全 文 ：·1832· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
·药理与临床·
隐孔菌多糖对致敏小鼠肺组织趋化因子mRNA
和CX一肿瘤坏死因子mRNA表达的影响
陈 黎1，谢诒诚1，柯传奎2，谢强敏p
(1．浙江大学药学院浙江大学城市学院，浙江杭州 310058；2．杭州赐富生物技术有限公司，浙江杭州310053)
摘要：目的观察致敏小鼠抗原攻击后肺组织趋化因子(eotaxin)mRNA、*肿瘤坏死因子(TNF一)mRNA表
达的时程关系以及隐孔菌多糖(CryptoporusPolysaccharide，CP)对表达的影响。方法采用半定量RT—PCR法
测定肺组织eotaxinmRNA和TNF—amRNA表达，并通过观察支气管肺灌洗液(BALF)中自细胞总数和嗜酸性
粒细胞的数目验证eotaxinmRNA和TNF—amRNA表达增多的功能。结果致敏小鼠抗原攻击8h后肺组织
TNF-amRNA表达和24h后eotaxinmRNA表达达到高峰，与对照小鼠比较明显增多，BALF中自细胞总数和嗜
酸性粒细胞数目相应增加。CP3、10、30mg／kg呈剂量依赖抑制TNF—amRNA和eotaxinmRNA表达以及炎症细
胞在气道的聚集。结论CP抑制肺组织TNF—amRNA和eotaxinmRNA表达可能是其抗过敏性炎症的作用机制。
关键词：隐孔菌多糖；eotaxinmRNA；TNF—amRNA；哮喘
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)12—1832—04
EffectofCryptoporusly accharideoneotaxinmRNAandTNF—amRNAexpression
inlungtissueofsensitizedmice
CHENLil，XIEYi—chen91，KEChuan—kui2，XIEQiang—Minl
(1．SchoolofPharmacy，ZhejiangUniversity，Collegeof ity，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，ChinaI
2．HangzhouCifuBiotechnologyC ．，Ltd．，Hangzhou310053，China)
Abstract：ObjectiveTos udythetime—courserelationshipofeotaxinmRNAandTNF—amRNA
expressioninthelungtissueofsensitizedmiceafterantigenchallengea dtheffectsofCryptoporus
p01ysaccharide(CP)onthesexpression．MethodsEo axinmRNAandTNF—amRNAexpressionwas
determinedbys mi—quantitativeRT—PCR．Thefunctionimplicationsofe taxinmRNAandTNF—amRNA
expressionwerexamedby etectingheumberoftotalleucocyteandeosinophilsinbronchoalveolar
lavagefluid(BALF)．ResultsPeaklevelofTNF—amRNAexpressionappearedat8handeotaxinmRNA
expressionat24hinthelungtissueofsensitizedmiceafterantigenchallenge．Comparedwiththecontrol
group，totalnumbersofleukocyteandeosinophilinBALFincreasedinsensitizedmice．CP3，10，and30
mg／kginhibitedeotaxinmRNAandTNF—amRNAexpression。andi flammatorycellsaccumulationin
airwayofthesensitizedmiceinfl dose—dependentmanner．ConclusionThemechanismofinhibitory
effectsofCPoneotaxinmRNAandTNF—amRNAexpressionmayberelatedotheanti—allergic
inflammation．
Keywords：CryptopOrUSpolysaccharide(CP)；eotaxinmRNA；TNF—amRNA；asthma
前期研究已经证明隐孔菌发酵物对单纯小鼠哮
喘模型和脾虚证小鼠哮喘模型的气道高反应和气道
炎症反应有明显的抑制作用[1]，为了进一步明确物
质中的有效成分，本课题组对其成分进行了分离和
筛选，初步证明隐孔菌多糖(Cryptoporus
polysaccha“de，CP)是主要的抗过敏性炎症成分，
CP能明显抑制致敏豚鼠抗原攻击引起的气道收缩反
应，抑制血小板活化因子(PAF)诱导的嗜酸性粒细
胞(EOS)趋化以及抑制EOS的释放[2]。本实验应用
哮喘模型研究CP抗过敏性炎症的作用机制。
1材料与方法
1．1 动物：BALB／c小鼠100只，体重22～24g，雌
收稿日期：2007—04—09
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30671919)；浙江省科技厅重大科技攻关项目(2005C21072)
作者简介：陈黎(1977一)，女，浙江萧山人，药学专业硕士生，工程师，研究方向为中药、天然药物新药及保健食品开发。
E—mail：chenlicary@yahoo．com．en
*通讯作者谢强敏Tel：(0571)88208231E—mail：xieqm@zju．edu．cn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1833·
雄各半，清洁级，购于上海斯莱克实验动物有限公
司，许可证号：SCXK(沪)2003—0003。实验期间饲
养于浙江大学实验动物中心，清洁级环境，室温
25℃，湿度75％，12h灯光，12h黑暗，无卵白蛋白
清洁饲料喂养。
1．2 药品与试剂：卵白蛋白(V级，美国Sigma公
司，批号：113k7001)；磷酸地塞米松钠盐(DXM，浙
江医药股份公司)；Trizol(Gibeo公司)；逆转录一聚
合酶链反应(RT—PCR)试剂盒；趋化因子
(eotaxin)和0【一肿瘤坏死因子(TNF一0【)mRNA引
物由上海生工生物工程服务有限公司合成，引物序
列及PCR产物长度见表1。隐孔菌多糖(CP，相对
分子质量2x105～5×105，质量分数87％)由杭州
赐富生物技术有限公司提供。
表1细胞因子引物序列及PCR产物长度
Table1 PrimersequencesandlengthofPCR
productof ytokine
1．3仪器：雾化吸入器(BARI，MASTER，德国)，
冷冻离心机(EppendorfCentrifuge5840R，德国)，
显微镜(OlympusBX51，日本)，PCR仪
(Eppendorf，德国)，核酸紫外分析仪(Eppendorf，
德国)，凝胶成像系统(UVP有限公司，英国)。
1．4小鼠哮喘模型的建立：将卵白蛋白溶于10％
氢氧化铝凝胶(自制)中，配制成0．2％卵白蛋白溶
液。每只小鼠两后足掌各注射0．05mL，前足掌各注
射0．01mL，两后腿SC0．03mL，两侧腹股沟各SC
0．03mL，每只小鼠共注射0．24mL进行致敏。10d
后将卵白蛋白溶于1％氢氧化铝凝胶中，配制成
0．2％卵白蛋白溶液，每只小鼠ip0．2mL以加强致
敏1次。致敏第30天抗原攻击，将致敏小鼠置于50
am×50cm×30cm有机玻璃密闭箱内，用雾化吸入
器雾化1％卵白蛋白(用生理盐水配制)60min。
1．5分组、给药剂量及方式：①时程关系研究：40
只小鼠，每个时间点5只，共8个时间点。②CP的作
用研究：60只小鼠，分为6组，每组10只。阴性对照
组(不致敏，生理盐水5mL／kg)；模型组(生理盐
水5mL／kg)；DXM组(1．0mg／kg)；CP(3、10、30
mg／kg)组；均于抗原攻击前30rain采用iv给药。
1．6样本的采集与制备：①时程关系研究：分别于
抗原攻击前，攻击后1、2、4、8、24、72、96h8个时间
点各取5只小鼠乙醚麻醉后放血脱臼处死，打开胸
腔，取出全肺，用生理盐水洗净后立即存放于液氮中
备用。②CP的作用研究：于抗原攻击后24h
(eotaxinmRNA表达的最高点的TNF—amRNA
表达的次高点)用乙醚麻醉后放血脱臼处死，打开
胸腔，气管插管，结扎肺门，由右侧主支气管，用1％
牛血清一生理盐水溶液1mL灌洗支气管肺泡，来回
冲洗左侧肺3次，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。
BALF白细胞计数和分类计数；混匀收集的BALF，
取0．1mL与白细胞稀释液1；1稀释，用细胞计数
板计数炎症细胞，涂片用嗜酸性粒细胞特殊染色后
用显微镜作分类计数。右侧肺组织分离，用生理盐水
洗净后立即存放于液氮中备用。
1．7 RT—PCR反应
1．7。1肺组织总RNA抽提：取100mg肺组织加
1mLTrizol于冰浴下制作匀浆，经氯仿处理，异丙
醇沉淀，75％乙醇洗涤后，略干燥，溶于DEPC100
弘L处理水。经核酸紫外分析仪检测，根据A。。。／A。。。
值，确定样品中RNA纯度和量。
1．7．2逆转录步骤：应用M—MLV逆转录酶，20
弘L反应体系。置PCR仪中42℃反应60min，
72℃变性10min。
1．7．3PCR步骤：建立25弘L反应体系，94℃变
性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，最后
72℃再延伸10min，扩增35个循环。PCR产物检
测采用1．5％琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH为阳性
对照，经凝胶成像分析系统成像、条带密度扫描，以
吸光度eotaxin／GAPDH和TNF—a／GAPDH值进
行半定量分析。
1．8统计学方法：用SPSS10．0统计实验数据，数
据用X±s表示，应用Student—Newman—Keuals进
行检验。
2 结果
2．1 致敏小鼠抗原攻击后肺组织TNF—amRNA
和eotaxinmRNA表达的时程关系：致敏小鼠用抗
原1％卵白蛋白气雾吸人攻击1h，可见肺组织的
TNF—amRNA和eotaxinmRNA表达在2～4h内
开始迅速上升，TNF—amRNA的表达在攻击后8h
达到峰值，然后快速下降，72h基本恢复到抗原攻
击前的水平；而eotaxinmRNA表达在24h达到峰
值，然后逐步缓慢下降，在抗原攻击72h与抗原攻
击前比较还处于较高的水平，到96h才有明显的下
降过程，见图1。
万方数据
·1834· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
0．6
测0．4
{醚
掣
餐O．2
O
0 20 40 60 80 100
t／h
a一凝胶电泳图M一100bpDNA梯形标记。一抗原攻击前
b一凝胶的密度分析
a—electrophoretogramfagarosegelM一100bpDNA
LadderMarkersLane0-beforeantigenchallenge
b-densitometricanalysisofgel
图1致敏小鼠抗原攻击后肺组织TNF-ctmRNA
和eotaxinmRNA表达的时程关系白一5)
Fig．1Time—courserelationshipofTNF—amRNA
andeotaxinmRNAexpressioninlu g
tissueofsensitizedmice(席=5)
2．2 CP对致敏小鼠肺组织eotaxinmRNA和
TNF—amRNA表达的影响：模型组肺组织eotaxin
mRNA和TNF—nmRNA表达水平分别显著高于
对照组(P<0．001、0．01)。CP呈剂量依赖抑制
TNF—a和eotaxinmRNA表达,CP(10、30mg／kg)
对eotaxinmRNA表达的抑制率分别为18．8％和
39．3％(P<0．05、0．01)，CP(10、30mg／kg)对
TNF—amRNA表达的抑制率分别为28．68％和
32．4％(P<0．05)；DXM对eotaxinmRNA和
TNF—amRNA表达的抑制率分别为37．4％和
36．7％；CP3mg／kg对eotaxinmRNA和TNF—a
mRNA表达的抑制作用与模型组比较无明显差异
(尸>O．05)。结果见图2。
2．3 CP对致敏小鼠抗原攻击后气道炎症细胞聚
集的抑制作用：模型组BALF中的白细胞总数和嗜
酸性粒细胞比阴性对照组明显增多。CP呈剂量依
赖抑制气道白细胞总数和嗜酸性粒细胞聚集，CP
3、10、30mg／kg对白细胞总数的抑制率分别为
23．8％(P>0．05)、34．7％(P<0．05)和45．8％
(P<0．01)，对嗜酸性粒细胞的抑制率分别为
22．7％(P>0．05)、33．4％(P<0．05)和45．0％
(P抑制率分别为51．2％(P<0．01)、51．7％(P<
0．01)。结果见图3。
O6
靼0．4
越
紫
醛0．2
对照模型! !! !!DXM
CP／(mg·kg‘1)
与对照组比较：44P与模型组比较：。P<0．05～P#。P<0．0144#P。P圈2 CP对致敏小飘抗原攻击后肺组织TNF—amRNA
和eotaxlnmRNA裹达的影响(；士s，席=10)
Fig．2EffectofCPonTNF—amRNAandeotaxln
mRNAexpressioninlu gtissueofsensitized
miceafterantigenchallenge(工士s，露一10)
f
—
b
一
×
、一
巅
馨
暴
对照 模型 3 10 30
CP／(ms·kg’1)
与对照组比较：44。P与模型组比较：。P444P。P<0．05。。P圈3 CP对致敛小鼠抗原攻击后支气管肺灌洗液中自细胞
总数和嗜酸性粒细胞聚集的影响Q士$，开一10)
Fig．3EffectofCPonaccumulationof otalleucocytes
andeosinophilsinBALFInsensitizedmice
afterantigenchallenge(J土s，一一10)
3讨论
支气管哮喘是一种由多种细胞、细胞因子和炎
症介质引起的，以气道高反应为特征的炎症性疾病，
细胞因子和趋化因子在哮喘的炎症形成中起重要作
用。其中eotaxin和TNF—a是哮喘发病过程中的重
要因素，也是寻找抗炎性平喘药物的新靶点。
eotaxin属于C—C类趋化因子，对EOS具有选
∞
孙
∞
坫
m
0
O
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12,El· 835·
择性的趋化作用，在过敏性炎症反应中，eotaxin能
特异性地募集、趋化EOS[3’4]。eotaxin不仅能激活
EoS，且能刺激骨髓生成和释放更多的EoS，它通
过与EOS表面上特异性受体CCR3相互作用可激
活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径使EOS脱
颗粒Is]。eotaxinmRNA主要表达于呼吸道上皮细
胞以及多种炎性细胞，如淋巴细胞、单核细胞和巨噬
细胞[6]。在变态反应中，这些炎症细胞释放eotaxin
进而引起气道EOS浸润[5“]。研究表明哮喘患者在
变应原攻击后，肺组织的eotaxinmRNA的表达明
显增加[6．川。本实验证明了小鼠哮喘模型组肺组织中
的eotaxinmRNA表达显著升高，于抗原攻击后24
h达到高峰，BALF中的EOS也明显增多，已有实验
证明人和致敏小鼠在变应原的攻击下EoS气道聚集
峰值也发生于24～48hrs,9]。提示eotaxinmRNA表
达增加的时程与EoS气道聚集变化的相关性，
eotaxin是诱导EOS气道聚集的主要趋化因子。
TNF—a是一种主要由肥大细胞、EOS、内皮细
胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、T细胞等产生的具有广
泛生物学活性的前炎细胞因子。本实验证实了小鼠
哮喘模型组肺组织中的TNF一口mRNA表达显著升
高，表达的高峰出现于抗原攻击后的4～8h，明显
早于eotaxinmRNA表达高峰时间，表明TNF-a是
一个哮喘发病时较早启动的细胞因子之一，对激发
其他炎性因子的分泌具有重要作用∞]，至于TNF—a
mRNA与eotaxinmRNA表达增加的因果关系以
及信号传导途径还需要进一步研究。TNF—amRNA
过度表达可使EOS表面的受体与血管内皮细胞表
面上的配体(1ip内皮细胞表达的黏附分子)相互作
用，促进EOS与内皮细胞黏附，跨膜进人肺组织和
气道腔[1州。TNF—a还参与诱导哮喘气道炎症时肺巨
噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞等多种炎
症与非炎症细胞表达诱生型一氧化氮合酶
(iNOS)，该酶被诱导后可持续大量产生NO，过量
NO可使气道充血、上皮剥落，加重血浆渗漏，感觉
神经末梢暴露，造成肺上皮细胞及组织损伤，引起气
道高反应，导致哮喘发病，因此目前认为哮喘治疗中
TNF—a靶点药物的开发有应用前景，糖皮质激素作
用与降低TNF—nmRNA表达有关，因而具有良好
的抗炎作用[1川。
隐孔菌在民间用于治疗气管炎和哮喘。因该菌
为腐生真菌，生态环境严格，以致蕴藏量少，资源紧
缺，故对隐孔菌发酵培养来作为新药源的开发。通过
与野生隐孔菌比较，发酵培养隐孔菌化学成分基本
上与野生隐孔菌相似口引。最近笔者对其成分进行了
分离和筛选，初步证明隐孔菌多糖(Cryptoporus
pDlysaccharide，CP)是主要的抗过敏性炎症成分，
但其作用机制还不清楚。本实验结果表明CP呈剂
量依赖抑制eotaxin和TNF—amRNA表达，提示
CP可能影响趋化因子eotaxin和细胞因子TNF—a
的转录过程，从而减少eotaxin和TNF—a的生成，
进而抑制EOS的气道聚集。 ．
上述结果表明CP抑制肺组织eotaxin和
TNF一0【mRNA表达可能是其抗过敏性炎症的作用
机制。
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万方数据
隐孔菌多糖对致敏小鼠肺组织趋化因子mRNA和α-中瘤坏死因
子mRNA表达的影响
作者： 陈黎， 谢诒诚， 柯传奎， 谢强敏， CHEN Li， XIE Yi-cheng， KE Chuan-kui， XIE
Qiang-Min
作者单位： 陈黎,谢诒诚,谢强敏,CHEN Li,XIE Yi-cheng,XIE Qiang-Min(浙江大学药学院,浙江大学城
市学院,浙江,杭州,310058)， 柯传奎,KE Chuan-kui(杭州赐富生物技术有限公司,浙江,杭
州,310053)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(12)

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