全 文 ：复尔康注射液对肝癌 HepG2 细胞凋亡和 VEGF 表达的影响
刘明华1 ,任美萍1 ,肖顺汉1 ,冯文宇2 ,李 　蓉1 ,李 　茂1 3
(11 泸州医学院 药理学教研室 ,四川 泸州 　646000 ; 21 泸州医学院药物研究所 ,四川 泸州 　646000)
摘 　要 :目的 　研究复尔康注射液对肝癌 Hep G2 细胞凋亡和 V EGF 表达的影响。方法 　复尔康注射液干预
Hep G2 细胞 48 h 后 ,CCK8 试剂盒检测细胞的增殖活性 , Hoechst 33258 荧光染色观察细胞凋亡的形态学改变 ,流
式细胞仪 Annexin V/ PI 双染法检测细胞的凋亡率 ,免疫组化 SABC 法检测细胞 V EGF 的表达。结果 　复尔康注
射液可抑制 Hep G2 细胞的增殖 , IC50值为 (29163 ±1122) mg/ L 。复尔康注射液 5、10 mg/ L 干预 Hep G2 细胞 48
h 后 , Hoechst 33258 荧光染色可见核浓缩、核碎裂等凋亡形态学改变 ,Annexin V/ PI 双染法检测显示细胞凋亡率
明显升高 ,免疫组化 SABC 法检测显示 V EGF 的表达明显减弱 ,且呈现出一定的量效关系。结论 　复尔康注射液
可诱导 Hep G2 细胞凋亡 ,减弱 V EGF 的表达。
关键词 :复尔康注射液 ; CCK8 ; Hep G2 ; V EGF ; 凋亡
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821288203
　　复尔康注射液是从青蒿中提取的有效部位青蒿
油 ,研制而成的能供静脉给药的多相脂质体注射液。
脂质体作为抗肿瘤药物的载体 ,因其具有制作简单、
对机体无毒、能显著降低药物不良反应 ,以及容易实
现肿瘤靶向等优点而备受关注[1 ] 。本研究观察了复
尔康注射液对肝癌 Hep G2 细胞凋亡和 V EGF 表达
的影响 ,为复尔康注射液应用于临床恶性肿瘤的治
疗提供实验依据。
1 　材料
111 　药品与试剂 :复尔康注射液由泸州医学院药物
研究所提供 ,批号 061017 ; RPMI 1640 培养基 ,
GIBCO 公司产品 ;胎牛血清 ,天津灏洋生物制品科
技责任有限公司产品 ;CC K8 (cell counting kit28) ,
碧云天生物技术研究所产品 ; Hoechst 33258 ,南京
凯基生物科技发展公司产品 ; Annexin V2FITC 试
剂盒 ,Beckman Coulter ;SABC 试剂盒和 DAB 显色
剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。
112 　细胞株 :肝癌 Hep G2 细胞株由四川大学华西
医学中心惠赠 ,本实验室长期传代保存 ,采用含
10 % 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 , 37 ℃、5 %
CO2条件下常规培养。
2 　方法
211 　CC K8 检测细胞增殖抑制率 :取对数生长期的
Hep G2 细胞 ,0125 % 胰酶制成细胞悬液 ,细胞浓度
为 1 ×108 / L ,接种于 96 孔板 ,每孔 90μL ,设空白
对照孔加 90μL RPMI 1640 ;37 ℃、5 % CO2培养箱
培养 24 h 后每孔加复尔康注射液 10μL ,终质量浓
度分别为 215、5、10、20、40、80 mg/ L ,每个浓度 4
个复孔 ,阴性对照组加等体积无血清 RPMI 1640 ;
继续培养 48 h ,每孔加入 CC K8 10μL 继续培养 1
h ,酶标仪 450 nm 波长下检测各孔吸光度 ( A ) 值 ,
按下列公式计算抑制率[2 ] ,LO GIT 法计算半数抑制
浓度 ( IC50 ) 。
细胞增殖抑制率 = [ 1 - ( A给药 / A空白对照 ) / ( A阴性对照 -
A空白对照 ] ×100 %
212 　Hoechst 33258 荧光染色观察细胞凋亡形态 :
参照文献方法[3 ] ,取对数生长期的 Hep G2 细胞制
成细胞悬液 ,浓度为 5 ×107 / L ,接种于预先铺好盖
玻片的 24 孔板 ,每孔 450μL ,37 ℃、5 % CO2 培养
箱培养 24 h ,加入终浓度分别为 5、10 mg/ L 的复尔
康注射液 ,溶媒对照组加溶媒终质量浓度为 10
mg/ L ,阴性对照组加等体积无血清 RPMI 1640 ;继
续培养 48 h ,吸尽孔内培养液 ,4 % 多聚甲醛固定
10 min , Hochest 33258 避光染色 10 min ,爬片 ,水
冲净 ,晾干 ,以紫外光 340 nm 波长激发 ,荧光显微
镜下拍照观察细胞凋亡形态学改变。
213 　流式细胞仪 Annexin V2FITC/ PI 双染法检测
细胞凋亡率 :取对数生长期的 Hep G2 细胞 ,活细胞
计数大于 95 % ,接种于 6 孔板 ,每孔 5 ×105个细胞 ,
37 ℃、5 % CO2培养箱培养 24 h ,加入终质量浓度分
别为 5、10 mg/ L 的复尔康注射液 ,溶媒对照组加溶
媒终浓度为 10 mg/ L ,阴性对照组加等体积无血清
·8821· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210204　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :四川省教育厅青年基金项目 (2006B025)
作者简介 :刘明华 (1972 —) ,男 ,硕士 ,副教授 ,研究方向为抗肿瘤药物筛选及分子靶点研究。
RPMI 1640 ;37 ℃、5 % CO2 培养箱中继续培养 24
h ,01125 % 胰酶消化细胞收集于离心管 , PBS 洗涤
一次 ,离心 ,弃上清液 ,将细胞悬浮于 100μL PBS
中 ,每管加 Annexin V2FITC 5μL , PI 2. 5μL ,轻轻
震荡混匀 ,置冰上避光染色 10 min ,每管加 400μL
1 ×Buffer ,流式细胞仪检测细胞凋亡率。
214 　免疫组化 SABC 法检测 V EGF 的表达 :调整
Hep G2 细胞悬液密度为 5 ×107 / L 。接种于预先铺
好盖玻片的 24 孔板 ,每孔 450μL ,37 ℃、5 % CO2
培养箱培养 24 h。每孔加药 50μL ,使其终质量浓
度分别为 5、10 mg/ L ,溶媒对照加溶媒终质量浓度
为 10 mg/ L ,阴性对照组加等体积无血清 RPMI
1640 ;37 ℃、5 % CO2培养箱继续培养 48 h。吸净培
养液 ,PBS 液洗 2 次 ,勿使细胞脱落。按免疫组化
SABC 染色试剂盒说明书步骤染色、封片、显微镜观
察。胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒为 V EGF 阳性染
色 ,每组随机采取 8 个视野拍照 ,结果用 Image2
Pro plus 6. 0 图像分析软件进行分析 ,检测其阳性
物质的吸光度平均值 ( A) 。
215 　统计学处理 :数据用 x ±s 表示 ,用 SPSS 1310 统
计软件进行单因素方差分析 (组间比较用 SN K法) 。
3 　结果
311 　CC K8 检测细胞增殖活性 :当复尔康注射液终
浓度大于 5 mg/ L 时 , Hep G2 细胞的增殖即受到抑
制 ,且呈明显的剂量依赖性 ,其 IC50 值为 (291 63 ±
1122) mg/ L 。见图 1。
图 1 　复尔康注射液对 HepG2 细胞增殖的浓度
抑制率曲线 ( n = 3)
Fig. 1 　Concentration2inhibition rate curve of Fuerkang
Injection on proliferation of HepG2 cells ( n = 3)
312 　Hoechst 33258 荧光染色观察细胞凋亡形态 :
复尔康注射液处理组均可见核浓缩致密的强荧光团
块、核碎裂以及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征 ,且
随药物浓度的增加 ,凋亡形态学改变愈明显 ,而阴性
对照组与溶媒组细胞大小均一 ,成弥散均匀的淡蓝
色弱荧光。见图 2。
313 　流式细胞仪 Annexin V2FITC/ PI 双染法检测
细胞凋亡率 :复尔康注射液 5、10 mg/ L 均可诱导
Hep G2 细胞的凋亡 , 凋亡率分别为 ( 32130 ±
1187) %、(42109 ±1143) % ,呈现出一定的剂量依赖
关系 ,与阴性对照组比较差异有显著性 ( P < 0101) 。
见图 3。
·9821·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
314 　免疫组化 SABC 法检测 V EGF 的表达 :阴性
对照组与溶媒对照组 Hep G2 细胞均明显表达
V EGF ,V EGF 分布于胞质及胞膜 ,呈棕黄色颗粒
状 ,细胞阳性率为 99 %。复尔康注射液作用 48 h
后 Hep G2 细胞 V EGF 的表达不同程度减弱。采用
Image2Pro plus 6. 0 图像分析软件进行分析 ,复尔
康注射液组的阳性物质吸光度平均值明显降低 ,与
阴性对照组比较差异有统计学意义 ( P < 0101) ,结
果见表 1。
表 1 　复尔康注射液对 HepG2 细胞 VEGF 表达的影响
( x ±s , n = 8)
Table 1 　Effect of Fuerkang Injection on VEGF
expression in HepG2 cells ( x ±s , n = 8)
组　别 剂量/ (mg ·L21) A
阴性对照 - 1 103161 ±861 44
溶媒 - 1 062161 ±811 57
复尔康注射液 5 255128 ±131 70 3 3
10 207134 ±181 93 3 3
　　与阴性对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 01 01 vs negative cont rol group
4 　讨论
　　细胞凋亡又称程序性细胞死亡 ,是由体内外某
些因素触发的细胞内预存的死亡程序而导致的具有
特殊形态学和生化改变的一种细胞主动性死亡
方式[4 ] 。
细胞凋亡是生命的基本特征之一 ,与细胞增殖
共同维持机体正常生长发育和内环境稳定。细胞凋
亡受阻与肿瘤的发生、发展有着密切的关系 ,故以选
择性诱导肿瘤细胞凋亡为目标的技术已成为肿瘤治
疗的重要策略之一。
肿瘤发生、发展、浸润及转移的各个阶段 ,均有
赖于肿瘤的血管生成 ,新生血管提供肿瘤生长所需
的营养 ,排除代谢产物 ,同时也是癌细胞播散的途
径 ,又能促进血管渗漏。血管生成构成了肿瘤进程
中的重要调节点[5 ] 。肿瘤细胞 (含间质细胞) 分泌
多种血管生成因子参与调节血管生成 , 其中以
V EGF 的作用最为突出[6 ] 。V EGF 与其受体结合
后 ,可释放各种生长因子及细胞因子 ,并以多种方式
促进肿瘤血管生成 ,从而为肿瘤的浸润、转移创造条
件[7 ] 。因此 ,可通过抑制肿瘤细胞中 V EGF 的分泌
来抑制肿瘤的生长及转移是治疗肿瘤的一条新
途径。
本实验结果表明复尔康注射液对体外培养的
Hep G2 细胞的增殖具有抑制作用 ,且呈现出良好的
量效关系 ,其 IC50值为 (29163 ±1122) mg/ L 。不同
浓度的复尔康注射液处理 Hep G2 细胞后 , Hoechst
33258 荧光染色均可见核浓缩致密的强荧光团块以
及核碎裂、凋亡小体等典型的细胞凋亡特征 ,且随药
物浓度的增加 ,凋亡形态学改变愈明显。流式细胞
仪检测显示 ,复尔康注射液可诱导 Hep G2 细胞的
凋亡 ,且凋亡率随药物浓度的增加而增加 ,在 10
mg/ L 时细胞凋亡率达 (42109 ±1143) %。免疫组
化 SABC 法检测显示复尔康注液能使 Hep G2 细胞
V EGF 的表达不同程度减弱 ,与阴性对照组比较差
异有统计学意义 ,具有一定的抗血管生成作用。
复尔康注射液能明显抑制 Hep G2 细胞的增
殖 ,诱导其凋亡 ,减弱 V EGF 的表达 ,结合前期的抗
肿瘤活性研究 ,揭示复尔康注射液诱导肿瘤细胞凋
亡和抗血管生成可能是其抗肿瘤作用的机制 ,在恶
性肿瘤的药物治疗中具有广阔的应用前景。
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