全 文 ：·1208· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
多球壳菌素诱导系膜细胞凋亡及对细胞周期调节蛋白基因表达谱的影响
陈 美1，江警予z，郝 燕1，周建华P
(1．华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科，湖北武汉4300302．武汉市中心医院药剂科，湖北武汉430030)
摘要：目的观察多球壳菌素(ISP一1)对体外培养的正常大鼠肾小球系膜细胞(GMC)的促凋亡作用，研究
ISP一1对细胞周期调节蛋白基因表达谱和凋亡相关蛋白Bax、Bcl一2表达的影响。方法体外培养大鼠GMC，加入
100／Jmol／LISP一1干预，分别于作用6、12、24、48h后以流式细胞术检测GMC凋亡，Hoechst33258／PI染色观察凋
亡细胞形态变化，琼脂糖DNA凝胶电泳法观察凋亡细胞核小体DNA的断裂现象，并通过SuperArrayReal—Time
PCR细胞周期基因芯片测定ISP一1对细胞周期调节蛋白基因表达谱的影响，Westernblotting法观察Bax和Bcl-2
蛋白的表达。结果ISP一1可显著诱导GMC凋亡，并呈一定的时间依赖性，作用48h后细胞凋亡最显著，Hoechst
33258／PI荧光染色法可见亮蓝色的凋亡小体，琼脂糖凝胶电泳可见凋亡梯度的出现；PCR细胞周期基因芯片检测
结果发现ISP一1可显著上调GMCRad51、Atm、Brcal、Caspase3、cyelinA2、cyclinC、chekl、cyclinBl、cyclinB2、
cyclinD2、cyclinF、Cdc25a和P27等一些与DNA损伤、凋亡和细胞周期调节蛋白相关的基因的表达；Western
blotting发现ISP一1可显著上调GMCBax蛋白表达，下调Bcl一2蛋白表达。结论ISP一1可时间依赖性诱导体外培
养的正常大鼠GMC凋亡，其机制与影响细胞周期调节蛋白及凋亡相关基因的表达有关。
关键词：多球壳菌素(ISP一1)，肾小球系膜细胞(GMC)，凋亡，细胞周期调节蛋白
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)08—1208—05
Inductionofmyriocinonapoptosisandeffectofmyriocinongeneexpressionprofiles
ofcellcycler gulatoryproteinsinglomerularmesangialcells
CHENMeil，JIANGJing—yu2，HA0Yah2，ZHOUJian—hual
(1．DepartmentofPediatrics，AffiliatedTongjiHospital，TongjiMedicalCo lege，HuazhongUniversityofScience
andTechnology，Wuhan430030，Chinal2．DepartmentofPharmacy，CentralHospitofWuhan，Wuhan430030，China)
Abstract：ObjectiveToobserveth ffectsofmyriocin(ISP一1)onimprovementofglomerular
messangialcel (GMC)apoptosisandngeneexpressionprofilesofcellcycler gulatoryproteinsinGMC．
MethodsRatGMCwasculturedwith100gmol／LISP一1for6，12，24，and48h，apoptosiswasevaluated
throughflowcytometry，Hoechst33258／PIfluorescencestainigandDNAfragmentationanalysiswa
carriedoutunderSepharoseelectrophoresistOobservethchangesofapoptosisandDNAfragmentation．
Geneexpressionprofilesofcellcycler gulatoryproteinsweredetectedbySuperArrayReal—TimePCR
microarrayanalysis．Theexpr ssionofBaxand13cl一2proteinswainvestigatedbyW sternblotting．
ResultsISP一1couldsignificantlyinduceGMCapoptosisinatime—dependentmanner，whichasthemost
significantafter48h．ApoptosisbodysofGMCwereobservedbyHoechst／PIfluorescencestaining，anda
typicalladderpatternwasidentifiedinDNAelectrophoresis．SuperArrayReal—TimePCRmicroarray
analysisrevealedthatISP一1couldup—regulatethexpressionofge esinvolvedinDNAdamage，apoptosis
andcellcycler gulation，suchasRad51，Atm，Brcal，caspases，cyclinA2，cyclinC，chekl，cyclinBl，
cyclinB2，cyclinD2，cyclinF，Cdc25a，andP27．WesternblottingshowedthatISP一1couldsignificantly
up—regulateB xproteinxpressionandown—regulateBc 一2proteinxpression，respectively．Conclusion
ISP一1couldinduceGMCapoptosisina time—dependentman er，propabablythroughinfluencinggene
expressionofcellcycler gulatoryproteinsa dapoptosisproteins．
Keywords：myriocin(ISP—1)；glomerularmessangialcel (GMC)；apoptosis；cellcycler gulatory
proteins
肾小球系膜细胞(GMC)是。肾小球中3种固有细胞成分之一，其增生及由此引起的细胞外基质
收稿日期：2008—01—04
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30472268)I湖北省科技攻关项目(2007AA301844)
作者简介：陈美(198l一)，女，山东省莱州市人，在读硕士研究生，研究方向为儿科肾脏疾病。
*通讯作者周建华E—mail：jhzhou@tjh．tjmu．edu．Cll
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1209·
(EMC)分泌增加是导致肾小球硬化的重要原因，
增生的系膜细胞可通过细胞凋亡机制来清除[1]。多
球壳菌素(ISP一1)，C。。Ha，NO。，相对分子质量
401．5，是从冬虫夏草中提取的一种小分子新型免疫
抑制剂，具极强的免疫抑制作用[2~‘]。以前的研究发
现ISP一1可显著抑制GMC增生、肥大，减少EMC
的分泌E引，推测ISP一1可能直接诱导GMC凋亡从
而发挥其抑制GMC增生作用，由于细胞的增生、凋
亡受细胞周期调节蛋白的调控，本研究在多角度证
实ISP一1诱导GMC凋亡的基础上，观察了ISP一1
对细胞周期调节蛋白基因表达谱和凋亡相关蛋白
Bax、Bcl一2表达的影响，阐明ISP一1诱导GMC凋亡
的作用机制，为临床治疗系膜增生性。肾炎提供实验
依据。
1材料
DMEM购自Gibeo公司；小牛血清购自
Hyclon公司；ISP一1由Calbioehem公司提供，为虫
草菌丝粉中提取物；Hoechst33258、PI购自Sigma
公司，琼脂糖为Spanish产品；流式细胞仪(美国
BD公司)，美国SuperArrayReal—TimePCR细胞
周期芯片，兔抗鼠Bax和Bcl一2多克隆抗体购自
SantaCruz，DAB试剂盒购自武汉博士德公司。
2方法
2．1细胞培养与分组：SD大鼠GMC为经SV一40
转染的永生性细胞株，购自武汉大学中国典型培养
物保藏中心，以含10％小牛血清的DMEM培养，
含青霉素100U／mL、链霉素100mg／mL，常规置
于37℃、5％CO。培养箱中培养，每周传代2～3
次。实验前无血清培养液培养24h，然后用含5％
小牛血清的培养基培养，加入ISP一1并使其终浓度
为100pmol／L(预实验确定的最佳剂量)，分别作
用6、12、24、48h后检测。每种实验方法均使用
ISP一1重复处理3次。
2．2 Hoechst33258／PI染色荧光显微镜观察细胞
凋亡：培养液中加入10／19／mLHoeehst33258，37
℃染色30min，吸除染料，直接加入10／19／mLPI，
4℃染色15min，摇床上PBS洗3次，每次3min，
荧光显微镜下拍片。
2．3 DNA凝胶电泳检测细胞凋亡：同上处理的待
检细胞制成悬液，3000r／min离心5min，去上清，
加入一20℃预冷的70％乙醇混匀，振荡打散细
胞，一20℃固定过夜。次日3000r／min离心5
min，去上清，棉棒沾干液体，加入400弘L裂解液，
100／zL蛋白酶K，混匀，60℃水浴30～40min，加
入75肛L高浓度NaCI溶液，4℃，15min，加入等
体积的氯仿，振荡器上充分混匀，10000r／rain离心
10min，立即取出，吸上清到另一管中，加2．5倍体
积一20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒，可见白色絮
状沉淀，10000r／rain离心5min，去上清，加700
弘L一20℃预冷的无水乙醇洗1遍，1000r／rain
离心10min，去上清，棉棒沾干液体，加50pL无菌
双蒸水，混匀沉淀，60℃水浴15min助溶，2％琼
脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
2．4流式细胞仪检测细胞凋亡：同上处理的待检细
胞制成细胞悬液，800---1000r／min离心5min，离
心2次去上清，用一20℃预冷的70％乙醇悬浮细
胞，固定过夜，次日8001000r／min离心5min
去固定液，PBS离心冲洗去上清，加入20弘L
RNAase37℃水浴30min，再加入40弘LPI染液
(PI100弘g／mL，Triton—X1％，NaCl0．9％)，4℃，
30min，流式细胞仪检测细胞凋亡。
2．5 uperArrayReal—TimePCR细胞周期基因芯
片：待检细胞作用24h后，倒出培养基，直接加入
Trizol溶解细胞，每15em2加入1mL吹打，待细胞
溶解后加入1．5mLEp管中，封口胶封口，邮寄上
海康成生物工程有限公司进行检测。
2．6 Westernblotting检测Bax和Bcl一2蛋白的表
达：细胞常规抽提蛋白，以12％SDS—PAGE凝胶电
泳，电转移，封闭液4℃过夜，兔抗鼠Bax和Bcl一2
多克隆抗体(1t 200)杂交，4℃过夜，辣根过氧化
物酶耦联的羊抗兔IgG二抗(1：1ooo)37℃孵
育1h，DAB显色。
2．7统计学方法：实验数据用z土s表示，组间数据
比较采用t检验，统计软件采用SPSS13．0。
3 结果
3．1 Hoechst33258／PI染色荧光显微镜观察结果：
对照组未见凋亡，细胞核呈现Hoeehst33258的蓝
色荧光(图l-A)。GMC经ISP一1作用后出现凋亡，
作用24、48h组出现明显的形态变化，表现为亮蓝
色凋亡小体出现，随着时间延长j凋亡小体也更为多
见(图1一B及图l-C)。而ISP一1作用6、12h组未见
明显凋亡小体的出现。PI不能通过完整细胞膜，仅
使坏死细胞呈现红色染色(图1一D)。
3．2 DNA凝胶电泳分析：ISP-1作用6、12h后，
未见凋亡梯度的出现，在作用24、48h后，可见明显
的“梯状”排列的DNA片段(图2)。
3．3 流式细胞仪检测细胞凋亡：ISP一1加入12h
后可见小的亚二倍体峰，24、48h后出现明显的亚
万方数据
·1210· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
图l ISP-1作用GMC不同时间后Hoechst33258／PI荧光染色结果
Fig．1ResultsoffluorescencestainingbyHoechst33258／PIonGMCtreatedwithISP-1fordifferenttimes
二倍体峰。定量分析显示，ISP一1作用12、24、48h
后细胞凋亡率显著高于对照组(P<0．05、0．01)，见
表1，表明ISP—l诱导GMC凋亡呈时间依赖性。
1一Marker2～5一ISP一16、12、24、48h组
6-ISP一1诱导坏死细胞组
1一Maker2～5-ISP一1treatedfor6，12，24，and48h
6-necroticcellsnducedbyISP一1
图2 ISP一1处理不同时间GMCDNA凝胶电泳图
Fig．2DNAElectrophoretogramofGMCtreated
withISP一1fordifferenttimes
表l ISP一1作用不同时间对GMC凋亡的影响Q士s，露一3)
Table1 EffectofISP-IonapoptosisfGMCtreated
fordifferenttimes(；±s。n=3)
与对照组比较：。P。P3．4 SuperArrayReal—TimePCR细胞周期基因芯
片分析：SuperArrayReal—TimePCR细胞周期基因
芯片结果显示，与对照组相比，与DNA损伤和凋亡
相关的基因Atm、Brcal、Rad51显著上调，分别为
10．14、8．09、8．49倍，Caspase3上调2．51倍；与细
胞周期相关的蛋白中，cyclinA2、cyclinC、chekl上
调幅度比较大，分别为4．10、3．38、5．41倍，而
cyclinBl、cyelinB2、cyclinD2、cyelinF、Cdc25a上调
幅度比较小，分别为2．24、2．36、2．06、2．92、2．12
倍；细胞周期蛋白激酶抑制剂的CIP／KIP家族中
P27上调2．96倍(图3)。另外，下调2倍以上的基因
有Npm2、Prmi，与对照组相比分别为2．15、2．08
倍(图4)，下调2倍以下的基因有Akl、Ccnal、
Cdk4，CdknlalCdkn2a，Cdkn2b，E2fl?LOC307231，
Mcm2predicted、Ran、Tafl0 predicted、Tp53、
Rplpl、Rpll3a、Ldha、Actin，与对照组相比分别为
1．12、1．62、1．27、1．21、1．62、1．80、1．13、1．62、
1．12、1．01、1．53、1．44、1．29、1．26、1．27、1．30倍。
轻12
逛
萎s
g
篓。
蚓
懈．
1-Arm2-Brcal3-caspase3 4-cyclinA25-cyclinC
6-chekl7-cyclinB1 8-cyclinB29-Rad51
10一cyclinF ll-Cdc25a12一P2713一cyclinD2
图3 ISP—l上调GMC基因表达相对倍数
Fig．3Relativemultiplesofgeneexpression
ofGMCup—regulatedbyISP一1
鼎2
16
也
蒌2．12
g
萋2．08
蚓
懈2．04
Npm2 PrmI
图4 ISP一1下调GMC基因表达相对倍数
Fig．4Relativemultiplesofgeneexpression
ofGMCdown—·regulatedbyISP_。1
3．5 WesternBlotting检测Bax和Bcl一2蛋白的
表达：GMC经ISP一1作用不同时间后，Bax蛋白表
达上调，48h组高于24h组(P显高于12h(P<0．01)，Bcl一2蛋白表达下降，48h
组明显低于24h组(P<0．01)，24h组低于12h
(P 万方数据
中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1211·
结果见图5，表2。
图5 ISP一1作用不同时间GMCBax及Bcl一2
蛋白表达
Fig．5ExpressionforBaxandBcl一2ofGMC
treatedwithISP一1fordifferenttimes
表2 ISP一1作用不同时间GMCBax及Bcl一2
表达变化(犀一3)
Table2 ChangesofBaxandBcl一2expressionofGMC
treatedwithISP一1fordifferenttimes(露=3)
与前一时同点比较I。P‘P<0．05’’P4讨论
本实验结果显示，体外培养的正常大鼠GMC
与ISP一1共孵育后，呈现细胞形态学改变，DNA凝
胶电泳出现典型的DNA“梯度”片段排列，流式细
胞分析检测到亚二倍体的凋亡峰，且凋亡细胞数的
增加与ISP一1呈时间依赖性，这些结果表明，ISP一1
可直接诱导GMC凋亡。为探讨其诱导GMC凋亡
的机制，在多角度证实ISP一1诱导GMC凋亡的基
础上，观察了ISP一1对细胞周期调节蛋白基因表达
谱和凋亡相关蛋白Bax、Bcl一2表达的影响，其中
SuperArrayReal—TimePCR细胞周期基因芯片为
新一代基因芯片，具有灵敏度高，特异性强，可有效
避免非特异性物质的产生，均一性好，扩增效率高及
重复性佳的特点，其结果发现ISP一1可显著上调
GMCRad51、Atm、Brcal、caspase3、cyclinA2、
cyclinC，chekl，eyelinBl，eyclinB2，cyclinD2，
cyclinF、CAc25a和P27等一些与DNA损伤、凋亡和
细胞周期调节蛋白相关的基因的表达，同时也可下
调Npm2、Prml、Akl、Ccnal、Cdk4、Cdknla、
CdknZa、Cdknlb、E2fl等基因的表达，Western
blotting结果也显示ISP一1可显著上调GMC促凋
亡蛋白Bax表达，下调GMC凋亡抑制蛋白Bcl一2
表达，最终效应是诱导凋亡产生。
细胞凋亡与细胞周期密切相关，细胞周期是在
细胞周期调节蛋白的严密调控下完成的，包括正调
控蛋白：细胞周期蛋白(eyclins)、细胞周期蛋白依
赖性蛋白激酶(CDK)和负调控蛋白：细胞周期蛋
白依赖性蛋白激酶抑制剂(CKI)。正性调节蛋白促
进细胞周期的运行，负性调节蛋白抑制细胞周期的
运行。细胞周期中存在至少两个检测点，G。／S与
G：／M，用药物来阻抑病理因素刺激下GMC的两个
检测点的转位可抑制细胞增生，细胞自G，晚期或其
后各期退出细胞周期可引起细胞凋亡。周期素与
CDK结合才能发挥作用，本实验中，cyclinA表达虽
然增加，但因缺乏CDK2，不能促进G，／S转变；表
达增高的P”结合并灭活G，期相应细胞周期素与
CDK的复合物，抑制cyclin／A／B／D／E依赖的激
酶，阻抑细胞G。／S、G：／M转变。在Thy一1肾炎大鼠
模型，霉酚酸酯和CDK2抑制剂roscovitine治疗可
以上调P27的蛋白表达水平，从而抑制GMC的增
生口1l另外，与细胞周期凋亡相关的基因caspase3
的表达升高，直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，
引起凋亡；Atm、chekl和ede25表达显著增加，引
起G：／M阻滞，而且Atm是G：／M阻滞的主要途
径，以上均可引起细胞凋亡。
DNA损伤引起的凋亡分为P53依赖途径和非
P53依赖途径，而且主要是通过P53途径引起凋
亡。当前研究认为，Atm能调节P53表达从而启动
细胞凋亡[4]。Arm磷酸化P53的Set“，后者对P53
发挥诱导凋亡有重要作用。在一些体内和体外实验
中发现，DNA损伤如DNA链断裂可直接激活
Atm。本实验中，GMC经ISP一1作用后，Atm表达
显著增加，进而产生细胞周期阻滞和GMC凋亡。
Arm还可以通过磷酸化的方式活化其下游基因
Brcal，Brcal再与下游基因Rad51相互作用，共同
完成损伤后修复，其为DNA损伤后的一种自我保
护机制。但Atm在细胞凋亡中的作用更大一些[8]。
Atm还可激活Chekl，Chekl引起Cde25的Ser215
磷酸化，通过抑制Cde25的活性，抑制M—CDK的
活性，使细胞周期中断，进而引起细胞凋亡。、
细胞 受一系列分子调控，包括一系列原癌
基因和抑癌基因的产物，其中Bel一2家族起着决定
性作用[9]，Bax是主要凋亡促进蛋白，Bcl一2是主要
凋亡抑制蛋白，两者之间的比例决定了细胞是生存
还是死亡[1⋯。Lin等[11]表明，细胞的凋亡可以由Bax
的上调和Bel一2的降低诱导，本实验结果正符合这
一点。
万方数据
·1212· 中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
GMC凋亡可以阻断GMC的异常增生，控制疾
病进展。急性肾小球肾炎通常以白细胞浸润和
GMC增生为特征，通过凋亡可清除炎性细胞和多
余数量的GMC[1引，Thyl系膜增生性肾小球肾炎中
GMC凋亡同样是防止GMC过度增生的主要机
制[1引。越来越多的资料显示，凋亡是肾小球增生性疾
病的消除方式之一[1‘。。所以ISP一1诱导GMC凋亡
可能是其治疗系膜增生性肾小球肾炎的作用机制。
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甜菜碱对HepG2人肝癌细胞基因组范围DNA甲基化表达的影响
季宇彬，高世勇，杨红丹，何立巍
(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，
国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150076)
摘要：目的研究甜菜碱对人肝癌细胞HepG2内基因组范围DNA甲基化的影响。方法以浓度0．1、0．2、0．4
mol／L甜菜碱作用于人肝癌细胞HepG224、48h后，通过高效毛细管电泳仪(HPCE)检测肿瘤细胞中DNA水解
产物中5一甲基一2，_脱氧胞嘧啶(5一methyl一2’deoxycytidine，5mdC)水平，来检测甜菜碱对HepG2内基因组范围
DNA甲基化表达的影响。结果随着甜菜碱的浓度增大，5mdC占总体胞嘧啶的峰面积的百分比也相应增大，且
有剂量依赖性。结论 甜菜碱作为甲基供体，促进HepG2细胞基因组范围DNA甲基化的表达，从而调控细胞周期
抑制肿瘤的生长。
关键词：甜菜碱；DNA甲基化I高效毛细管电泳仪
中图分类号：R979．1R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)08—1212—04
Effectofbetaineo expressionofDNAmethylationinHepG2genome
JIYu—bin，GAOShi—yong，YANGHong—dan，HELi—wei
(PostdoctoralRese rchStation，InstituteofMa eriaMedica．LifeSCinecesandEnvironmentsl
SciencesR earchCenter，HarbinCommerceUniversity，ResearchCenterofNatureDrugEngineering
forAnti—tumor，MinistryofEducation，Harbin150076，China)
收稿日期：2008—02—20
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30400352)-教育部科学技术研究重点项目(205045)，黑龙江省自然科学基金资助项目
(D2006ii)I黑龙江省研究生创新基金项目(YJSCX2006—0077HSD)
作者简介：季宇彬(1956一)，男．博士，教授．博士生导师，多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理及分子药理学研究。
万方数据
多球壳菌素诱导系膜细胞凋亡及对细胞周期调节蛋白基因表
达谱的影响
作者： 陈美， 江警予， 郝燕， 周建华
作者单位： 陈美,郝燕,周建华(华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,湖北,武汉,430030)， 江警
予(武汉市中心医院药剂科,湖北武汉,430030)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(8)
被引用次数： 4次

参考文献(14条)
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本文读者也读过(10条)
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引证文献(4条)
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2.江警予.黄晓东.王奕.邓艾平.周建华 转化生长因子β1-结缔组织生长因子途径在FTY720干预大鼠抗Thy-1系膜增
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3.肖朝华.周建华.吴衡生 多球壳菌素对高糖诱导肾小球系膜细胞cyclinD1表达的影响[期刊论文]-中国当代儿科杂
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4.何亚红.何晓青.杨渊.马牧之.楼凯敏 蝉花对治疗糖尿病肾病的研究进展[期刊论文]-黑龙江医药 2012(6)


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