全 文 ：·1640· 中革1IsChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
出酶法提取的最佳条件：以酶料比40：1加入槐米
干粉中，在pH7．0、温度20℃下，酶解处理1h后，总
黄酮提取率可达11．4％，比常规提取率增加了
28．7％。使用微生物粗酶辅助法是中药材提取的新
方法，值得进一步探讨和进行工艺优化。
参考文献：
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苦瓜籽MAP30的聚乙二醇化学修饰条件优化及纯化研究
张永明，刘盛邦，黄 凯，聂 宇，孟延发。
(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都 610064)
摘要：目的探讨聚乙二醇修饰苦瓜籽核糖体失活蛋白(MAP30)的反应条件以及修饰产物的纯化方法。方法
在不同条件下，将聚乙二醇活性酯(mPEG)z-NHS与MAP30反应，用SDS—PAGE分析不同反应条件对产物成分的
影响；采用SephacrylS一300HR分子筛柱色谱法对修饰产物进行分离纯化，TNBS法测定目标产物PEG—MAP30的
氨基修饰度。结果 聚乙二醇修饰MAP30的最优反应条件为4℃，pH8．5硼酸硼砂缓冲液，MAP30质量浓度
lmg／mL，MAP30与(mPEG)z-NHS质量比1：10为最佳修饰条件，5min内反应完全；反应产物进一步纯化，经
SDS-PAGE检测目标产物PEG-MAP30中不含未修饰的MAP30；TNBS法测定MAP30的氨基修饰度为44．9％。结
论初步确定了聚乙二醇修饰MAP30的反应条件和修饰产物的纯化方法。
关键词：苦瓜籽；核糖体失活蛋白(MAP30)}聚乙二醇；化学修饰
中图分类号：R284．2}R286．02文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11一1640—04
ModificationconditionsoptimizationandpurificationofPEGylatedMAP30
fromSemenMomordicaeCharantiae
ZHANGYong—ming，LIUSheng—bang，HUANGKai，NIEYu，MENGYan—fa
(KeyLaboratoryofBio—resourcesandE o—environment，MinistryofEducation，CollegeofLifeScience。
SichuanUniversity．Chengdu610064，China) ．
Abstract：ObjectiveToexploreconditionsforthemodificationofMAP30fromSemenMomordica
Charantiaewithpolyethyleneg ycol(PEG)andthemethodforthepurificationofPEG—MAP30．Methods
ToanalyzethinfluenceofvariousconditionsonthecomponentsofPEG—MAP30bySDS—PAGE，purify
PEG—MAP30bySephacrylS一300HRmolecularsievecolumnchromatography。anddetectthemodification
rateofaminobyTNBSundertheoptimalreactionconditionwiththereactionof(mPEG)2一NHSand
MAP30．ResultsTemperature4℃，boricacid—boraxbufferwithpH8．5，concentrationofMAP30
1mg／mL，themassratioofMAP30tO(mPEG)2一NHS(1：10)，and，5minforreactiontimewere
selectedastheoptimalreactionco dition．Molecularsievecolumnshowedagoodpurificationeffect．The
基金项目：国家自然科学基金资助项目(C01020404)
作者简介：塑永明(1982--)，男，河奄新乡人．硕士研究生，2005年毕业于河南师范大学生命科学学院，研究方向为蛋白质工程与酶工
程。E—mail：dongxlel10@tom．corn
*通讯作者盂延发E．mail：yfmeng：@163．net
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万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 641·
modificationrateofaminowas44．9％testedbyTNBSundertheoptimalreactioncondition．Conclusion
ThefactorsinfluencingthemodificationofMAP30withPEGaredetermined，andapurificationmethod
forPEG—MAP30isdeveloped．
Keywords：SemenMomordicaeCharantiae；momordicaanti～HIVproteinof30kDa(MAP30)；
polyethyleneg ycol(PEG)；chemicalmodification
MAP30(maomordicaanti—HIVproteinof30
kDa)是从苦瓜籽中提取的一种相对分子质量为
3．0X104的蛋白质，具有Ⅳ一糖苷键活性，破坏DNA
拓扑结构以及抑制HIV一1整合酶的活性[¨。MAP30
可以特异性地抑制肿瘤细胞和受病毒感染的细胞，
诱发其凋亡，对正常细胞却没有不良反应c“纠。但是
作为一类外源蛋白，MAP30注射时容易引起体内
的免疫反应，体内半衰期较短，限制了它在临床上的
应用。聚乙二醇(PEG)是一种两亲性聚合物，是一种
具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒
性。PEG本身无免疫原性和蛋白酶识别位点，其修
饰蛋白质会因掩盖某些抗原决定位点而降低PEG
化蛋白药物的免疫原性[3]，也可能封闭蛋白酶作用
位点而保护蛋白质不被降解r．]。相对分子质量的增
大会降低肾小球的清除速率，增加药物在体内循环
半衰期，从而提高药物的生物利用度【5一]。目前PEG
修饰的腺苷脱胺酶和天冬酰胺酶已获批准上市[7]。
本研究采用(mPEG)2一NHS(N—hydroxysuccinimide—
PEG。)修饰MAP30，进行PEG修饰条件筛选、修饰
产物分离纯化及部分性质研究，为MAP30一PEG研
制开发提供一定的依据。
1材料
MiniI型电泳仅(Bio—Rad)；MAP30参照文献
报道制得[11；(mPEG)2一NHS(Mr20000)，
Shearwater公司产品；SephacrylS一300HR，
Pharmacia公司产品；MWCalibrationKit(Hou—
Bio)；其余试剂均为国产或进口分析纯。
2方法与结果
2．1修饰条件的优化
2．1．1 修饰反应进程分析：温度4℃条件下，
MAP30终质量浓度采用1mg／mL，MAP30与PEG
活性酯按质量比l：10进行反应，即1mL反应体系
中加人10mgPEG活性酯进行反应。修饰反应进行
10s、5、10、15、20、30min后分别取样40tzL加入到
装有40pL1mol／LGly的EP管中中止反应。分别
取样进行SDS—PAGE。结果显示5、10、15、20、30min
所取样品的组成无明显差别，表明至少在5min内
已反应完全，见图1。
1～6～反应时同为lO3、5、lO、15、ZO、30rain
1—6-reationtime：lOs，5、10t15，20，and30rain
围1不同反应时间PEG修饰MAP30的反应进程分析
lg．1SDS·PAGEofMAP30reactionbyPEGmodification
atvariousreactiontimes
2．1．2MAP30与PEG活性酯比例对修饰反应的
影响：温度4℃条件下，MAP30终质量浓度采用1
mg／mL，分别按MAP30与PEG活性酯的质量比l：
2、l。5、1：10进行修饰反应，即3个lmL反应体系
中分别加入2、5、10mgPEG活性酯，反应30min，取
样进行SDS—PAGE。结果显示，随着PEG活性酯与
MAP30质量比的增加，MAP30带所占比例逐渐下
降，PEG—MAP30带比例逐渐上升，并且出现更高修
饰度的条带，见图2。
1-MAP302～4-MAP30与(mPEG)2-NHS的质量
比为1 t 2、1I 5、1t 10
1一MAP302--4-nm95ratiosofMAP30
，tO(mPEG)2一NHSl l 2．1I 5，and1 l 10
围2 MAP30与mPEG2-NHS质量比对修饰反应的影响
Fig．2SDS—PAGEOfmodificationreactionatvarious
越盥sratiosofMAP30to(mPEG)rNHS，
2．1．3MAP30蛋白质量浓度以及缓冲液对修饰
反应的影响：温度4℃条件下，MAP30终质量浓度
采用1、2mg／mL，缓冲体系为pH8．550mmo／／L磷
万方数据
·1642· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
酸盐和硼酸硼砂缓冲液，按质量比1：10加入PEG
活性酯，郎1mL蛋白质量浓度为1mg／mL的反应
体系中，加入10mgPEG活性酯；1mL蛋白质量浓
度为2mg／mL的反应体系中，加入20mgPEG活性
酯，反应30rain。取样进行SDS—PAGE。结果显示，
在两种缓冲液中，蛋白质量浓度1mg／mL的修饰效
果皆比2mg／mL略好，同时磷酸盐缓冲液比硼酸硼
砂的修饰效果略差，见图3。
1’2一辟酸盐缓冲教 3一MAP30
4，5一硼砂硼酸缓冲液
1，2--phosphatebuffer3-MAP30
4，5-boricacid—boraxbuffer
圈3不同MAP30质量浓度及缓冲液对修饰反应的影响
Fig．3SDS—PAGEofmodificationreactionatdifferent
MAP30concentrationandbuffers
2．1．4温度对修饰反应的影响：MAP30分别置于
4、12、25℃预冷或恒温10rain，按质量比1t 0加入
PEG活性酯，即1mL反应体系中加入10mgPEG
活性酯，反应30min。取样进行SDS—PAGE。经SDS—
PAGE分析，在3种温度(4、12、25℃)下修饰反应
产物相对比无明显差别，表明温度对修饰反应影响
不大，见图4。
2．2 PEG—MAP30的分离纯化：采用SephacrylS一
300HR分子筛柱色谱，以pH7．0，含0．15mol／L
NaCI的50mmol／L磷酸盐缓冲液为流动相，收集各
洗脱峰。MAP30通过自由氨基与PEG以稳定的酰
胺键共价结合成PEG化MAP30，即MAP30一PEG，
同时(mPEG)：一NHS上的官能团N～羟基琥珀酰亚铵
(Ⅳ一hydroxysuccinimide，NHS)脱落。经Sephacryl
S一300HR分子筛柱色谱纯化，得到3个洗脱峰，
SDS—PAGE分析显示保留时间最短的为MAP30一
PEG，其次为未反应的MAP30，最后是修饰反应的
另一个产物NHS。见图5。
2．3 蛋白凝胶电泳(SDS—PAGE法)：以10％或
12％分离胶和4％浓缩胶进行SDS—PAGE测定，考
1一MAP30
2～4一反应温度4、12、25℃
l—MAP30
2--4一reactiontemperatures4，12，and25℃
图4不同反应温度对修饰反应的影响
Fig．4SDS—PAGEofmodificationreaction
atdifferentt mperatures
3
60 90 120 150 180
l／min
1一PEG—MAP302-MAP303-NHS
圈S SephacrylS-300HR分子筛色谱分离纯化
MAP30-PEG
Fig．5PurificationofMAP30-PEGbySephacryl
S-300HRmolecularsievechromatography．
马斯亮蓝R一250染色后，脱色液脱色至背景近无色。
经过分子筛色谱分离后，由于MAP30一PEG与
MAP30的洗脱峰未完全分开，为了保证PEG—
MAP30的质量分数，弃去了PEG—MAP30洗脱峰后
面的一小部分，见图6。
2．4 MAP30氨基修饰度的测定：蛋白的测定采用
BCA法Is]。采用TNBS法测定MAP30氨基修饰度。
用紫外(UV)吸收法调节MAP30和MAP30一PEG
到相同蛋白质量浓度，分别取200pL加入5弘L
0．0 1g／mLTNBS溶液，避光反应1h后测定420
tim处吸光度值，以0．1mol／LpH8．5的硼酸缓冲
液为对照，测定420rim吸光度值，计算MAP30的修
饰度[修饰度=(AMAP30—AMAP30-P阮)／AM椭。]。计算
得氨基修饰度为44．9％，说明MAP30分子中44．90A
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 643·
为MAP30与PEG活性酯的比例，MAP30蛋白质量
浓度和温度不是主要因素。因此，修饰反应的条件设
计为蛋白质量浓度1mg／mL，4℃，pH8．5硼酸缓
冲液反应体系，MAP30与PEG活性酯质量比为1：
10，反应5min即可。
由于蛋白质在PEG修饰前后的等电点和分子
大小发生改变，修饰反应混合物的分离纯化可选择
离子交换或分子筛色谱。本研究中使用的PEG活性
酯相对分子质量相对较大，MAP30修饰前后的相
对分子质量相差较大，使用SephacrylS一300HR分
子筛色谱能较好地分离MAP30一PEG，并且能彻底
1一MAP302-MAP30一PEG3-Marker 地去除相对分子质量较小的反应副产物NHS和交
圈6 SephacrylS-300HR凝胶过滤色谱分离纯化 换缓冲体系。故本研究采用分子筛柱纯化修饰反应
MAP30-PEG 混厶砌
FIg．6PurificationofPEG-MAP30bysepha。ryl
分离得到的样品MAP30—PEG对肿瘤细胞有选
S一300HRgelfiltrationchromatography
。。 。’。’’。‘。 ’’。。’’一。一
的氨基结合了PEG。每个MAP30分子中含有15个择性的毒性作用，对正常二倍体细胞毒性极小，为其
赖氨酸残基，由此可推断出每个MAP30分子上平在临床方面的应用提供了一定的依据。
均结合了约7个PEG。
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数生长期细胞，用培养液调整细胞浓度至5X10／ covalent乱‘achm“‘ofpoIveY也yle”glycolLI]√』”“nol，
mL，用此细胞液将样品MAP30和MAP30-PEG稀[4]MonfardiniC．Schi。，o。0，CalicetiP，甜4I．Abranched
释至不同质量浓度。每孔150pL，3个复孔。阴性对：攀omnh01yp01．y．(e山yleneglyc01)forp”钯”“odii”毗1∞
照加放线菌酮(终质量浓度0．05pL／mL)，阳性对照Is]FreeyRE．ChemicaImodifi。ationofprotein。．commentsand
孔中加入细胞液。培养48、72、96h后J$)kMTT(25[6]≮三：：；[J{。2：麓主警nYR．esDi,1。9tri87b。,2。i9。：。l=意。。。
ttL／孔)，继续培养4h，倾去上清液，加入二甲基亚砜 uptakeofpoly(ethyleneglyc01)withdifferenttoo!ecular
(150taL／孔)，用酶标仪测定570nm波长处吸光度兹=≤t，elr99i4nt，罴篇“n18‘斌啪to“”u-。
值。在本实验条件下，经纯化的MAP30和MAP30一[73Verone。eFM，HarrisJM．Introductionando，er。ie。of
PEG对供试的几种肿瘤细胞株均表现出不同程度 !：p!oeandpro谳npegyla“o“[J]·触’胁“g删。胁，
的抑制生长作用，与熊术道等报道结果相似[9]。其中 Is]KozlowskiA，HarrisJM．Somerecentdevelopmentsinthe
MAP30一PEG的活性回收率较高，详细数据及结果 竺篙塞。慧：裟葛；：。t，e1：巍篙=a，p2p。101ica“702n：
将连同专利另发表。 217—225．
3结论 [93箕墓‰i黧暑晶喜嚣j≮喜答茎雾；紫嘉嚣，篓嚣芰
影响(mPEG)2一NHS修饰MAP30反应的因素81—84．
万方数据
苦瓜籽MAP30的聚乙二醇化学修饰条件优化及纯化研究
作者： 张永明， 刘盛邦， 黄凯， 聂宇， 孟延发， ZHANG Yong-ming， LIU Sheng-bang，
HUANG Kai， NIE Yu， MENG Yan-fa
作者单位： 四川大学生命科学学院,生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)
被引用次数： 1次

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