全 文 ：直接离心相比, 微滤在原理上有着本质上的不同, 它
是以相对分子质量大小为基准的分离手段, 一些大
于截留相对分子质量的物质通过微滤后基本上被除
去, 所以微滤透过液更有利于后一步的超滤膜分离。
而絮凝是靠絮凝剂与药液中相关分子的相互作用而
使一些物质絮凝沉降, 然而并不是药液中所有的大
分子都会与絮凝剂相互作用而被沉降, 仍然留在药
液中的一些物质极易造成膜污染, 导致膜通量下降
过快, 而高速离心也存在这样的问题。不过, 与其他
分离方法相比, 微滤2超滤整个工艺中异秦皮啶保留
率并不是最高的, 这主要与微滤预处理时膜组件及
导管中滞留了一些药液有关。
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竹黄无性型菌株产竹红菌素的研究
陈佳佳, 李兆兰, 焦庆才Ξ
(南京大学生命科学学院 药物生物技术国家重点实验室, 江苏 南京　210093)
摘　要: 目的　获得能稳定产生竹红菌素的竹黄无性型菌株, 通过人工培育获得其活性成分竹红菌甲素。方法　通
过组织分离, 从野生竹黄子座中分离筛选出无性型菌株 0258, 进行人工条件下的发酵培养。对其发酵产物进行提
取、分离和纯化, 通过理化性质测定和波谱 (UV öV IS、IR、M S)技术进行结构鉴定。结果　从竹黄子实体分离筛选到
一株无性型菌株 0258, 其能产生稳定的竹红菌甲素。结论　首次获得稳定产生竹红菌素的竹黄无性型菌株, 解决了
竹黄人工培育的种源问题, 使竹红菌素的工业化生产成为可能。
关键词: 竹黄; 竹红菌甲素; 无性型; 波谱分析
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0048 03
Hypocrell in s produced by anam orphosis ferm en ta tion of Sh ira ia bam bus icola
CH EN J ia2jia, L I Zhao2lan, J IAO Q ing2cai
(Pharm aceu tic B io techno logy State Key L abo rato ry, Co llege of L ife Science, N an jing U niversity, N an jing 210093, Ch ina)
Abstract: Objective 　 To ob ta in anamo rpho sis of S h ira ia bam busicola p roducing the componen t,
hypocrellin A effect ively1 M ethods　A stra in w as iso la ted from the fru it of S 1 bam busicola by separa t ing
its hypha and w as cu ltu red by so lid2sta te ferm en ta t ion1 O ne of the pu re chem ical compounds iso la ted from
the strom a of w ild S. bam busicola w as studied on the basis of UV öV IS, IR , M S spectrom etric analysis and
physicochem ical con stan ts1 Results　T he p igm en t is p roved to be hypocrellin A 1 T he iso la te w as deter2
m ined as the stab le anamo rpho sis st ra in 0258 of S 1 bam busicola1 Conclusion 　A namo rpho sis st ra in of S 1
bam busicola is ob ta ined and p recisely app ra ised fo r the first t im e1 T h is study w ill p rovide basis fo r the fu2
tu re m assively indu stria lized hypocrellin p roduct ion1
Key words: S h ira ia bam busicola P1 H enn; hypocrellin A ; anamo rpho sis; spectrom etric analysis
·84· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
收稿日期: 2005204213
基金项目: 国家技术创新基金资助项目 (02CJ213201216)
作者简介: 陈佳佳 (1982—) , 女, 江苏苏州人, 南京大学生物系硕士研究生, 主要从事微生物次生活性代谢产物的研究。
T el: (025) 66813587　E2m ail: n jucjj@ 1261com
　　竹黄 S h ira ia bam busicola P1 H enn 是一种传统
的名贵中药材, 是寄生于竹子上的一种真菌, 多生长
在将衰败或已衰败的竹林中, 主要分布于江苏、浙
江、安徽等地[1, 2 ] , 每年 4 月下旬至 6 月上旬是其生
长季节和最适采集期。竹黄能治疗风湿性关节炎、坐
骨神经痛、小儿百日咳和气管炎等病症[3 ]。近年来对
竹黄的药理和临床试验表明, 竹黄具有镇痛、抗菌、
抗炎、抗癌、护肝和保护心血管的作用[4, 5 ]。竹黄的有
效成分竹红菌素属于 醌类化学物质, 具有自敏光
氧化反应的生物活性, 可光敏杀伤肿瘤细胞和抑制
艾滋病病毒[6 ] , 是一种新型光疗药物。由于竹黄分布
地区局限, 生长季节短暂, 天然产量低, 远不能提供
临床用药的要求。本实验从竹黄子实体中分离了一
株无性型菌株, 通过人工发酵培养, 能产生大量的红
色素。色素经提取、分离和纯化, 波谱分析鉴定, 证明
为竹红菌甲素。
1　材料
　　BSZ 自动分步收集器、HL —2 恒流泵、UV —
300 紫外可见分光光度仪 (日本岛津)、N ico let—
N exu s 870 红外分光光度计 ( KB r 压片)、V G—
ZABH S 数据处理系统质谱仪。薄层色谱硅胶为青
岛海洋化工厂产品。色谱用 Sephadex L H 220 为
Pham acia 产品, 其他试剂均为国产分析纯。竹红菌
甲素对照品购自 Sigm a 公司, 质量分数> 9915%。
竹黄子实体采自南京浦口老山林场, 由南京大学真
菌生物工程实验室李兆兰教授鉴定。母种斜面培养
基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA ) , 生产发酵培
养基为玉米片综合培养基。
2　方法与结果
211　无性型菌株的分离与培养: 竹黄子实体用
011% 升汞表面消毒, 无菌水漂洗数次, 在无菌条件
下进行孢子和组织分离, 共分离了 300 管左右。26～
28 ℃恒温恒湿培养, 待有菌丝长出, 立即转管纯化,
进行菌种鉴定, 筛选出 1 株能产生竹红菌素的无性
型菌株 0258。向母种培养基中加入无菌蒸馏水制备
孢子悬液。250 mL 摇瓶中加入 40 g 玉米片和 50
mL 2% 蔗糖溶液。接入孢子悬液, 接种量为 5% , pH
值自然, 26 ℃培养 7 d。
212　菌株形态观察: 通过N ikon Ecip se E600 显微
镜、捷达—801 形态学显微图像分析系统对竹黄子
实体和无性型菌株进行形态和构造的特征观察。照
片由 Panason ic T K—C1381 数码相机拍摄。
　　野生竹黄子实体幼嫩时肉质, 白色, 紧贴竹枝生
长, 表面平滑。成熟时逐渐膨大, 变为块茎状或不规
则瘤形, 软木栓质, 粉红色, 长 115～ 410 cm , 背面隆
起, 有不规则横沟, 腹面凹陷, 围抱在茎秆上。显微镜
下观察, 子囊壳埋于子座边缘, 亚球形, 直径 480～
580 Λm , 子囊圆筒形, 侧丝线型, 子囊孢子前通常 6
枚, 砖格状分隔, 无色, 梭形, (48～ 60) Λm × (13～
16) Λm。
　　无性型 0258 菌株在室温 26 ℃下 PDA 培养基
上生长良好, 菌丝分化为两种: 基质菌丝为红色, 较
密致, 紧贴基质表面; 气生菌丝为白色绒状, 向四周
伸展蔓延, 产生分生孢子器和分生孢子。分生孢子器
为葫芦形或梨形, 颈部明显, 孔口较大, ( 5415～
7612) Λm × (3910～ 5810) Λm , 颈长 1812～ 2514Λm , 颈宽 1812～ 3217 Λm; 分生孢子无色, 单胞, 表
面光滑, 椭圆至圆柱形, (413～ 515) Λm × (118～
219) Λm。无性型 0258 分类地位属于半知菌亚门
(D eu terom yco t ina)腔孢纲 (Coclom ycetes)球壳孢目
(Sephaerop sidales) , 中文学名竹红霉, 拉丁学名正
在拟定中。竹黄无性型菌株由南京大学真菌生物工
程室鉴定, 菌种准确可靠。
213　竹红菌素的提取、分离、纯化
21311　提取: 培养物干燥后先用乙醇浸提 48 h, 滤
过, 滤渣重复浸提 1 次, 合并滤液, 氯仿萃取, 取氯仿
相的萃取液薄膜减压浓缩, 浓缩物红外干燥, 得竹红
菌素粗品。
21312　分离纯化: Sephadex L H 220 经预处理后装
填于 35 cm ×310 cm 的柱内, 平衡。将色素粗品溶于
2 mL 甲醇, 上样, 用甲醇以 015 mL öm in 的恒定流
速洗脱, 分步收集, 每管 5 mL。合并 26～ 33 管的洗
脱液, 浓缩干燥得到结晶粗品, 丙酮重结晶得纯品。
214　竹红菌素的测定: 精密称取竹红菌甲素对照品
约 5 m g, 用 95% 乙醇定容至 100 mL。分别取 2、4、
6、8、10、12、14 mL , 均用 95% 乙醇定容至 50 mL , 配
成系列对照品溶液。以乙醇作空白, 在 465 nm 处测
定吸光度[7 ] , 绘制吸光度对质量浓度的标准曲线, 结
果竹红菌甲素在 0～ 15 ΛgömL 与吸光度线性关系
良好, 由标准曲线得回归方程 Y = 01037 46 X -
01001 1, 相关系数 r= 01999 4。精密称取色素粗提
物 10 m g, 用 95% 乙醇溶解并定容至 100 mL , 在
465 nm 处测得吸光度为 01512, 代入回归方程, 求
出所对应的质量浓度, 计算得色素粗提物中竹红菌
素的质量分数为 1319%。
215　产物鉴定: 分别取纯化产物和竹红菌甲素对照
品各 5 m g, 氯仿定容至 2 mL。吸取上述两种溶液各
10 ΛL , 点于同一硅胶 H 21% 枸椽酸薄层板上, 用氯
·94·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
仿2乙醚 (9∶1)展开。纯化产物在与对照品色谱图相
应的位置上显相同红色斑点, 证明纯化产物成分为
单一的竹红菌甲素。
　　分离纯化后得紫红色晶体, 溶于乙醇、乙醚、氯
仿和丙酮, 不溶于水。醇溶液呈红色, 在紫外灯下观
察呈樱红色荧光。Feig l 反应呈阳性 (由红变暗紫红
色) , 加入碱液, 则发生显著的颜色变化, 由红变鲜绿
色, 加酸又变为红色, 这些表明有酚基的存在, 显示
出 醌类化合物的颜色反应。
　　质谱分析条件: 大气压化学电离 (A PC1) , 蒸发
器温度 395 ℃, 毛细管温度 150190 ℃, 毛细管电压
17156 V。质谱结果显示分子相关离子峰 547
[M + 1 ]+ , 表明相对分子质量为 546, 与文献报道[7 ]
的竹红菌甲素的相对分子质量一致。UV öV IS: ΚE tOHm ax
nm : 272、341、462、540、579。462 nm 处有一最大吸
收峰, 此为 醌类化合物 Π2Π共轭产生的吸收峰, 吸
收曲线与天然竹红菌甲素吸收曲线[8 ]一致。 IR: ΜKB rm ax
cm
- 1
: 3 425、2 929、2 855、1 736、1 614、1 516、
1 460、1 262。元素分析C: 66199% , H: 4165%。以上
数据与文献报道[8, 9 ]的竹红菌甲素 (hypocrellin A )
基本一致, 定为竹红菌甲素。
216　竹红菌素的稳定性: 取竹红菌素粗提物 10 m g
溶于 100 mL 95% 乙醇制成供试品溶液, 依次进行
以下试验: 加入缓冲液, 调至不同的 pH 值, 测定最
大吸光度和相应的波长, 并观察其颜色变化; 分别在
强日光、紫外光和散射自然光下照射 0、1、2、3、4、5、
6 h, 测定吸光度; 分别在 20、40、60、80 ℃水浴中加
热 1 h, 每 20 m in 测量吸光度。
　　竹红菌甲素在 pH 值 1～ 715 呈红色, 颜色较稳
定, 最大吸光度和相应波长无明显变化; pH 值> 8
时, 呈浅绿色, 最大吸光度和相应波长均降低; pH
值> 9 时, 呈绿色, 最大吸光度和相应波长均无变化
(表 1)。强日光对竹红菌甲素的保色率 (以加热前、
后吸光度值的比值表示)稍有影响。紫外光和散射自
然光对竹红菌甲素的保色率几乎无影响 (表 2) , 因
此竹红菌甲素的耐光性较好。竹红菌甲素对温度的
不同变化亦较稳定 (表 3)。
3　讨论
　　利用天然植物为原料, 用微生物发酵法生产优
质天然色素是食品色素工业的发展方向, 本室分离
筛选的竹黄无性型菌株, 在人工培养条件下产生红
色素, 且经波谱分析和结构鉴定证明该色素即野生
竹黄子座的有效成分竹红菌素, 这对解决人工合成
色素对人体不良反应方面极有意义。本实验对竹红
表 1　pH 值对竹红菌甲素稳定性的影响
Table 1　Effect of pH value on stabil ity of hypocrell in A
pH 值 颜色变化 最大吸收波长 (Κm ax) önm 最大吸光度 (A m ax)
1～ 5 鲜红 470 01506
6 鲜红 465 01512
7 红　 465 01512
8 浅绿 430 01335
9 翠绿 480 01537
11 深绿 480 01537
13 深绿 480 01538
表 2　光照对竹红菌甲素稳定性的影响
Table 2　Effect of l ight on stabil ity of hypocrell in A
光照时间öh 保　色　率
强日光 紫外光 自然光
0 (对照) 1　　 1　　 1　　
1　　　 01982 1　　 1　　
2　　　 01965 01998 01998
3　　　 01951 01998 01998
4　　　 01939 01998 01996
5　　　 01928 01998 01996
6　　　 01922 01998 01996
表 3　温度对竹红菌甲素稳定性的影响
Table 3　Effect of temperature on stabil ity
of hypocrell in A
加热时间öm in 保　色　率
20 ℃ 40 ℃ 60 ℃ 80 ℃
0 (对照) 1 1　　 1　　 1　　
20 　　 1 1　　 01996 01996
40 　　 1 01998 01996 01994
60 　　 1 01996 01996 01994
菌素的分析研究以及竹红菌素的定性定量的检测,
为阐明竹黄的药用机制提供了理论依据。
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