全 文 ：狭叶五味子中化合物扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸
体外抗乙型肝炎病毒活性研究
饶贤高1 ,2 ,肖伟烈3 ,杨柳萌2 ,孙汉董3 ,傅颖媛1 ,郑永唐2 3
(11 南昌大学医学院 免疫学教研室 ,江西 南昌 　330006 ; 21 中国科学院昆明动物研究所 动物模型和人类疾病
机理重点实验室 分子免疫药理学实验室 ,云南 昆明 　650223 ; 31 中国科学院昆明植物研究所
植物化学与西部植物资源可持续利用国家重点实验室 ,云南 昆明 　650204)
摘 　要 :目的 　研究从狭叶五味子 S chisand ra lanci f olia 中分离化合物扁枝杉香豆素 (phyllocoumarin) 和 ( - )2
表儿茶酸[ ( - )2epicatechin ]的体外抗乙型肝炎病毒 ( HBV) 活性。方法 　为了筛选和确认扁枝杉香豆素和 ( - )2
表儿茶酸体外抗 HBV 活性 ,以 Hep G2. 2. 15 细胞为体外研究 HBV 模型 ,分别用 RPMI 1640 完全培养基稀释不
同质量浓度的药物作用于细胞 ,培养 3 d 后收集上清 ,采用 M T T 法检测药物对 Hep G2. 2. 15 细胞的生长影响和
EL ISA 法检测培养上清中 HBsAg 和 HBeAg 的水平 ,评价扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸对 HBsAg 和 HBeAg
的影响。结果 　扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸具有一定的体外抗 HBV 活性 ,其细胞毒性非常小 ,CC50 均大于
200μg/ mL 。扁枝杉香豆素具有较强的抑制 HBsAg 和 HBeAg 分泌作用。阳性对照药物阿德福韦酯也抑制 HBV
HBsAg 和 HBeAg 分泌 ,但在相同质量浓度 (116μg/ mL) 下其抑制作用较扁枝杉香豆素弱。结论 　狭叶五味子
中化合物扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸具有一定体外抑制 HBV HBsAg 和 HBeAg 分泌的作用 ,从而起到抗
HBV 作用。
关键词 :狭叶五味子 ; 扁枝杉香豆素 ; ( - )2表儿茶酸 ; 乙型肝炎病毒 ( HBV) ; 抗 HBV 活性
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220248204
I n vit ro anti2HBV activities of phyllocoumarin and ( - )2epicatechin
from Schisa ndra la nci f olia
RAO Xian2gao1 ,2 , XIAO Wei2lie3 , YAN G Liu2meng2 , SUN Han2dong3 ,
FU Ying2yuan1 , ZH EN G Yong2tang2
(11Department of Immunology , Medical College of Nanchang University , Nanchang 330006 , China ; 2. Laboratory
of Molecular Immunopharmacology , Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms Kunming Institute
of Zoology , Chinese Academy of Sciences , Kunming 650223 , China ; 3. State Key Laboratory of Phytochemist ry and
Plant Resources in West China , Kunming Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Kunming 650204 , China)
Abstract : Objective 　To evaluate anti2HBV activities of p hyllocoumarin ( Ⅰ) and ( - )2epicatechin
( Ⅱ) f rom S chisand ra l anci f ol i a i n v i t ro. Methods 　To screen and confirm t he anti2HBV activities of
compounds , p hyllocoumarin and ( - )2picatechin , Hep G2. 2. 15 cells were used as HBV model i n vi t ro.
Different concent ration of p hyllocoumarin and ( - )2epicatechin were added to t he wells wit h t he growt h of
Hep G2. 2. 15 cells and t he supernatant was collected at t he third day. The cytotoxic activity on the growt h
of Hep G2. 2. 15 cells was detected by M T T. EL ISA for HBsAg and HBeAg assays was used to evaluate
t he effect s of p hyllocoumarin and ( - )2epicatechin on HBsAg and HBeAg secretion. Results 　Bot h
p hyllocoumarin and ( - )2epicatechin showed anti2HBV activity and exerted cytotoxicity against
Hep G2. 2. 15 cells with CC50 > 200μg/ mL . But p hyllocoumarin decreased t he levels of HBsAg and HBeAg
secretion more effectively than ( - )2epicatechin did. Compared wit h Adefovir Dipivoxil ( ADV) , p hyllo2
coumarin inhibited the secretion of HBsAg and HBeAg more effectively at t he same concent ration (1. 6μg/
mL ) . Conclusion 　Phyllocoumarin and ( - )2epicatechin are potential anti2HBV agent s ad show lower cyto2
toxicity.
Key words : S chisand ra l anci f ol i a (Rehd. et Wils) A. C. Smit h ; p hyllocoumarin ; ( - )2epicatechin ;
hepatitis B virus ( HBV) ; anti2HBV activity
·842· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008204214
基金项目 :国家重点基础研究发展计划 (973)资助项目 (2009CB522306) ; 中国科学院知识创新工程重要方向资助项目
( KSCX12YW2R224)
作者简介 :饶贤高 (1976 —) ,男 ,江西省人 ,在读硕士生 ,研究方向为抗病毒药物研究。3 通讯作者　郑永唐　Tel/ Fax : (0871) 5195684 　E2mail : zhengyt @mail . kiz. ac. cn
　　乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus , HBV) 属嗜
肝 DNA 病毒家族 ,是一种小的包膜病毒 ,包含松
弛、环状、部份双链的 312 kb DNA 基因组[1 ] ,能引
起急性和慢性肝脏感染。全世界大约有 5 亿多人感
染 HBV [ 2 ] 。有些慢性感染者可能进一步恶化发展
肝硬化和原发性肝癌[3 ] 。因此 HBV 已成为全球卫
生健康主要问题之一。
过去 20 多年里 ,干扰素 ( IFN) 在临床广泛用
来治疗慢性 HBV 感染性疾病。IFN 有效地发挥抗
HBV 功能主要通过两种机制[4 ] 。在临床治疗过程
中 IFN 虽起到一定的疗效 ,但总体效果低、成本
高[5 ] ,给病人带来严重的负面影响。FDA 批准抑制
HBV 多聚酶的几种核苷类药物[ 6 ] ,主要有拉米夫
定、阿德福韦酯、恩替卡韦等。其中拉米夫定疗效较
好 ,副作用也较少 ,但是在长期服药过程中易产生耐
药 , Ⅲ期临床实验表明 ,随着拉米夫定治疗时间延
长 ,患者耐药率也随着上升 ,经拉米夫定治疗 2 年后
约 31 % 病人产生耐药 ,治疗 4 年后约有 70 % 病人
发生耐药[7 ] 。多数研究评估 , IFN 和拉米夫定联合
用药治疗 HBV 感染病人效果比它们单独用药效果
好[8 ,9 ] ,但联合用药可能产生的负面影响和低效率
仍然存在。因此 ,需要不断研发新的 HBV 药物 ,从
天然资源和中草药中寻找有效抗 HBV 化合物是重
要途径之一。
我国科学家发现中药北五味子 S chisand ra
chi nensis ( Turcz. ) Baill . 粗提物及其多种有效成
分作用于多靶点 ,具有保肝解毒、抗氧化和抗 HBV
等多方面的作用 ,并研发成功联苯双酯和双环醇两
种具有我国自主知识产权的治疗肝炎药物[10 ] 。通
过对狭叶五味子 S chisand ra l anci f ol i a ( Rehd. et
Wils. ) A . C. Smit h 茎叶的化学成分和抗病毒活
性研究 ,发现了狭叶五味子二内酯 F (lancifodilac2
tone F) 和 lancifodilactone G 等多个具有抗 Ⅰ型艾
滋病病毒 ( HIV21) 活性的化合物[ 11～14 ] 。本实验对
来源于狭叶五味子的化合物扁枝杉香豆素[15 ] 和
( - )2表儿茶酸[16 ]抗 HBV 活性进行初步研究 ,为其
临床应用提供依据。
1 　材料与方法
111 　化合物扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸的分
离纯化 : 狭叶五味子 S . l anci f ol i a ( Rehd. et
Wils. ) A . C. Smit h 茎叶于 2002 年 8 月采集于云
南省大理地区 ,由中国科学院昆明植物研究所李锡
文研究员鉴定 ,标本 (No . KIB 2002208211) 存放于
昆明植物所植物化学与西部资源可持续利用国家重
点实验室。517 kg 干燥狭叶五味子茎和叶 ,粉碎后
用 70 % 丙酮浸泡 3 次 (每次 15 L ) ,每次 24 h ,提
取液合并 ,减压蒸馏 ,用醋酸乙酯萃取 ,得到醋酸乙
酯部分 101 g。硅胶拌样 ,氯仿2甲醇梯度 (10 ∶0、
9 ∶1、8 ∶1、5 ∶5、0 ∶10) 洗脱 ,用 TL C 进行检测 ,
合并相同流份 ,得 Ⅰ～ Ⅴ 5 个流份段。流份 Ⅲ用
MCI 脱色 (甲醇2水 , 0 ∶1、9 ∶1、1 ∶0、100 % 丙
酮) ,90 % 甲醇洗脱部分经硅胶柱色谱 (石油醚2醋
酸乙酯 ,9 ∶1、8 ∶2、5 ∶5) 分离得到 4 个流份段
A～D ,流份段 B 经过 Sep hadex L H220 (溶剂为甲
醇) 色谱得到 5 个流份段 a～e ,流份段 c 经半制备
HPL C (Rp218 ,甲醇2水 ,55 ∶45 和 54 ∶66) 分离得
到扁枝杉香豆素 (20 mg) 和 ( - )2表儿茶酸 ( 24
mg) ,其得率分别为 01007 % 和 01009 8 % ,质量分
数均大于 98 %。
112 　试剂 : RPMI 1640 培养基和胎牛血清 ( FBS)
购自 Gibco 公司 ;十二烷基磺酸钠 ( SDS) 、M T T、
N , N2二甲基甲酰胺 (DMF) 和 G418 均购自 Sigma
公司 ;阿德福韦酯 (ADV) 购自华美公司。HBsAg
和 HBeAg EL ISA 检测试剂盒购自上海科华生物
技术有限公司。
113 　仪器 :酶标仪 EL X —800 (BIO —TE K) ,微量
移液器 ( GIL SON ) , 倒置显微镜 Eclip se TS100
(Nikon) ;二级生物安全柜 Forma Class Ⅱ,CO2 细
胞培养箱为 Thermo 公司产品。
114 　细胞培养 : Hep G2. 2. 15 细胞由中国科学院生
物物理研究所唐宏研究员惠赠 ,能分泌 HBeAg、
HBsAg 和感染性完整病毒颗粒[17 ] 。细胞复苏培
养 :从液氮中取出细胞 ,37 ℃水浴快速复苏 ,直接
加入预温 RPMI 1640 完全培养基 (含 400μg/ mL
G418 , 10 % FBS , 2 mmol/ L L2Gln) 7 mL , 37 ℃、
5 % CO2培养。细胞每隔 1 d 换液 1 次 ,7 d 左右传
代 1 次。
115 　细胞毒性实验 :用 M T T 比色法测定化合物扁
枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸对细胞的毒性[18 ] 。
Hep G2. 2. 15 细胞在药物作用前 24 h 以 6 ×104 / 孔
铺于 96 孔板。用 RPMI 1640 完全培养基将化合物
稀释成 01064、0132、116、8、40、200μg/ mL ,每个质
量浓度设 3 个复孔 ,同时设置阴性对照孔 (细胞对
照) ,空白对照孔 (只加培养液) 及 ADV 药物 (116
μg/ mL) 对照孔。37 ℃、5 % CO2 培养箱培养 3 d
后 ,吸出培养基 110μL/ 孔 ,加 4 mg/ mL 的 M T T
溶液 10μL/ 孔 ,培养 4 h 后 ,100μL/ 孔 SDS2DMF
溶液溶解。EL x800 酶标仪测定吸光度 ( A ) 值 ,测
·942·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
定波长为 595 nm ,参考波长为 630 nm。计算出对
50 % Hep G2. 2. 15 细胞产生毒性的样品浓度 CC50
(50 % cytotoxic concent ration) 。
116 　EL ISA 法检测抗原 HBsAg 和 HBeAg 水平 :
Hep G2. 2. 15 细胞在药物作用前 24 h 以 6 ×104 / 孔
铺于 96 孔板。化合物采用 RPMI 1640 完全培养基
稀释 ,以 01064、0132、116、8、40、200μg/ mL 作用于
细胞 ,培养体系 200μL ,每个质量浓度设 3 个复孔 ,
同时设置阴性对照孔 ,空白对照孔及 ADV 药物对
照孔。37 ℃、5 % CO2培养箱培养 3 d ,收集细胞上
清 ,以 EL ISA 法检测 HBsAg 和 HBeAg 水平。结
果以化合物对抗原的抑制率表示。抑制率 = [ (阴性
对照孔 A 值 - 空白对照孔 A 值) - (实验孔 A 值 -
空白对照孔 A 值) ]/ (阴性对照孔 A 值 - 空白对照
孔 A 值) ×100 %。
117 　统计学处理 :实验资料以 x ±s 表示 ,采用
SPSS 1010 统计软件分析数据 ,对组间数据进行单
因素方差分析及 L SD2t 检验。
2 　结果
211 　化合物扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸对
Hep G2. 2. 15 细胞的毒性作用 :扁枝杉香豆素和
( - )2表儿茶酸对 Hep G2. 2. 15 细胞的毒性较小 ,
CC50均大于 200μg/ mL (图 1) 。与 ADV 阳性对照
药物相比较 ,相同质量浓度 116 μg/ mL 作用下
(
-
)2表儿茶酸对 Hep G2. 2. 15 细胞毒性比 ADV
毒性要小 ,116μg/ mL 时扁枝杉香豆素、( - )2表儿
茶酸及 ADV 组细胞存活率分别为 86145 %、
96138 %、83156 %。
图 1 　化合物扁枝杉香豆素和( - )2表儿茶酸对
HepG2. 2. 15 细胞的毒性作用 ( x ±s , n = 3)
Fig. 1 　Cytotoxicity of phyllocoumarin and ( - )2epicatechin
on HepG2. 2. 15 cells ( x ±s , n = 3)
212 　化合物扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸对
Hep G2. 2. 15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 抗原的
抑制作用 : Hep G2. 2. 15 细胞是稳定转染 HBV 的
细胞系 , 能稳定分泌 HBsAg、HBeAg 和感染性
HBV 颗粒。本实验采用 Hep G2. 2. 15 细胞系检测
扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸对 HBV 分泌 HB2
sAg 和 HBeAg 的抑制作用。与 ADV 阳性对照药
物相比较 ,扁枝杉香豆素对 HBV 分泌的 HBsAg
抑制效果较好 ,而 ( - )2表儿茶酸抑制作用稍弱 (表
1) ;与阴性对照相比较 ,各质量浓度对 HBV 分泌
HBeAg 均有抑制作用 ,而 ( - )2表儿茶酸只有在高
质量浓度 ( > 116μg/ mL) 下才有明显的抑制作用
(表 1) 。不同质量浓度 (200～01064μg/ mL) 的扁
枝杉香豆素在第 3 天对细胞培养上清 HBeAg 分泌
的抑制率为 45181 %～18162 % ,与阴性对照组比较
差异具有统计学意义 ( P < 0101 ,表 1) ;扁枝杉香豆
素 (200～1. 6μg/ mL) 对细胞培养上清 HBsAg 分
泌的抑制率为 52116 %～231 22 % ,与阴性对照组比
较差异具有统计学意义 ( P < 0105 ,表 1) 。( - )2表
儿茶酸在质量浓度为 200μg/ mL 时 ,第 3 天对细胞
培养上清 HBsAg 分泌的抑制率为 19169 % ,与阴性
对照组比较差异具有统计学意义 ( P < 0101 ,表 1) ;在
质量浓度为 200～1. 6μg/ mL 时 ,对细胞培养上清
HBeAg 分泌的抑制率为 27167 %～7100 % ,与阴性对
照组比较差异具有统计学意义 ( P < 0105 ,表 1) 。
表 1 　扁枝杉香豆素和( - )2表儿茶酸对 HepG2. 2. 15
细胞产生 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用
( x ±s , n = 3)
Table 1 　Inhibition of phyllocoumarin and ( - )2epicatechin
on HBsAg and HBeAg secretion of HepG2. 2. 15
cells ( x ±s , n = 3)
化合物
ρ/
(μg·mL - 1 )
HBsAg
A值 抑制率/ %
HBeAg
A值 抑制率/ %
阴性对照 　　- 2189 ±0131 - 2102 ±0121 -
ADV 　　116 2130 ±0104 3 3 20146 1178 ±0115 3 3 11192
扁枝杉香豆素 200 7139 ±0174 3 3 △△52116 1110 ±0111 3 3 △△45181
40 1169 ±0141 3 3 △ 41159 1150 ±0123 3 3 △ 26105
8 2109 ±0121 3 27173 1164 ±0111 3 3 18188
116 2122 ±0103 3 23122 1148 ±0113 3 3 △ 26183
0132 2133 ±0104 19157 1163 ±0114 3 3 19156
01064 2137 ±0118 18103 1164 ±0120 3 3 18162
(
-
)2表儿茶酸 200 2132 ±0122 3 3 19169 1146 ±0127 3 3 △ 27167
40 2160 ±0117 10121 1169 ±0108 3 3 16139
8 2. 36 ±0112 18142 1167 ±0115 3 3 17125
116 2153 ±0128 12138 1188 ±0108 3 7100
0132 2155 ±0109 11167 1198 ±0110 1192
01064 2152 ±0114 12179 2101 ±0111 0140
　　与阴性对照比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01
　　与 ADV 比较 : △P < 01 05 　△△P < 01 01
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs negative cont rol
　　△P < 01 05 　△△P < 01 01 vs ADV
·052· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 　讨论
　　HBV 引起的感染性疾病是预防性疾病。从
1983 年开始 ,全世界主要采取乙肝疫苗预防 HBV
感染 ,但有很大一部分人群注射了乙肝疫苗不能产
生乙肝抗体和疫苗覆盖面有限 ,导致乙肝病人持续
增多。因此 ,采取 HBV 药物治疗必不可少。由
FDA 批准的抗乙型肝炎病毒核苷类药物在临床上
有一定的疗效[6 ] ,但它们的负面影响很大和易产生
耐药性等问题 ,迫切需要开发新的具有高效低毒抗
乙型肝炎病毒药物 ,从天然资源和中草药中寻找有
效抗 HBV 的化合物是重要途径之一。我国科学家
基于北五味子中有效成分研发成功了联苯双酯和双
环醇两种治疗肝炎新药 ,有显著的保肝降转氨酶作
用和一定的抗肝炎病毒作用[ 10 ,19 ,20 ] 。通过对狭叶五
味子茎叶的化学成分和抗病毒活性研究 ,发现了
Lancifodilactone F 和 Lancifodilactone G 等多个具
有抗 HIV21 活性的化合物[11～14 ] 。同时 ,也对从狭
叶五味子中分离得到的部分化合物进行了抗 HBV
活性的筛选 ,发现化合物扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿
茶酸也具有一定的抗 HBV 活性作用。
本研究采用 M T T 法测定了化合物扁枝杉香豆
素和 ( - )2表儿茶酸对 Hep G2. 2. 15 细胞的毒性作
用 ,观察两者对 Hep G2. 2. 15 细胞本身的生长是否
有影响。结果表明 ,扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸
的 CC50 都大于 200μg/ mL ,说明扁枝杉香豆素和
( - )2表儿茶酸均对 Hep G2. 2. 15 细胞的毒性非常
小。与 ADV 阳性对照药物相比较 ,相同质量浓度
116μg/ mL 作用下扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸
组对 Hep G2. 2. 15 细胞存活率均在 86 % 以上 ,其
毒性比 ADV 小。
Hep G2. 2. 15 细 胞 是 稳 定 分 泌 HBsAg、
HBeAg 和感染性 HBV 颗粒 ,是目前体外抗 HBV
药物筛选和研究常用实验模型。本实验采用
Hep G2. 2. 15 细胞系检测扁枝杉香豆素和 ( - )2表
儿茶酸对 HBV 分泌的 HBsAg 和 HBeAg 抑制作
用。不同质量浓度的扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶
酸作用 Hep G2. 2. 15 细胞 3 d 后 ,对上清 HBsAg
和 HBeAg 均有抑制作用。与 ADV 阳性对照药物
相比较 ,其中扁枝杉香豆素对 HBV 分泌的 HBsAg
抑制效果较好 ,而 ( - )2表儿茶酸抑制作用稍弱 ;与
阴性对照相比较 ,在所有检测质量浓度下扁枝杉香
豆素对 HBV 分泌的 HBeAg 均有抑制作用 ,而
(
-
)2表儿茶酸只有在高质量浓度下才有明显的抑
制作用。这说明扁枝杉香豆素和 ( - )2表儿茶酸均
具有一定的体外抗 HBV 作用。
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