全 文 ：·734· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
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萌动激活灵芝孢子促进大鼠受损伤的脊髓运动神经元轴突再生的作用
张 伟1，曾园山r，陈小君2，陈穗君1，钟志强1
(1．中山大学中山医学院组织胚胎学教研室神经科学研究室，广东广州 510080；
2．中山大学肿瘤防治中心肿瘤研究所，广东广州 510089)
摘 要：目的探讨萌动激活灵芝孢子对大鼠坐骨神经切断再吻合后受损伤运动神经元轴突再生的影响。方法
对单侧坐骨神经切断再吻合后的大鼠ig给予萌动激活灵芝孢子，通过电生理、荧光金(FG)逆行标记和组织学等
方法观察受损伤运动神经元轴突再生情况。结果 坐骨神经切断再吻合6周后，灵芝孢子组坐骨神经再生轴突的
动作电位潜伏期及峰峰值的恢复率以及运动神经元胞体的荧光金逆行标记率均明显高于对照组，灵芝孢子组大鼠
腓肠肌萎缩程度也轻于对照组。结论萌动激活灵芝孢子能够促进大鼠坐骨神经切断再吻合后的脊髓受损伤运动
神经元轴突再生。
’
关键词：萌动激活灵芝孢子；运动神经元；轴突再生；坐骨神经切断再吻合
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0734—04
Effectofgermination-activatedG nodermasporesonaxonalregeneration
ofinjuredmotorneuronsinratspinalcord
ZHANGWeil，ZENGYuan—shanl，CHENXiao—jun2，CHENSui—junl，ZHONGZhi—qian91
(1．DivisionofNeurosciences，DepartmentofHistologyandEmbryology，ZhongshanMedicalCo lege，SunYat—sen
University，Guangzhou510080，China；2．CancerResearchInstitute,Centerof a cPrevention，
SunYat—senU iversity，Guangzhou510089，China)
Abstract：ObjectiveToexploreth ffectsofgermination．-activatedG nodermaspore(GASP)on
axonalregenerationofinjuredmotorneuroninratspinalcordfollowingsciaticnervecutandanastomosis．
MethodsRatwasigadministeredbyGASPafterthesciaticnervewascutandanastomosedunilaterally
andtheaxonalregenerationofinjuredmotorneuronwasobservedby lectrophysiology，Fluorogold(FG)
retrogradelabeling，andhistologictechniques．ResultsAftersixweeksof ciaticnervecutandanastomo—
sis，ther coveryratiooflatencyandamplitudeofactionpotentialofregeneratedaxonatsciaticnerveand
theratioofFG—retrogradelabeledmotorneuronalsomainGASPgroupwereallhigherthanthoseincon—
trolgroup．ThegastrocnemiusatrophydegreeinGASPgroupwasalsolowerthanthatincontrolgroup．
ConclusionGASPcanpromotetheaxonalregenerationofinjuredmotorneuroninratspinalcordfollow—
ingsciaticnervecutandanastomosis．
Keywords：germination--activatedGanodermaspore；motorneuron；axonalregeneration；sciaticerve
CUtandanastomosis
祖国传统中药用于周围神经损伤的研究由来已 久，人参、黄芪和当归等均有促进周围神经再生的作
收稿日期：2005—09—12
*通讯作者曾园山E-·mail{yzeng@‘gzsums．edu．caTel：(020)87331452
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·735·
用。又有研究表明党参、黄芪、丹参[j]、银杏叶提取物
EGb[21和补阳还五汤[3]等都能促进神经再生。灵芝
素有“仙草”之称，是中药材宝库中的珍品，萌动激活
灵芝孢子(germination—activatedG nodermaspore，
GASP)是经过萌动激活破壁等特殊加工处理的灵
芝的生理细胞。此前研究发现，萌动激活灵芝孢子可
促进受损伤的脊髓运动神经元[4]和脊髓背核神经元
的存活[5]，本研究拟进一步探讨其是否可以促进周
围神经再生，为临床应用灵芝孢子治疗周围神经损
伤提供实验资料。
1材料与方法
1．1 动物：SD雌性大鼠，体重180～200g，由中山
大学实验动物中心提供，合格证号为(医动字)第
26--99C016号。
1．2药物：萌动激活灵芝孢子，由HolistolIn erna—
tionalLtd．提供(批号GANSPSP04040104)，用时
以0．5％羧甲基纤维素钠(CMC)配制。戊巴比妥
钠，中国医药上海化学试剂公司，批号F20020915。
荧光金，Fluorochrome公司，批号4716905。其他药
品与试剂均为市售分析纯。
1．3仪器：Biolap--410智能型生物信号显示与处
理仪，成都泰盟科技有限公司产品；XTS一4C型手
术显微镜，江苏镇江光学仪器厂产品。
1．4方法：将16只SD大鼠随机分为灵芝孢子组
(胛一8)和对照组(起=8)。动物ip1％戊巴比妥钠
(40mg／kg)麻醉，分离暴露大鼠右侧坐骨神经，沿
梨状肌下缘约2mm处切断坐骨神经，于手术显微
镜下无创缝合线缝合坐骨神经外膜，止血后缝合创
口。术后灵芝孢子组动物ig萌动激活灵芝孢子8g／
(kg·d)[43；对照组动物ig等量CMC。术后大鼠置
于笼内正常饲养6周。
1．4．1 坐骨神经再生轴突的电生理检测：坐骨神经
切断再吻合术后6周，麻醉动物后暴露手术侧的坐
骨神经和腓总神经。应用Biolap--410智能型生物
信号显示与处理仪，将刺激电极放置于紧靠吻合口
处的远端，记录电极置于腓总神经，未手术侧坐骨神
经在对应位置做相同检测。计算机收集数据统计手
术侧和未手术侧坐骨神经动作电位潜伏期及峰峰
值。计算动作电位潜伏期和峰峰值恢复率。
潜伏期恢复率一手术侧动作电位潜伏期／未手术侧动作
电位潜伏期
峰峰值恢复率一手术侧动作电位峰峰值／未手术侧动作
电位峰峰值
1．4．2荧光金逆行标记：在完成电生理检测后于切
断吻合处远端约10mm处将3％荧光金2．5弘L用
微量注射器注入坐骨神经内，缝合创口，继续饲养
3d。
1．4．3腓肠肌湿质量测量及其组织切片的制备：荧
光金逆行标记3d后，麻醉动物，取手术侧和未手术
侧的腓肠肌称湿质量，计算手术侧肌萎缩率[肌萎
缩率=(未手术侧肌肉质量一手术侧肌肉质量)／未
手术侧肌肉质量]。随后将肌肉组织置入4％多聚
甲醛(O．1mol／LPB配制，pH7．4)内固定24h，
再入30％蔗糖(o．1mol／LPB配制，pH7．4)浸泡
沉底。恒冷箱切片机切片，片厚10肛m，HE染色。
1．4．4动物灌注、固定和取材：大鼠取出腓肠肌后，
立即经左心室主动脉插管灌注生理盐水150mL，随
后灌注4％多聚甲醛(O．1mol／LPB配制，pH7．4)
400mL固定。取L4脊髓节段、手术侧吻合处和未
手术侧相对应处的坐骨神经，4％多聚甲醛内固定
4～6h，再入30％蔗糖(0．1mol／LPB配制，pH
7．4)浸泡沉底。恒冷箱切片机将L4脊髓段作连续
横切片，片厚30肛m。每隔4张取1张，每只动物L4
脊髓段共取10张切片。荧光显微镜下计数手术侧
被荧光金标记的运动神经元胞体数，中性红复染后
在光镜下计数同侧脊髓运动神经元胞体数。计算运
动神经元荧光金标记率一荧光金标记的运动神经元
数／中性红复染的运动神经元数。坐骨神经于恒冷箱
切片机作纵切片，片厚15,um，Mallory法染色。
1．5数据处理：所得数据作两独立样本问均数的t
检验，数据处理均采用SPSSIO．0统计分析软件。
2结果
2．1 坐骨神经电生理检测：坐骨神经切断再吻合6
周后，灵芝孢子组坐骨神经动作电位潜伏期和峰峰
值的恢复率分别为74．62％和39．27％，明显高于
对照组(表1，图1)。
表1对照组和灵芝孢子组大鼠坐骨神经切断再吻合
6周后手术侧电生理、荧光金标记和肌萎缩检测
数据的比较(；土F，撑一8)
Table1 Datacomparisonofelectricphysiology，FG
labeling，andmuscleatrophyinoperated
sidebetweencontrolandGASPgroups
ofratsixweeksfollowingsciaticnerve
cutandanastomosis(；±s，库=8)
拥划
动作电位潜伏期动作电位峰峰值运动神经元胞体llElli．1l!lll／
⋯“tfllll／％恢复率／％ 荧光金标记率／％ OA
对照 39．91J：0．2514．44±5．6216．54±5．1064．37士2．86
灵芝孢子 74．62_-4-0．76’‘39．27士3．22。’58．3613．93。。3I．29±2．89’’
与对照组比较：一P<0．01
一P<0．01UScontrolgroup
万方数据
·736· 中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
LL000V最大值：O．48mV
呈苗差糖ds／t2i：-僦0．59m了V
A一未手术侧B一对照组手术侧C一灵芝孢于组手术侧(1)一不惹开始电刺激处
A—unoperatedsideB—operatedsideincontrolgroupC—operatedsideinGASPgroup(I)一showingstartofstimulation
图1坐骨神经切断再吻合6周后坐骨神经吻合处远端的动作电位图
Fig．1Figureofelectricpotentialindistantsideofsciaticnerveanastomotlcplace
sixweeksfollowingsciaticnervecutandanastomosis
2．2荧光金逆行标记：坐骨神经切断再吻合6周
后，对照组被荧光金标记的运动神经元胞体皱缩，其
荧光较弱，神经突起少而不明显(图2—2)。灵芝孢子
组被荧光金标记的胞体明亮，胞体有较多向四周延
伸较长的神经突起(图2—3)。运动神经元胞体荧光
金逆行标记率灵芝孢子组明显高于对照组(表1)。
2一对照组 3一灵芝孢子组 A一被荧光金逆行标记的运动神经元
胞体(+)B一与A为同一张切片，用中性红复染，与荧光金标记
相吻合的运动神经元胞体(十)
2-controlg up3-GanodermasporegroupA——FG—-retrograde
labeledmotorneuronalsoma(0)B—is amesectionwithA，
showingsameone(+)withFG—retrogradelabel dmotorneu—
ronalsomastainedbyneutraledcounterstain
图2大鼠坐骨神经切断再吻合6周后L4脊髓
横切片手术侧
Fig．2OperatedsideofcrossectionofL4
spinalcord6weeksfollowingrat
sciaticnervecutandanstomosis
2．3坐骨神经Mallory染色：正常坐骨神经纵切片
可见排列整齐的被染成红色的轴突和染成蓝色的髓
鞘、结缔组织(图3—4)。坐骨神经切断再吻合6周
后，对照组大鼠的吻合处坐骨神经纵切片可见结构
排列较紊乱，很少有长过吻合处的轴突(图3-5)。而
灵芝孢子组坐骨神经的纵切片上可见成红色的排列
较整齐的轴突长过吻合处(图3—6)。
4一正常组 5一对照组 6一灵芝孢子组 4A一为染成红色的轴突
(一)和染成蓝色的髓鞘和结缔组织(十)5A一坐骨神经切断再
吻合处(十)6A一坐骨神经切断再吻合处(十)和染成红色的再
生轴突(一) 融A的局部放大，Mallory染色
4-normalgroup5-controlg up6-GanodermasporegroupA
4A—showingredaxons(-)，andbluemyelinsheath，andcon—
nectivetissue(十)5A—showingplace(十)ofsciaticnervecut
andanstomosis6A—showingplace(+)ofsciaticnervecutand
anstomosisandregeneratededaxons(一)B—alocalmagnifi—
cationofA，Mallorystaining
图3大鼠坐骨神经纵切片
Fig．3Longitudinalsectionofratsciaticnerve
2．4腓肠肌湿质量及其HE染色：坐骨神经切断再
吻合6周后，两组大鼠手术侧后肢肌肉都有不同程
度的萎缩，但灵芝孢子组大鼠的肌萎缩程度不如对
照组的明显(表1)。腓肠肌HE染色切片可见灵芝
孢子组的肌纤维排列较整齐，肌纤维上横纹明显
(图4—7)，而对照组肌纤维细小，肌纤维间隙变大，
排列紊乱，横纹不明显(图4—8)。
3讨论
灵芝孢子是灵芝发育周期中的另一形态，为灵
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs
7一灵芝孢子组8一对照组骨骼肌肌纤维(十)。HE染色
7一Ganodermasporegroup&controlgroupShowing
skeletalmusclefiber(十)，HEstaining
圈4大鼠手术侧腓肠肌纵切片
Fig．4Longitudinalsectionofratgastrocnemius
ofoperatedside
芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质。灵芝
孢子呈褐色卵形，具双层壁，一般的化学和物理方法
很难打破灵芝孢子的双层壁。本研究应用的灵芝孢
子是经过萌动激活破壁等特殊处理，其活性物质更
容易被利用。灵芝孢子的化学成分复杂，包括蛋白
质、氨基酸类、糖肽类、维生素类、甾醇类、三萜类、脂
肪酸类、内酯和微量元素等印]。灵芝孢子具有抑瘤和
免疫调节等功能，但未有其与神经再生关系研究的
报道，本课题组首次发现萌动激活灵芝孢子亦有促
进切断再吻合的坐骨神经再生的作用。据研究表明，
影响周围神经再生的因素很多，包括神经损伤程度、
炎症反应、神经营养因子和氧自由基损害等。因为灵
芝孢子的灵芝蛋白[71和灵芝多糖耶1可以明显调节机
体的免疫反应，增强巨噬细胞的功能，同时又可抑制
过强的免疫反应。因此，可使机体较快地吸收损伤后
溃变的组织，降低炎症反应，从而利于周围神经再
生。神经营养因子是促进神经再生的重要因素之一，
其中的神经营养素一3(NT一3)能维持感觉神经元存
活，促进运动神经元轴突再生和神经肌肉接头的成
熟，减轻神经损伤后肌肉的萎缩曲]。前期研究已观察
到，灵芝孢子可以明显促进轴突损伤后的运动神经
元表达NT一3，其存活率得到明显的提高队]。因此本
研究推测，表达NT一3的运动神经元其受损伤轴突
的再生能力也可能会增强。神经损伤导致的脂质过
氧化和氧自由基的增加会进一步加剧神经损伤程
度。灵芝孢子含有微量元素硒(Se)和钴(Co)。存
在于谷胱甘肽过氧化物酶中的硒可与维生素E一
第37卷第5期2006年s月 ·737·
起协同产生抗脂质过氧化作用，硒也可以抑制氧自
由基的生成，通过与抗氧化剂辅酶Q的合成，保护
生物膜和细胞免受过氧化物损害。而钴通过参与形
成辅酶B。。利于氧的结合和释放‘”]。另外灵芝孢子
中的三萜类成分也有调节免疫功能，清除氧自由基
和抗脂质过氧化等作用。所以，萌动激活灵芝孢子促
进切断再吻合后的坐骨神经再生可能是以上多种因
素共同作用的结果，但其具体作用机制尚待进一步
研究。
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万方数据
萌动激活灵芝孢子促进大鼠受损伤的脊髓运动神经元轴突再
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作者： 张伟， 曾园山， 陈小君， 陈穗君， 钟志强， ZHANG Wei， ZENG Yuan-shan， CHEN
Xiao-jun， CHEN Sui-jun， ZHONG Zhi-qiang
作者单位： 张伟,曾园山,陈穗君,钟志强,ZHANG Wei,ZENG Yuan-shan,CHEN Sui-jun,ZHONG Zhi-
qiang(中山大学中山医学院,组织胚胎学教研室神经科学研究室,广东,广州,510080)， 陈小
君,CHEN Xiao-jun(中山大学,肿瘤防治中心肿瘤研究所,广东,广州,510089)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(5)
被引用次数： 1次

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