全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·85·
旋覆花提取物抑制血管内皮剥脱后内膜增生的实验研究
狄柯坪，韩梅+，温进坤
(河北医科大学基础医学研究所省部共建教育部重点实验室，河北石家庄050017)
摘 要：目的观察旋覆花提取物(Inulabritannicaextract，IBE)对内皮剥脱诱导的新生内膜形成的影响，并初
步探讨其机制。方法采用主动脉球囊损伤后血管再狭窄动物模型，以免疫组化和Westernblotting方法分别检测
血管内膜增生情况、内膜与中膜比值(I／M)、核转录因子KBp65(nuclearfacto 一柏；p65，NF—KBp65)、激活蛋白一1
(activatorpr tein～1，AP一1)的表达变化及IBE对它们的影响。结果在实验结束时，模型组损伤处血管壁血管平
滑肌细胞(VSMC)大量增生、新生内膜呈弥漫性增厚、I／M值增加，NF—KBp65、AP一1的表达均比对照组明显升高
(P降低(P反应和抑制内膜增生的作用。
关键词：旋覆花提取物(IBE)；血管内皮剥脱；内膜增生；核转录因子xB(NF—KB)；激活蛋白一1(AP一1)
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)01—0085一04
InhibitionofInulabritannicaextractonneointimaformationafterndangiumscrape
DIKe—ping，HANMei，WENJin—kun
(KeyLaboratoryEstablishedbyProvinceandEducationMinistry，InstituteofBasicMedicine，
HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China)
Keywords：Inulabrit nnicaextract(IBE)；endangiumscrape；neointimaformation；nuclearfactor-
JcB(NF—KB)；activatorprotein一1(AP一1)
高血压、动脉粥样硬化、经皮腔内冠状动脉成形
术(PTCA)及支架植入后血管再狭窄等心血管疾
病是由多种因素对血管内皮刺激所触发的慢性炎性
反应，血管平滑肌细胞的异常增殖是其发生的病理
基础。核转录因子IcB(nuclearfacto —JcB，NF—JcB)
作为一种多向性转录因子，其结合序列存在于多种
促炎和促增殖基因的启动子和增强子中，通过激活
靶基因表达而参与机体的免疫炎症反应及细胞增殖
分化与凋亡。因此，如何调控血管细胞的NF—KB活
性以阻断炎性应答信号通路，减少血管损伤部位炎
性介质的释放，已成为目前抗心血管疾病药物研究
的重要策略之一。
欧亚旋覆花InulabritannicaL．是一种用于治
疗偏头痛的传统中药，具有活血化瘀、抗炎镇痛之功
效，本课题组曾经用有机溶剂萃取法从该植物中分
离得到一种具有抗炎镇痛作用的有效部位——旋覆
花提取物(Inulabritannicaextract，IBE)，其中的
有效单体主要是旋覆花内酯(acetylbritanni—
lactone，ABL)及其3种同系物。已经证实ABL通
过抑制RAW264．7细胞中NF—KB的激活而阻制
炎症相关基因iNOS、COX2等的表达而发挥抗炎作
用[1]。但对于RAW264．7细胞中IBE的抗炎作用
机制尚不明确。本研究基于内皮剥脱所引起的慢性
血管炎症是导致内膜增生的主要因素，采用免疫组
织化学及Westernblotting方法，探讨IBE对球囊
损伤主动脉炎症进展的抑制作用及其分子机制，为
研发新型抗血管再狭窄药物奠定实验基础。
1材料与方法
1．1 材料：IBE(含ABL2．66mg／mL)，由河北医
科大学药学院从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离制
备(已获专利授权)；免疫组化染色即用型SP系列
试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；兔抗鼠
NF—JcBp65多克隆抗体、兔抗鼠AP一1多克隆抗体、
HRP标记的羊抗兔IgG二抗及发光试剂均购自美
国SantaCruz公司；其他试剂均为进口或国产分析
纯。成年雄性SD大鼠由河北省医学动物中心提供，
体重300～350g。
1．2大鼠主动脉内膜损伤模型的复制与分组：按照
收稿日期：2006—03—14
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30472167)，河北省自然科学基金资助项目(C2005000722)
作者简介：狄柯坪(1970一)，男，辽宁沈阳人，现为河北医科大学在读博士，主要从事中草药活血化瘀作用的分子机制研究。
Tel：(0311)86876173
*通讯作者韩梅Tel；(0311)86265563E—mail：hanmei@hebmu．edu．an
万方数据
·86· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
文献方法D3进行模型复制。用25％乌拉坦3mL／
kgip麻醉大鼠，分离左颈总动脉，于左颈总动脉远
心端结扎，近心端夹闭。自左颈总动脉远心端剪一楔
形切口，将自制的球囊导管向近心端插入至腹主动
脉远端，注入0．9％氯化钠溶液0．1～0．15mL，使
球囊充分膨胀，然后回拉至胸主动脉起始部。期间以
导丝为轴旋转球囊，反复3次，退出导管，结扎颈总
动脉，松开动脉夹恢复血流，缝合切口。术后大鼠随
机分为模型组及给药组(行一5)。给药组于术前3d
及术后每天igIBE26mg／kg，共给药14d；模型组
用聚山梨酯80一水溶液ig给药；以假手术大鼠为对
照组。
1．3标本制备及形态学观察：模型组及给药组大鼠
于术后21d采取股动脉放血法处死。于胸腹主动脉
非连续切取2段各约0．5cm长的血管，置于4％
多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，间断均匀切片，切片
厚约5弘m，常规HE染色，光镜下观察内膜增生情
况并测量内膜与中膜比值(I／M)。
1．4免疫组织化学染色：按照试剂盒说明操作。血
管组织贴片、干燥后常规脱蜡、脱水，经正常山羊血
清封闭后，分别加入抗p65(1：80)、抗AP一1(1：
80)抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5min。
滴加生物素一辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵
育30min，PBS洗3次。DAB显色后于镜下观察。
阴性对照用PBS替代一抗。在显微镜下随机选取5
个视野，计数p65、AP一1阳性染色细胞数，以细胞核
中出现棕褐色浓染颗粒作为判定阳性细胞的标准。
1．5 Westernblotting分析：按照文献的方法[3“1分
别提取血管细胞胞浆蛋白、核蛋白和总蛋白，用
Lowry法测定蛋白浓度。各组取等量蛋白提取液经
8％SDS—PAGE电泳分离后，电转移至PVDF膜
上，用5％脱脂奶粉封闭，依次与兔抗鼠NF—KBp65
多克隆抗体(1：400)或AP一1多克隆抗体(1：
400)及HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1：10ooo)
室温反应2h，经TTBS、TBS充分洗涤，采用化学
发光法显影。用美国Kodak公司ID数码成像分析
系统分析结果。
1．6统计学处理：实验数据经SPSSl0．0统计软件
包处理，数据以512±S表示，多样本均数采用单因素
方差分析(OneWayANOVA)，组间均数比较采用
t检验。
2结果
2．1 血管形态学改变：光镜下对照组大鼠主动脉壁
各层结构完整，内膜表面光滑仅见单层内皮细胞，中
膜血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，
VSMC)排列整齐呈梭形。球囊损伤21d后，血管
内膜可见VSMC大量增殖且排列紊乱，内膜呈弥散
性增厚；中膜VSMC排列紊乱；管腔缩小。给药组的
血管内膜增生明显减轻，内膜增厚程度比模型组显
著减轻，管腔内径虽明显扩大，但仍旧没有恢复到正
常水平(图1)。
对照 模型
图1大鼠主动脉组织形态学改变
Fig．1Histomorphologicalchangesofr taorta
对照组I／M值很小，约0．04±0．01，模型组I／
M值明显增加，达1．76±0．11，与对照组相比增加
具有显著差异(P<0．05)。给药组I／M值为
o．76±0．16，虽比模型组减少，但仍比正常组高
(P25
2．0
j四1．5
罨
。1．0
0．5
O
对照 模型
与对照组比较：’Pd0．05；与模型组比较：6Pd0．05
。P图2大鼠主动脉I／M值@一5)
Fig．2I／MValuesofrataorta(n一5)
2．2球囊损伤后血管壁NF—xBp65的变化：结果
发现，对照组主动脉未见p65阳性染色细胞；模型
组新生内膜处可见大量p65阳性细胞；给药组，新
生内膜处仅可见少量p65阳性细胞。p65阳性细胞
数及着色强度与内膜增厚有正相关关系(图3)。
为了进一步观察p65在细胞中的分布变化，将
分布提取的细胞不同区域的蛋白进行Western
blotting分析。结果显示，在正常血管细胞中p65主
要分布于胞浆中，胞核中仅有少量p65存在；内皮
剥脱诱发的新生内膜中p65在胞核中的聚集明显
增多；而给药组血管细胞核中p65虽减少但尚未恢
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·87·
对照 模型 IBE
图3大鼠主动脉血管壁NF—KBp65阳性表达
Fig．3PositiveexpressionofNF—KBp65
onvesselwallofrataorta
复至正常水平。p65在3组血管细胞浆中的量无明
显差异。结果表明，IBE具有抑制血管细胞p65表达
与核转位的效应(见图4和5)。
图4 NF—KBp65Westernblotting分析结果
Fig．4AnalysisofNF—KBp65byWesternblotting
舀2o
型
米l5
壁
∞1．0
兰
z 0．5
O
对照 模型
图5 IBE对新生血管内膜NF—KBp65表达的
抑制作用(i±s，万一5)
Fig．5InhibitionofIBEonNF—KBp65expression
ofneoendangium(；士s，辟=5)
2．3球囊损伤后血管壁AP一1的表达变化：免疫组
化及Westernblotting分析结果显示，模型组血管
的新生内膜中可见大量AP一1阳性染色的平滑肌细
胞(图6)，而且细胞中的AP一1水平比正常血管组
织明显升高(P具有较强的增殖活性。给予IBE的大鼠血管在内皮
剥脱后内膜增生受抑制的同时，AP一1阳性染色的
细胞数及单个细胞的染色强度均较模型组降低，组
织蛋白提取液中的AP一1浓度也减少(图7和8)。
结果提示，IBE通过抑制AP一1表达而减缓内膜
增生。
3讨论
PTCA作为治疗冠状动脉硬化性心脏病的有
对照 模氆 1BE
图6大鼠主动脉新生血管内膜AP一1表达
Fig．6ExpressionofAP一1inneoendangiumofratarota
图7 AP一1Westernblotting分析结果
Fig．7AnalysisofAP·1byWesternblotting
一
测
魁
米
留
二
皇
与对照组比较：’P。P图8 IBE对新生血管内膜AP一1表达的抑制作用
(；士S，弹=5)
’Fig．8InhibitionofIBEonAP一1expression
ofneoendangium(；±s，一一5)
效手段现已得到广泛的应用，但介入性治疗后3～6
个月约35％～50％的患者出现血管再狭窄，严重
限制了PTCA的远期疗效。目前认为造成PTCA
术后再狭窄的主要病理基础是，血管内膜受到刺激
后导致VSMC表型改变，从血管中膜迁移至内膜并
进一步分裂增殖，从而形成新生内膜[5]。因此如何抑
制VSMC的异常增殖，防止再狭窄的发生，就成为
心血管疾病研究的一个热点。
NF—KB作为一种多向性转录因子其结合序列
存在于多种促炎和促增殖基因的启动子和增强子
中，通过激活靶基因表达，广泛参与机体的免疫炎症
反应、细胞周期调控、细胞增殖分化与凋亡。本研究
表明血管内皮损伤可诱导血管细胞(包括单核／巨
噬细胞，平滑肌细胞等)高表达NF—KB，并且后者在
细胞核的聚集增多。有体外实验表明，用碱性成纤维
细胞生长因子(bFGF)刺激大鼠胸主动脉可以导
万方数据
·88· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
致VSMC增殖，并认为VSMC增殖的主要原因是
NF一．cB转录活性增高及与DNA结合能力增强口]。
如果转染NF—xB顺式元件诱骗双链寡核苷酸
(decoyODNs)到猪冠状动脉球囊损伤处，就可明
显抑制血管成型术后VSMC的增殖[7]。可见NF—xB
对平滑肌细胞的异常增殖起着关键性作用。
AP一1是一类能与许多基因上的AP一1位点
[佛波酯应答元件(TRE)]结合的反式作用因子，
它参与调控与增殖相关靶基因的转录活性。NF—xB
可以调节AP一1的表达，当NF—xB活性受抑制后使
c—fos基因的表达及AP一1活性均受到明显抑制，导
致AP一1依赖的血管内皮生长因子(VEGF)表达
下调，细胞增殖受限[8]。可见，NF—xB与AP一1在增
殖性疾病中具有共活化特性，两者在转录调控中可
能存在“交谈”。·
欧亚旋覆花为菊科旋覆花属植物，其性味咸、
温，具有活血化瘀、抗炎止痛之功效，是一种传统的
中草药。欧亚旋覆花的化学成分有40多种，目前认
为有药理活性的成分多为倍半萜内酯类化合物。本
研究小组利用已经申请专利的技术从欧亚旋覆花的
氯仿提取物中分离出有效单体成分——旋覆花内
酯，一种结构上属于苯并呋喃酮衍生物的物质。本研
究小组曾在体外细胞培养实验中发现，ABL通过抑
制RAW264．7巨噬细胞合成炎症介质NO、前列
腺素I。(PGI：)而发挥抗炎作用，并证明其分子机制
为ABL抑制NF—JcB的活化和两种与炎症密切相关
的酶，即诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶
(COX一2)的表达。本研究在整体水平上进一步观察
旋覆花单体有效成分的特定组合——IBE是否具有
通过抑制NF—xB的表达而发挥抗炎、抗增殖的作
用。结果发现，球囊损伤21d后大鼠主动脉处内膜
增生明显，而应用IBE后可明显减轻损伤处内膜增
生程度，可见在本实验条件下IBE发挥了抑制内膜
增生的作用。进一步的免疫组织化学染色发现，IBE
处理组的内膜增生程度显著减轻，NF—xBp65、AP一1
阳性细胞数明显减少，提示内膜增厚主要是由
VSMC增殖导致的，并且VSMC的增生程度可能
与NF—KBp65及AP一1的表达量有关。从Western
blotting结果可以看出IBE组核蛋白NF—KBp65
表达量比模型组明显减轻，而胞浆蛋白NF—IcBp65
表达量与模型组基本相同，从而在蛋白水平上证实，
IBE抑制内膜增生作用的主要原因是抑制了NF—
KBp65的激活与核转位。Westernblotting还发现，
模型组AP一1表达明显增多，给药组AP一1表达下
降，这提示内膜增生的程度与AP一1的表达量之间
可能也存在一定的关系。
本实验观察到球囊损伤后大鼠颈动脉内膜
VSMC大量增生，NF—xB、AP一1表达增强，而IBE
能明显抑制损伤处VSMC的增殖、使I／M值减少，
显著降低NF—IcB及AP一1表达。提示IBE可能是通
过抑制NF—IcB、AP一1的表达阻止VSMC的增殖。
但对于IBE抑制VSMC异常增殖的信号传导途径
如何、IBE是否也影响VSMC的迁移以及IBE对
细胞外基质代谢有何影响等诸多方面的问题还有待
做进一步的探讨，以深入阐明IBE发挥药效的分子
机制。
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髫§秘秘；芦零岔弛孓牙啦孓零牙啦潞誉啦莽鹕祭祭苕啦器秘牙啦莽笞均器笞昀零弯曲孓笞啦器甾警零茸警莽甾乳琴弛淬苔均彝零牙弛$牙啦器笞池翠牙鸳F啦彝
八荣 八耻
树立社会主义荣辱观，坚持以热爱祖国为荣、以危害祖国为耻，以服务人民为荣、以背离人民为耻，以崇尚科学为荣、以愚
昧无知为耻，以辛勤劳动为荣、以好逸恶劳为耻，以团结互助为荣、以损人利己为耻，以诚实守信为荣、以见利忘义为耻，以遵
纪守法为荣、以违法乱纪为耻，以艰苦奋斗为荣、以骄奢淫逸为耻。
万方数据
旋覆花提取物抑制血管内皮剥脱后内膜增生的实验研究
作者： 狄柯坪， 韩梅， 温进坤， DI Ke-ping， HAN Mei， WEN Jin-kun
作者单位： 河北医科大学基础医学研究所,省部共建教育部重点实验室,河北,石家庄,050017
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(1)

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