全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月 ·961·
中药现代化论坛
一种中药鉴定gDNA芯片的制备与展望
李同祥1’2，王进科1，王小兰1’2，陆祖宏¨
(1．东南大学教育部分子与生物分子电子学重点实验室，江苏南京210096；2．甘肃广播电视大学，甘肃兰州730030)
摘要：中药鉴定是中药质量控制系统的首要环节，中药鉴定技术的不断发展提高了药材品质评价水平。至今，中
药鉴定技术经历着从传统生药鉴定学的细胞和亚细胞水平向遗传物质DNA分子水平发展的历程，运用DNA芯片
技术进行中药鉴定成为中药鉴定发展的方向之一。介绍了筛选gDNA种特异性探针的抑制性差减微阵列“SSH—ar．
ray”新技术，该技术是将抑制性差减杂交与基于尼龙膜微阵列杂交相结合。以名贵中药材石斛5个品种作为实验材
料，首先是用抑制性差减杂交获得2个品种之间的gDNA差异片段，然后用这些gDNA差异片段与由所有研究品
种的gDNA制备成的微阵列杂交筛选到某一个品种的种特异性gDNA片段。这些种特异性gDNA探针作为种特
异性探针进行物种鉴定。在此基础上建立中药鉴定gDNA芯片的方法并对其应用进行了展望探讨。
关键词：中草药鉴定；种质特异性DNA探针；gDNA芯片
中图分类号：R282．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)07—0961—04
PreparationndprospectofgDNAmicroarrayfospecies
identificatiOnofChinesemateriamedica
LITong—xian91“，WANGJin—kel，WANGXiao—lanl”，LUZu—hon91
(1．NationalLaboratoryforMolecularandBiornolecularElect onics，SoutheastUniversi y，Nanjing210096，China；
2．GansuRadioTVUniversity，Lanzhou730030，China)
Abstract：TheidentificationoftraditionalChineseherbs(TCH)isveryimportantinthequalitycon—
trolsystemofTCH．ThedevelopmentoftheTCHidentificationtechniqueshasimprovedthqualityevalu—
ationlevelofTCH．BySOfar．theTCHidentificationtechniqueshavebeendevelopedfromtraditional
pharmacognosticidentificationme hodsbasedoncellandsub—celltogeneticDNA(gDNA)level．Itisa
tendencytouseDNAmicroarraytoidentifythespeciesofTCHinrecentyears．Inthisreview，anew
methodcalledsuppressionubtractionhybridizationandDNAarray(SSH—array)wasintroduced，which
combinedthSSHtechniquewithmicroarrayhybridizationb sedon ylonfilm．FiveplantsfromDendro—
biumSw．wereusedasexperimentalmaterials．FirstlythedifferentialgDNAfragmentsbe weentwo
speciesbySSH—arraywereobtainedanthenthediferentialgDNAfragmentswi hthemicroarraysmade
upofmultiplewholeg nomesfromeveralspeciesw rehybridizedtoscreentheuniquedgDNAfragments
foronespecies．ThescreeneduniquegDNAfragmentcanbeusedasspecies—specificrobesoridentifying
thespecies．Basedonthmethod，aprocedurefospeciesdentificationofTCHwasestablishedwith
gDNAmicroarrayanditsappliedprospectswerediscussed．
Keywords：identificationo traditionalChineseherbs；species—specificDNAprobes；gDNAmicroarray
我国药材资源丰富，但目前使用的药材来源复
杂，时有互混、互代、以假充真现象存在，严重影响中
药使用安全有效和中药质量水平，因此，对各种药材
进行快速、准确、高通量鉴定十分重要。然而，传统的
鉴定方法主要是基于形态学叭2|、解剖学‘33和化学成
分分析‘43的方法，这些方法易受到环境及发育条件的
影响。为了克服传统的鉴定方法的不足，许多以遗传
物质为基础的分子生物学方法成功地应用于物种的
鉴定，如ribotyping‘5’引、随机扩增多态性DNA(ran—
domamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)‘78|、
收稿日期：2004—11一09
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30371750)；国家高技术研究计划(2001AA222012，2002AA222041)
作者简介：李同祥(1966一)，男，甘肃兰州人，副教授，生物医学工程博士，研究方向为分子生物学和生物芯片。
E—mail：ltxiang@SeLl．edu．cn
*通讯作者陆祖宏Tel：(025)83619983E—mail：zhlu@seu．edu．cn
万方数据
·962· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月
16S一23S间隔转录区PCR扩增(PCRamplification
oftheinternaltranscribedspacer16S23S，ITS
16S一23SPCR)[9]、ITS—PCR—RFLPl”]、特异鉴别
PCR(PCR—specificidentification)[111和mip基因测
序(mipgenesequencing)[1⋯。这些方法为基于基因
组序列的物种鉴定提供了可能的工具。但是这些方法
检测过程烦琐或结果的不稳定一s3使它们没有成为常
规和可靠的物种鉴定方法。
DNA芯片技术的出现为高通量中药鉴定提供
了良好的发展前景。虽然DNA芯片技术已广泛应
用于DNA测序(sequencingbyhybridization，
SBH)、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymor～
phisms，SNPs)分析、基因表达分析、基因诊断、药
物筛选、物种鉴定等各个方面，但在中药鉴定方面，
有限的种特异性探针数量及鉴定的准确性成为应用
基于探针的DNA芯片技术进行高通量中药鉴定的
瓶颈。为此笔者提出了两种可能的方法以促进生物
芯片的中药鉴定，一是在整个基因组寻找可用于中
药鉴定的大量种特异性探针，另一是使用多重特异
性探针进行物种鉴定。本文就抑制性差减微阵列
(suppressionsubtractionhybridizationandarray，
SSH—array)技术[13]进行大量的种特异性探针筛选
和中药鉴定gDNA芯片的制备技术流程作一介绍，
同时对其应用的前景进行了展望。
1“SSH—array”技术的大量种特异性探针筛选
1．1 差异片段的制备：差异片段的制备是按照抑制
差减杂交方法[143进行。利用链内退火优于链间退
火，且比链间退火更稳定，从而使非目的序列片段两
端反向重复序列在退火时产生类似于“锅柄”的结
构，无法与引物配对，选择性地抑制了非目的片段的
扩增而使目的片段大量的扩增富集。抑制性差减杂
交与差异片段的富集见图1。
首先，用CTAB法提取各石斛品种基因组
DNA，用识别4个碱基的RsaI酶酶切，酶切产物为
平头末端，理论上每256个碱基就有一个酶切位点，
其酶切片段大小在150～500bp，主条带区在250
bp。再次，设计合成一对用于套组PCR的接头l
(Adaptor1)(5’一CTAATACGACTCACTAT～
AGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT一37)和
接头2(Adaptor2)(5，_CTAATACGACTCACT～
ATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT一3’)，
引物 1(Primer1)(57一CTAATACGACT～
CACTATAGGGC一3’)和一对套组PCR引物1
(NestedPCRPrimer】)(57 TCGAGCGGCCGC～
接头1 接头2 引物1 套组PcR引物1 套组PcR引物2
■氍灞—暖瓣 糕薯等嚣 绷
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a黼强扣——一
b黼Ii篡毫黧==邈潭黼
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a，b，屯d+e鞠蜷靶=：=鼍鏊j胬瓣
末端补齐
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}加^引物一
I FCR扩增
黼秘匪黝’’“⋯ c，d不扩增辫∽⋯ b—b’不扩墙
c线性矿增
一5’强暖溢器删蚺蜊蝴州叫鞠嘲3。
和 e大量扩增
3。獭瞄蕊鎏__删_删啊褥蹦嘲5’
图l抑制性差减杂交与差异DNA片段的富集图
Fig．1SchemaofSSHandifferentialDNA
fragmentsrichment
CCGGGCAGGT一37)和套组PCR引物2(Nested
PCRPrimer2)(57一AGCGTGGTCGCGGCCGAG—
GT3’)。然后进行两次差减杂交和两次PCR扩增。
1．1．1两次差减杂交：第1次差减杂交时，用过量
的驱赶者(Driver)加入到分别连接了Adaptor1和
Adaptor2的试验者(Tester)(即Adaptor1-Tester
和Adaptor2-Tester)中加热变性后分别退火杂交，
则Tester和Driver中相同的片段形成双链，而留下
各自有差别的片段。第2次差减杂交时，将第1次杂
交后的产物混合，再加入新制备的变性的Driver，再
次退火杂交。在Tester和Driver样本之间所存在的
那些有差异的片段进一步得到富集。
1．1．2 两次PCR扩增：差减杂交产物需经2次
P R才能有效地扩增差异片段。首先用Primer1进
行第1次扩增，再用NestedPCRPrimer1和Nest—
edP RPrimer2进行第2次扩增。在PCR反应中，
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月·963·
只有(e)类DNA片段能以指数级扩增。而其他形
式，如(a)、(d)类无引物结合点，不能扩增，(b)类两
端均为同一接头，链内退火优于链间退火。因此，在
链内形成互补结构(发夹或锅柄结构)的可能性和稳
定性均大于引物与其配对结合的可能性和稳定性。
故不能被扩增。使得目标DNA片段(e)得到大量的
富集(图1)。
1．2差异片段的克隆：用差减PCR产物建立一个
标准的10肛L连接反应体系(10×T4ligationbuffer
1弘L，T—vector1弘L，差减PCR产物7弘L，T4DNA
ligase1肛L)，在16℃连接过夜。连接物转化大肠杆
菌，挑取白色重组子克隆，挑取的克隆转入含有LB
培养基的96孑L培养板中，在37℃和200～250r／
min条件下振荡培养过夜。
1．3差异克隆的标记：取0．5弘L培养饱和菌液加
入到反应体积为50uL／孑L的96微孔板中(1vmol／
LDIG—NestedPCRPrimer1、1／umol／LNested
PCRPrimer2、0．1U／p．LTaqPolymerase、200
timol／LdNTPs)扩增标记差减克隆，这里采用
NestedPCRPrimer1和NestedPCRPrimer2代
替T—vector的正反引物来扩增重组克隆，大大的提
高了阳性克隆率，阳性克隆率最低78．1％，最高
84．6％，阳性克隆率平均达到82．3％。差减杂交组
合及阳性克隆率见表1[13|。
表1抑制性差减杂交阳性克隆率
Table1 PositiveclonesratiosofSSH
品种差减克隆Tester咖r阳性魅≮嚣
铁皮石斛 192 铁皮石斛迭鞘石斛 161 83．8
金钗石斛 192 金钗石斛迭鞘石斛 166 86．4
鼓槌石斛 192 鼓槌石斛流苏石斛 158 82．3
亟莶互型 !!! 堕莶互型堡鏖互型 !!! !!：1
1．4 gDNA微阵列的制备：通过SSH只能获得不
同种两两之间差异克隆，而不能获得某一品种的特
异性片段。为了筛选到某一品种的特异性探针，将提
取的5种石斛，即迭鞘石斛、铁皮石斛、金钗石斛、鼓
槌石斛、流苏石斛的gDNA，用RsaI酶切后，加入
变性液(0．5mol／LNaOH，1．5mol／LNaCl)变性，
点佯并固定在尼龙膜上制备成gDNA微阵列用于
杂交筛选。
1．5 地高辛(DIG)标记的差减克隆与gDNA微阵
列的杂交筛选：DIG标记的差减克隆在98。C变性，
变性后的克隆和经60℃预杂交的含有gDNA微阵
列的尼龙膜在62℃杂交过夜。经适当浓度的SSC
(氯化钠／柠檬酸钠)、SDS(十二烷基硫酸钠)溶液洗
涤，进行免疫学检测，那些只与它所代表品种的
gDNA杂交而不与其他4种石斛gDNA杂交的差
异克隆即为该品种的种特异性探针。5对杂交组合
中种特异性探针的阳性探针筛选率最低7．9％，最
高14．6％，平均达到12．1％(表2)[1引，具有较高的
筛选效率。用筛选到的其中两个探针进行了石斛样
本的鉴定，分别来自于铁皮石斛和鼓槌石斛的两个
特异性探针均能准确检测出它们的靶目标。
表2种特异性探针的筛选率
Table2 Screeningratiosof pecies—specificrobe
2 中药鉴定gDNA芯片制备主要技术流程
以尼龙膜为支持材料，建立了中药鉴定gDNA
芯片主要技术流程(图2)。
2．1大量的种特异性探针筛选：寻找、筛选中药的
种特异性DNA序列即探针是DNA芯片技术能否
成功应用于中药鉴定的关键。要实现DNA芯片技
术鉴定中药，必须获得大量的种质特异性探针，在此
基础上才能开展DNA芯片中药鉴定。如前所述，以
迭鞘石斛、铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛
为实验材料，以尼龙膜为支持材料，用“SSH—array”
技术成功筛选到了一定数量的种质特异性探针。
2．2种质特异性探针制备gDNA芯片(gDNA微
阵列)：使用人工或标准机器点样仪将获得的种特异
性探针点样在尼龙膜上，98℃烘烤20min将其固
定在膜上，可使用未纯化的PCR产物探针点样，其
点样过程比点样到其他固相支持物表面更简单。
2．3待鉴样品DNA的提取、扩增及标记：待鉴样
品DNA的提取与进行种质特异性探针筛选时方法
相同。gDNA用RsaI酶切后，连接接头3(Adaptor
3)(57一AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA一
3‘)，用DIG标记的引物3(DIG—primer3)(5’一AGG—
CAACTGTGCTATCCGAGGGAA一37)扩增标记，
其标记的PCR产物直接用于杂交鉴定。
2．4检测样品DNA与芯片杂交：杂交过程与DIG
标记的差异克隆与gDNA微阵列的杂交筛选一样，
DIG标记的检测样品DNA在98℃变性，变性后和
经60℃预杂交的含有gDNA种特异性探针微阵列
万方数据
·964· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月
I!竺兰兰!!竺!
o
I识别4个碱基(GTAC)的RsaI酶酶切，产生长度为150—500bp
的平头末端双链DNA,晰 f
o o匪亟茎T1Tt2匪鄯蛰PDriver将其分为2份(_lf)
U——一[二二巫[]臼I7髫嚣Io 一
图2 中药鉴定gDNA芯片制备主要技术流程
Fig．2ProcedurefopreparationofgDNAmicroarray
forspeciesdentificationofTCH
的尼龙膜在62℃适度杂交。经适当浓度的SSC、
SDS溶液洗涤，进行免疫学检测。与膜上gDNA种
特异性探针微阵列杂交的检测样品DNA用剥离液
剥离后，膜阵列可以重复使用4～5次。
2．5结果检测与分析：待鉴样品DNA与gDNA微
阵列杂交后，经化学发光或荧光扫描检测得到杂交
结果，对结果进行分析，确定物种属性。
3“SSH—array”gDNA阵列技术的特点与中药鉴
定gDNA芯片的应用展望
3．1 方便的可操作性：不论是标记的差异克隆与膜
微阵列杂交筛选种特异性探针，还是待鉴样品DNA
和膜微阵列杂交鉴定，杂交和洗膜在高严紧条件下
进行以抑制非特异性杂交，最大限度的降低背景干
扰。可用未纯化探针或标记的待鉴样品PCR产物进
行点样和杂交。微阵列可重复杂交3～5次，相对成
本较低，一般要求较低专业化和成本的仪器及试剂，
在一般条件下的实验室就可开展工作。
3．2可靠的探针载体：种特异性探针是在整个基因
组水平上筛选，gDNA的信息量大，存在大量的不同
分子标记区，且不受外界因素和生物发育阶段及器
官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含相
同的遗传信息，为在基因组水平上寻找获得种质特
异性探针提供了技术保证。
3．3 中药物种的有效鉴定：筛选到的大量的种特异
性探针在大肠杆菌中进行克隆繁殖，可点样于玻片
或尼龙膜上制备成低成本、高通量鉴别多种中药材
物种及真伪的中药材种质鉴定gDNA芯片，可解决
一些同属多来源的植物药(如贝母类)、动物药(如蛇
类、龟板鳖甲类)和一些贵重中药(如麝香类、燕窝
类)及其伪品等的鉴定问题，对中药的安全用药和质
量控制，促进中药现代化具有重要的意义。
3．4 中药材种间、真伪鉴别系统基因库标准基因图
谱建立：如果以此获得的大量种特异性探针为基础，
可对中药的基因组特征进行全面研究，为探索中药
的遗传进化和生物学分类提供大量的信息资源，从
而建立中药材种间、真伪鉴别的系统基因库标准基
因图谱。
3．5道地药材的鉴别：道地药材的产生除了与药材
特定的生长环境和特殊的采收加工技术有关外，还
与该道地药材产区内这一物种的地方种群或居群中
遗传上的特殊性有关，找出道地药材的特异性
gDNA序列，建立特定的杂交图谱，即可区分道地药
材与非道地药材。并且可通过对获得的大量探针的
(下转第992页)
僵雾
万方数据
·992· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月
石油醚脱脂，然后用醋酸乙酯萃取，回收溶剂得浸膏
115g，经硅胶柱色谱分离，以环己烷一醋酸乙酯、氯
仿一甲醇系统梯度洗脱，得到化合物I～Ⅵ。
3结构鉴定
p香树脂醇(I)：白色针晶(甲醇)，mp194～
196℃。MS(m／z)：426(M+)，411，247，218(100)，
203，189，135，121，69，57。IR％KB；rcm～：3232，1628，
1 606，1512，1450，1281，1229，1067。其1H—NMR
及13C—NMR数据与文献报道一致口]。
齐墩果酸(Ⅱ)：白色针晶(甲醇)，mp>300℃。
MS(m／z)：456(M+)，438，423，395，248(100)，
233，208，190，133。IR蠖B。。rcm：360，2940，l695，
1460，1375，1310，1265，1225，1030，990。与齐墩
果酸对照品TLC、IR、MS一致。
5一去甲基橘黄素(Ⅲ)：浅黄针晶(甲醇)，mp
145～146℃。MS(m／z)：388(M+)，387，373(100)，
359，345，211，183，162，147，137。IR燃cm～：
3440，1655，1560，1340，1280，1100，1050。其
1H—NMR及”C—NMR数据与文献报道一致[6]。
百里香素(1V)：浅黄针晶(甲醇)，mp221～222
℃。MS(m／z)：360(M+)，345(100)，197，169，151，
148。IR艘cm～：3430，2846，1660，1598，1584，
1380，1285，840。其1H—NMR及13C—NMR数据与文
献报道一致[7]。
p谷甾醇(V)：无色片晶，mp139～140℃，与
对照品TLC、IR一致。
胡萝b苷 vi)：白色粉末，mp280285℃，与
对照品TLC、IR一致。
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(上接第964页)
综合分析研究，为由于遗传上的差异性造成的道地
药材和非道地药材质量差异的研究、以及优质中药
材种质的筛选和育种栽培研究提供信息资源。
3。6 复方制剂中单味药材的检出：中药复方制剂中
单味药材的检出，用传统的鉴别方法时常难以奏效，
如果获得大量的不同药材的特异性DNA探针，便
可以此为基础制备出高通量中草药gDNA芯片即
可达到鉴别的目的。
致谢：中国药科大学李萍教授对该项工作给予
帮助。
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万方数据
一种中药鉴定gDNA芯片的制备与展望
作者： 李同祥， 王进科， 王小兰， 陆祖宏， LI Tong-xiang， WANG Jin-ke， WANG Xiao-lan
， LU Zu-hong
作者单位： 李同祥,王小兰,LI Tong-xiang,WANG Xiao-lan(东南大学,教育部分子与生物分子电子学重
点实验室,江苏,南京,210096;甘肃广播电视大学,甘肃,兰州,730030)， 王进科,陆祖宏
,WANG Jin-ke,LU Zu-hong(东南大学,教育部分子与生物分子电子学重点实验室,江苏,南京
,210096)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(7)
被引用次数： 5次

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2.应依.徐红.王峥涛 DNA分子标记技术在中药石斛类药材鉴定中的应用[期刊论文]-世界科学技术-中医药现代化
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3.刘静.何涛.淳泽 分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展[期刊论文]-应用与环境生物学报 2008(6)
4.阎爱华.王冬梅 抑制性差减杂交技术(SSH)在植物学研究中的应用[期刊论文]-华北农学报 2008(z2)
5.斯金平.何伯伟.俞巧仙 铁皮石斛良种选育进展与对策[期刊论文]-中国中药杂志 2013(4)


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