全 文 ：能是两地的生境相似 ,均为平原湖区 ,气候单一 ,自
然选择导致适应相同自然环境的基因型保存下来 ,
从而使两地样品具有很高的遗传相似性。另外有少
数樟树的样品 ( Z24～Z27) 和丰城的样品聚在一个
大支上 ,说明物种内部不同居群的遗传分化并不很
大 ,不可能像具有很长生殖隔离历史的物种之间那
样毫不含糊地区分每一个个体 ,这也是分子标记分
析常用居群的基因频率而非个体作为分析单元的原
因。这类问题可通过增加位点数目得到解决。
可见 ,基于栀子的 ISSR 遗传多态性的聚类分
析结果与栀子产区的地理分布比较吻合 ,这为从分
子生物学角度研究栀子的道地性提供了新的启示。
可以说药材的道地性不仅仅是一个地理上的概念 ,
同时也具有丰富的遗传特质。而作为现代分子生物
学的重要手段 , ISSR 分子标记技术对揭示道地药材
与非道地药材之间的地理2生态2遗传的差异是一种
有效的手段。
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粗茎秦艽药材 HPLC指纹图谱研究
王妍妍1 ,赵志礼1 3 ,吴靳荣1 ,王峥涛2①
(11 上海中医药大学 生药学教研室 ,上海 　201203 ; 21 上海中医药大学中药研究所 ,上海 　201203)
摘 　要 :目的 　建立粗茎秦艽药材的 HPLC 指纹图谱 ,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法 　以龙
胆苦苷为内参照物 ,分析 13 批粗茎秦艽药材的 HPLC 色谱行为 ,并进行相似度计算 ,色谱条件 :Ultimate XB2C18柱
(250 mm ×416 mm , 5μm) ,乙腈20105 %磷酸水梯度洗脱 ,体积流量 110 mL/ min ,柱温 25 ℃,检测波长 240 nm。
结果 　标定了 10 个共有峰 ,建立了 HPLC 指纹图谱 ,该图谱相关系数均在 0198～110。结论 　该方法准确可靠 ,重
现性好 ,可为控制粗茎秦艽药材内在质量提供科学依据。
关键词 :粗茎秦艽 ;指纹图谱 ;高效液相色谱法
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120120204
·021· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008206229
基金项目 :上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金资助项目 (2006A214)
作者简介 :王妍妍 (1983 —) ,女 ,硕士 ,研究方向为中药质量评价。　E2mail :wyyan830406 @126. com3 通讯作者　赵志礼　Tel : (021) 51322202 　E2mail :zhilzhao @sohu. com
HPLC Fingerprint of Ra dix Gentia nae Crassicaulis
WAN G Yan2yan1 , ZHAO Zhi2li1 , WU Jin2rong1 , WAN G Zheng2tao2
(11Department of Pharmacognosy , Shanghai University of Traditional Chinese Medicine , Shanghai 201203 , China ; 21 Institute
of Chinese Materia Medica , Shanghai University of Traditional Chinese Medicine , Shanghai 201203 , China)
Abstract : Objective 　To establish HPL C fingerp rint of R adi x Genti anae Crassicaul is1 Methods 　The
fingerp rint s were obtained on an Ultimate XB2C18 column (250 mm ×416 mm , 5μm) wit h t he gradient elu2
tion solvent system composed of acetonit rile and 0105 % p hosp horic acid1 The flow rate was 110 mL/ min ,
t he column temperat ure was maintained at 25 ℃, and the detection wavelengt h was set at 240 nm1 Results
　Ten common peaks were selected as t he fingerp rint peaks and t he fingerp rint s also were evaluated by t he
Similarity Evaluation System for Chromatograp hic Fingerp rint with t he correlation coefficient of 0198 —
1101 Conclusion 　This met hod wit h good precision and rep roducibility is reliable for the quality cont rol of
R adi x Genti anae Crassicaul is1
Key words : R adi x Genti anae Crassicaul is ; fingerp rint ; H PL C
　　秦艽临床可用于风湿痹痛、骨节酸痛及小儿疳
积发热等病症的治疗。其原植物来源较为复杂 ,除
了 2005 年版《中国药典》[1 ] 收载的秦艽 Genti ana
m acrop hy l l a Pall1 、麻花秦艽 G1 st rami nea Max2
im1 、粗茎秦艽 G1 crassicaulis Dut hie ex Burk1 及
小秦艽 G1 d ahurica Fisch1 4 种外 ,经实地调查 ,龙
胆科龙胆属秦艽组多种植物的根在不同地区均作秦
艽使用[2 ,3 ] 。同时 ,由于市场需求量大以及过度采
挖 ,秦艽野生资源状况令人担忧。为缓解产销矛盾 ,
各地开展了秦艽药材种植研究 ,并形成一定规模。
目前建立科学的质量评价体系是当务之急。中药指
纹图谱是中药品种鉴定、质量评价与控制等方面的
有效方法之一 ,从麻花秦艽 G1 st rami nea Maxim1
药材 H PL C 指纹图谱来看 ,可作为生产过程中药材
投料的重要依据[ 4 ]或作为麻花秦艽道地药材品质评
价的方法之一[5 ] 。目前 ,尚未见到有关粗茎秦艽
H PL C 指纹图谱的研究报道。本研究在秦艽品种
鉴定与资源考察的基础上 ,在同一时期内收集了 10
批云南产粗茎秦艽药材栽培品以及 3 批野生粗茎秦
艽药材样品 ,拟建立其 H PL C 指纹图谱 ,为秦艽多
来源品种的鉴定 ,粗茎秦艽栽培品的质量评价以及
秦艽类药材共有标准图谱的建立提供基础资料。
1 　实验材料
111 　仪器 : Waters 600 泵 , Waters In2Line Degas2
ser A F 在线脱气机 , Waters 717 plus Autosampler
自动进样器 , Waters 996 Photodiode Array Detec2
tor 检测器 ,Empower Pro 工作站。
112 　试剂 :乙腈为色谱纯 (L EDA) ,水为娃哈哈纯
净水 ;其他试剂均为分析纯 (国药集团化学试剂有限
公司) 。
113 　试药 :龙胆苦苷对照品 (上海中药标准化研究
中心提供 ,经 H PL C 分析 ,质量分数大于 98 %) ;獐
牙菜苦苷对照品 (中国药品生物制品检定所提供 ,批
号 07852200203) 。
114 　实验样品与凭证标本 :不同产地粗茎秦艽原植
物花期标本与实验样品均为自采 ,并经上海中医药
大学赵志礼教授鉴定为粗茎秦艽 Genti ana crassi2
caul is Dut hie ex Burk1 ;凭证标本存放于上海中医
药大学中药学院药用植物标本室。见表 1。
表 1 　样品来源及凭证标本
Table 1 　Sample sources and vouchers
批号 来　　源 采集日期 凭证标本 备注
1 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸北村 2007208207 赵志礼 2007501 栽培
2 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸头村 2007208207 赵志礼 20075012 栽培
3 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸北村 2007208208 赵志礼 20075013 栽培
4 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸北村 2007208208 赵志礼 20075014 栽培
5 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸北村 2007208208 赵志礼 20075015 栽培
6 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸东村 2007208208 赵志礼 20075016 栽培
7 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸南村 2007208208 赵志礼 20075017 栽培
8 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸西村 2007208208 赵志礼 20075018 栽培
9 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡四兴村 2007208208 赵志礼 20075019 栽培
10 云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡甸西村 2007208208 赵志礼 20075020 栽培
11 四川省甘孜州道孚县麻孜乡 2007208214 王妍妍 20070814 野生
12 四川省甘孜州康定县榆林乡 2007208214 赵志礼 2007601 野生
13 云南省丽江玉龙雪山东侧黑山坡 2007208210 赵志礼 2007505 野生
2 　方法与结果
本实验参考《中药注射剂指纹图谱研究的技术要
求 (暂行)》中的药材指纹图谱的相关规定而建立[6 ] 。
211 　色谱条件 : Ultimate XB2C18 柱 (250 mm ×416
mm , 5μm) ;流动相 :乙腈 (A)20105 %磷酸水 (B) ,A
为 0～10 min (5 %～13 %) ,10～25 min (13 %) ,25～
·121·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
45 min (13 %～45 %) ;体积流量 :1 mL/ min ;检测波
长 :240 nm ;柱温 :25 ℃;进样量 :10μL 。
212 　对照品溶液的制备 :取龙胆苦苷对照品适量 ,
精密称定 ,加甲醇溶解 ,制成 0122 mg/ mL 的对照品
溶液。取獐牙菜苦苷对照品 ,精密称定 ,加甲醇溶
解 ,制成 0189 mg/ mL 的对照品溶液。
213 　供试品溶液的制备 :取粗茎秦艽药材粉末 (过
三号筛)约 110 g ,精密称定 ,置于 50 mL 具塞锥形
瓶中 ,精密加入甲醇 20 mL ,称定质量 ,超声处理 (功
率 250 W ,频率 100 k Hz) 30 min ,取出 ,冷却至室
温 ,再称定 ,用甲醇补足质量 ,摇匀 ,静置 ,取上清液 ,
用微孔滤膜 (0145μm)滤过 ,取续滤液 ,即得。
214 　测定方法 :分别精密吸取对照品溶液和供试品
溶液各 10μL ,注入高效液相色谱仪 ,记录 45 min
色谱图 (图 1、2) ,即得。在测定的色谱图中 ,7 号峰
为獐牙菜苦苷峰 ,8 号峰为龙胆苦苷峰。同时 ,分析
13 批粗茎秦艽药材的 H PL C 色谱行为 ,确定指纹区
与共有峰。供试品色谱中 ,以参照物龙胆苦苷对应
的色谱峰 (8 号峰)的相对保留时间为 1 ,计算各共有
指纹峰的相对保留时间。
215 　方法学考察
21511 　精密度试验 :取同一供试品 (2007501)溶液 ,
连续进样 5 次 ,测得各共有峰相对保留时间 ,结果
RSD 均小于 115 % ;测得主要峰相对峰面积的 RSD
均小于 3 %。
21512 　重现性试验 :取同一个样品 (2007501) 5 份 ,
分别按供试品溶液的制备方法制备供试品并测定 ,
测得各共有峰相对保留时间 ,结果 RSD 均小于
1 % ;测得主要峰相对峰面积的 RSD 均小于 3 %。
21513 　稳定性试验 :取同一供试品 (2007501)溶液 ,
分别在 0、2、4、8、12、24 h 检测 ,测得各共有峰相对
保留时间 ,结果 RSD 均小于 1 % ;测得主要峰相对
峰面积的 RSD 均小于 3 %。
216 　指纹图谱及技术参数
21611 　指纹图谱 :按 214 项测定 13 批粗茎秦艽药
材 ,根据检测结果 ,建立粗茎秦艽药材的高效液相色
谱指纹图谱 (图 3) 。指纹图谱中共有指纹峰的相对
保留时间的计算结果见表 2。
图 3 　13 批不同产地粗茎秦艽药材的指纹图谱
Fig. 3 　HPLC Fingerprint of 13 batches of Radix
Gentianae Crassicaulis from various habitats
表 2 　粗茎秦艽药材指纹图谱共有指纹峰的相对保留时间
Table 2 　Relative retention time of common peaks for
f ingerprint of Radix Gentianae Crassicaulis
批号 各峰相对保留时间1 2 3 4 5 6 7 S 9 10
1 01440 8 01651 5 01687 6 01711 4 01730 5 01816 6 01833 8 1 11050 5 11669 1
2 0. 438 0 0. 650 5 0. 686 9 0. 711 1 0. 730 5 0. 816 9 0. 833 3 1 1. 050 2 1. 670 8
3 0. 437 8 0. 650 5 0. 687 5 0. 711 2 0. 730 5 0. 816 4 0. 833 0 1 1. 050 0 1. 671 3
4 0. 439 8 0. 644 1 0. 688 0 0. 711 7 0. 731 0 0. 817 2 0. 834 1 1 1. 050 0 1. 673 5
5 0. 440 4 0. 651 9 0. 688 0 0. 712 4 0. 731 7 0. 817 9 0. 834 1 1 1. 049 8 1. 673 5
6 0. 439 6 0. 651 5 0. 687 8 0. 712 1 0. 731 3 0. 817 0 0. 834 2 1 1. 050 0 1. 674 6
7 0. 438 7 0. 650 7 0. 687 0 0. 710 7 0. 730 2 0. 816 6 0. 833 6 1 1. 050 9 1. 671 3
8 0. 440 2 0. 651 8 0. 687 3 0. 711 9 0. 730 8 0. 816 7 0. 833 4 1 1. 049 2 1. 670 4
9 0. 439 1 0. 650 3 0. 686 3 0. 711 0 0. 729 1 0. 815 6 0. 832 2 1 1. 051 0 1. 667 4
10 0. 437 3 0. 649 2 0. 685 8 0. 710 4 0. 730 8 0. 815 1 0. 831 2 1 1. 048 8 1. 664 2
11 0. 437 4 0. 648 3 0. 684 9 0. 708 7 0. 727 3 0. 814 1 0. 830 2 1 1. 050 6 1. 661 4
12 0. 437 2 0. 648 8 0. 685 5 0. 708 8 0. 727 5 0. 815 0 0. 831 1 1 1. 050 2 1. 661 7
13 0. 438 0 0. 643 1 0. 684 6 0. 709 5 0. 727 8 0. 814 4 0. 830 3 1 1. 048 7 1. 659 9
RSD/ % 0. 289 1 0. 435 3 0. 171 9 0. 164 9 0. 203 4 0. 133 6 0. 177 2 0 0. 070 4 0. 304 9
21612 　共有指纹峰的最终确定 :采用相对保留时间
标定共有指纹峰。在比较分析各色谱图的基础上 ,
用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度
评价系统 2004A 版 110 版 , 根据 13 个供试品
HPL C 谱给出的相关技术参数 ,标定中药材的共有
指纹峰。进行色谱峰的自动匹配 ,观察样本图谱的
匹配结果 ,其中 10 个峰是 13 批供试品所共有的 ,因
·221· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
此最终确定这 10 个峰为共有指纹峰。
217 　粗茎秦艽药材 HPL C 指纹图谱的相似度评
价 :用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相
似度评价系统 2004A 版 110 版 ,通过中位数对 13
个样品的数据处理 ,得到各自的相关系数 (表 3) 。
结果显示 13 批样品图谱与标准对照指纹图谱的相
关系数均在 01 98～110 ,建立的粗茎秦艽药材的
H PL C 指纹图谱的相似度极高。
表 3 　样品相似度评价
Table 3 　Similarity of 13 batches of samples
批号 相关系数 批号 相关系数
1 01998 8 01999
2 1 9 01999
3 1 10 1
4 1 11 01980
5 1 12 01999
6 01997 13 01992
7 1 对照指纹图谱 1
3 　讨论
311 　检测波长的选择 :采用 PDA 对指纹图谱的检
测波长进行了选择 ,从 190～400 nm 进行紫外扫
描 ,结果表明检测波长为 240 nm ,色谱图所包含的
信息量大 ,各色谱峰分离较好。
312 　流动相的选择 :选用了甲醇2水、乙腈2水、乙腈2
0105 %磷酸水、乙腈20105 %甲酸水、乙腈20105 %乙
酸水、甲醇20105 %磷酸水、甲醇20105 %甲酸水、甲
醇20105 %乙酸水、乙腈2011 %磷酸水、乙腈2011 %甲
酸水、乙腈2011 %乙酸水等体系进行梯度洗脱 ,结果
以乙腈20105 %磷酸水体系梯度洗脱得到的色谱峰
形较好 ,且较稳定。
313 　参照峰的选择 :粗茎秦艽药材有效成分中龙胆
苦苷的量高且相对稳定 ,因此选其作为参照物。
314 　供试品提取方法选择 :分别考察了乙醇、甲醇、
甲醇2水 (8 ∶2) 、甲醇2水 (5 ∶5) 、醋酸乙酯、丙酮等
不同提取溶剂 ,超声、回流等不同提取方式 ,以及提
取时间和提取次数 ,结果表明 ,以甲醇超声 30 min
一次即可提取完全 ,因此确定该提取方法。
315 　13 个不同产地的粗茎秦艽指纹图谱中 ,主要
峰群的整体图貌基本一致 ,特征峰的相对保留时间
RSD 小于 1 % ,但特征指纹峰的相对峰面积积分比
值有较大差别。由此建立的指纹图谱基本反映了粗
茎秦艽药材的内在化学特征。
316 　从指纹图谱中可以看出 ,云南产粗茎秦艽药材
栽培品的化学成分背景与野生药材十分相近 ,栽培
品的品质良好。
317 　本试验方法操作简单 ,干扰小 ,用于控制粗茎
秦艽的质量是切实可行的。
致谢 :野外考察与样品采集工作得到中国科学
院昆明植物研究所杨立新女士、扬州大学淮虎银教
授及上海中医药大学倪梁红老师的大力协助 !
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(11 解放军南京军区总医院 ,江苏 南京 　210002 ; 21 解放军第四五四医院 ,江苏 南京 　210002)
摘 　要 :目的 　建立回心草药材的指纹图谱。方法 　采用反相高效液相色谱 ,色谱条件为 :Dikma Platisil ODS C18
柱 (250 mm ×416 mm , 5μm) ;流动相 A :015 %醋酸乙腈 ,B :015 %醋酸水溶液 ;洗脱方法 :0～50 min ,A 为 20 %～
55 % ;50～60 min ,A 为 55 %～95 % ,60～85 min ,A 为 95 %～100 % ,保持 5 min ;体积流量 110 mL/ min ,波长 360
nm ,柱温 :30 ℃。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004 版 (国家药典委员会) 进行分析。结果 　构建了回
心草药材的指纹图谱。结论 　该法准确 ,重现性好 ,可作为回心草药材的质控方法。
关键词 :回心草药材 ;高效液相色谱法 ;指纹图谱
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120123205
·321·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008204225
作者简介 :蔡　鹰 (1967 —) ,女 ,江苏宜兴人 ,博士后在读 ,研究方向为中药学。
Tel : (025) 80863169 　13813914158 　E2mail :caiying1967 @126. com3 通讯作者　魏群利　Tel : (025) 80865139 　E2mail :weiqunli @126. com