 1 m in, 72 ℃ 30 s。
R CH 10 基 因 的 引 物 为 FP: 5’TCCTA CAA 2
CT TCAA CTA CG 3’; R P: 5’A TCA CT GT 2GT G2
GAA GCTA GG 3’, 扩增条件 94 ℃ 1 m in, 51 ℃ 1
m in, 72 ℃ 30 s 所有反应循环 35 次, 72 ℃延伸 10
m in, 反应产物于1. 0% 琼脂糖电泳检查。
114　转基因植株的组织化学染色: GU S 活性的组
织化学染色分析参照Jefferson 等[9 ]的方法检测。取
转化植株的根与含底物X2Gluc (52溴242氯232吲哚2Β2D 2葡糖醛酸, Sigm a)的染色反应液于37 ℃过夜。
115　转基因白术对立枯病的抗性检测: 实验在人工
智能气候箱内进行, 将转基因PCR 阳性植株按株系
种植, 在苗期接种立枯病病菌。将立枯病病菌接种于
PDA 培养基, 26 ℃培养3 d。5 mm ×5 mm 的菌块接
种于植株茎基部, 保持温度26 ℃, 湿度90%。7 d 后
调查病情。
2　结果与分析
211　白术对Kan 的本底抗性: 白术小苗在添加了不
同质量浓度Kan 的增殖培养中培养一个月后, 发现
Kan 对芽增殖分化以及苗的生长势具有极显著的差
异, 见表1。
表 1　不同质量浓度卡那霉素对芽增殖的影响
Table 1　Effect of Kan concen tration on prol iferation
of shoots
Kanö(m g·L - 1) 增殖倍数 生长势
0 5. 08±0. 10 A 植株健壮, 叶色浓绿
10 4. 53±0. 15 B 新叶黄白色
20 2. 78±0. 12 C 新叶黄白色
30 1. 40±0. 09 D 叶片变黄加快
40 0. 00±0. 00 E 植株死亡
50 0. 00±0. 00 E 植株死亡
　　字母不同者表示相互间存在差异 (P≤0. 01)
V alues fo llow ed by differen t letters are sign ifican tly differen t at
P≤0. 01
在实验中也发现, 培养基中Kan 为10～ 20 m gö
L 时, 植株新叶呈黄白色, 增殖分化能力降低; Kan
·001· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
达到 30 m göL , 植株变黄趋势加快, 基本上不分化;
Kan 超过40 m göL 时, 植株完全不能分化, 培养过程
中苗体逐渐变黄1 个月后全部死亡。因此本实验采
用40 m göL Kan 筛选转化后的茎尖。
212　转基因植株的获得: 利用基因枪介导法共转化
了 812 个茎尖组织, 转化后的茎尖组织在无抗生素
的增殖培养基 (M S+ 0. 5 m göL TD Z+ 0. 2 m göL
NAA )上恢复一周后, 转入筛选培养基 (含有Kan 40
m göL 的增殖培养基) 中进行筛选, 获得抗性株系 48
个, 并得到了生长势正常的 39 个独立转化株系, 独
立转化子按株系种植, T 0 代植株在温室内生长形态
和野生型相似, 能正常开花结果, 但块茎偏小, 是第
一代组培苗的普遍现象, 转基因植株可以作为育种
材料。转基因抗性茎尖组织、抗性植株以及盆栽苗见
图2。
A 2抗性茎尖　B2抗性茎尖的快繁　C2转基因植株的根　D 2移
栽前转基因植株的根系　E2移栽 2 个月后的转基因植株　F2开
花的转基因植株
A 2p roduction of Kan2resistan t transgen ic shoo ts of A 1 m acro2
cep ha la　B2p ro liferation of Kan2resistan t transgen ic shoo ts　C2
roo ts of transgen ic p lan tlets　D 2transgen ic p lan tlets w ith in v it2
ro2regenerated roo t system befo re transfer to so il　E2in v itro2
regenerated transgen ic p lan tlets 2 month s after transfer to so il
　F2m ature no rm al transgen ic p lan ts p roduced in greenhouse
图 2　转基因白术各生长阶段
F ig. 2　Var ious growing stages of tran sgen ic
A 1 m acrocep ha la
213　转基因植株的PCR 检测: 提取Kan 抗性白术
叶片的DNA , 以pZ100 质粒为阳性对照, 野生型为
阴性对照, 分别用3 对引物进行扩增 (图3)。结果表
明, 39 个独立转化子中有25 个转化子能扩增出各基
因相应的目的片段, 而且这 25 个转化子同时具有 3
个基因的目的片段, 揭示了双价基因表达盒完整的
导入了植株中。
214　GU S 染色: 将PCR 阳性的不同T 0 代转基因株
系和野生型植株的根浸入含有X2Gluc 的染色反应
　M 21 kb 的DNA 标记　P2阳性质粒　W T 2野生型
　1～ 82不同的转基因株系
　M 21 kb DNA ladder　P2p lasm id con tro l　W T 2w ild type
　1—82various transgen ic lines
图 3　转基因白术的PCR 检测
F ig. 3　PCR D etection of T0 tran sgen ic plan ts
液, 37 ℃保温过夜。结果显示野生型不显色, 转基因
植株的根显示蓝色, 而且有的株系根蓝色显示程度
有差异 (图 4) , 表明GU S 基因已整合到白术的基因
组中并进行了组成性表达且表达程度有差异。
A 2野生型　B～D 2转基因株系
A 2w ild type　B—D 2transgen ic lines
图 4　GUS 检测
F ig. 4　GUS Sta in ing assay
215　转基因植株的抗病性: 取其中 15 个PCR 反应
为阳性的株系 (每株系 3 株) 进行立枯病抗性检测。
实验结果显示不同转基因株系的抗病性存在着较大
的差异, 但都比野生型抗病性强, 见图5。通过本研究
得到了 5 个抗性比较强的株系, 可以作为进一步研
究抗病分子育种的材料。
3　讨论
通过基因操作, 人们可以获得产量、品质、抗病
虫害、抗逆性改良的转基因材料, 大大拓宽了育种的
基因库。白术由于多年种植, 导致真菌病害严重。真
菌细胞壁的主要成分是几丁质和葡聚糖, 几丁质酶
和 Β21, 32葡聚糖酶具有降解几丁质和葡聚糖的作
用。近10 年来, 许多研究者致力于利用转基因技术
转化水解酶如几丁质酶基因和 (或)葡聚糖酶基因创
造了水稻[10, 11 ]、油菜[12 ]等一批抗真菌病害的种质资
源, 同时也证实了共转化几丁质酶基因和葡聚糖酶
·101·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
A 2野生型植株　B2野生型茎部症状
C2转基因植株　D 2转基因植株茎部症状
A 2symp tom of w ho le w ild type p lan t　B2symp tom of w ild type
p lan t stem apex　C2symp tom of w ho le transgen ic p lan t
D 2symp tom of transgen ic p lan t stem apex
图 5　转基因植株的抗病性检测
F ig. 5　T0 Tran sgen ic plan ts resistance to R 1 solan i
基因 (双价基因)能同时表达多个防卫基因以获得更
强的抗病性的可能[13, 14 ]。因此利用基因工程技术转
化几丁质酶和Β21, 32葡聚糖酶基因培养抗真菌病害
的转基因白术作为育种材料成为一种可能。
因为几丁质酶基因和葡聚糖酶基因 (双价基因)
的共转化能获得更强的抗病性, 为此通过基因枪法
实现了几丁质酶和Β21, 32葡聚糖酶基因导入白术。
在39 个抗Kan 的独立转化子中, 得到了25 个具有目
的基因的转化子, 出现的14 个假抗性的转基因株系
可能与在筛选后期抗生素作用的衰退而降低了筛选
浓度所致, 所以在挑选抗性株系时应该关注培养中
期所存活的转化子。此外, 在25 个能扩增出N P T Ê
基因的转化子都能扩增出目的基因A GL U 的片段,
以及GU S 的染色结果都证实了双价基因表达盒已
整合到了白术的基因组中, 5个抗性增强的转基因
白术株系更加明确了两个防卫基因的作用, 这对拓
宽白术抗病育种基因库具有重要的意义。下一步将
深入研究转基因白术对其他真菌病害的抗性以及抗
性的遗传。
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