全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月·245·
细胞，它在宿主的免疫监视功能中与M①一起有着
重要的作用。NK细胞在抗肿瘤、抗病毒感染方面起
重要作用，是细胞免疫的检测指标之一[7]。CTL是
特异性细胞免疫应答的主要效应细胞，在机体抗感
染、抗肿瘤免疫及移植排斥反应和自身免疫病中发
挥重要作用。脾脏中T细胞约占有核细胞总数的
40％，其中多数为成熟的效应细胞，CTL为其重要
组成成分，对肿瘤细胞具有特异杀伤作用，从而抑制
肿瘤生长¨J。
本实验结果表明，YCP能显著抑制ICR小鼠
Lewis移植瘤的生长，但对Lewis细胞的体外增殖
无直接抑制作用，而且对裸小鼠人肺癌A一549移植
瘤的肿瘤生长无抑制作用。YCP显著提高S。。。荷瘤
小鼠RES吞噬功能；明显提高Lewis肺癌荷瘤小
鼠的NK细胞活性，促进NK细胞杀伤靶细胞
K562；明显提高CTL细胞活性，促进CTL细胞杀
伤靶细胞Lewis肺癌细胞。由此可以推测YCP可能
通过增强机体的细胞免疫功能，达到抑制肿瘤生长的
作用，YCP有望成为一种肿瘤综合治疗的新药。
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三七总苷对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质分泌及降解的影响
刘海燕，陈孝文，刘华锋，梁 东，唐德檠
(广东医学院附属医院肾脏病研究所，广东湛江524001)
摘要：目的探讨三七总苷(PNS)对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质(ECM)分泌及降解的影响，为
临床上应用PNS延缓慢性肾衰竭(CRF)的进展提供理论依据。方法无菌条件下收集40份尿毒症病人血清和
20例正常人血清，用相差显微镜、扫描电镜结合细胞角蛋白18(CK一18)免疫组化鉴定人肾小管上皮细胞株HK一
2。应用消化法检测HK一2细胞培养上清液中羟脯氨酸水平，ELISA方法检测HK一2细胞培养上清液中纤连蛋白
(FN)、金属蛋白酶一1(MMP一1)、金属蛋白酶组织抑制因子一1(TIMP一1)蛋白分泌量，RT—PCR方法检测MMP一1
和TIMP一1mRNA表达。结果10％尿毒血清组与正常对照组相比，HK～2细胞培养上清液中胶原蛋白和FN分
泌量显著增高，MMP一1／TIMP一1基因表达和蛋白分泌的比值降低，而PNS400、600、800mg／L可使尿毒血清增加
的HK一2培养上清液胶原蛋白分泌量回降；200、400、600、800mg／L可使FN分泌量回降；100、200、400、600、800
mg／L可使尿毒血清降低的MMP一1／TIMP一1基因表达和蛋白分泌的比值回升。结论在体外实验中，PNS可降低
尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞胶原蛋白及FN的分泌，升高MMP一1／TIMP一1基因表达和蛋白分泌的比值，促
进ECM降解，从而有效延缓入肾小管一间质纤维化的进展。
关键词：三七总苷；尿毒血清；肾小管上皮细胞；细胞外基质；肾小管一问质纤维化
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)02—0245一04
EffectofPanaxnotOginsenOsidesonexcr tionandegradationofextracellularmatrix
ofhumanrenaltubularepithelialcellsinducedbyuremicserum
LIUHai—yan，CHENXiao-wen，LIUHua—feng，LIANGDong，TANGDe—shen
(InstituteofNephrology，AffiliatedHospit lofGuangdongMedicalCo lege，Zhanjiang524001，China)
收穑目期：2005—05～27
基金项目：广东省科技计划项目(2003C32702)f湛江市科技攻关项目(2003)
作者简介：刘海燕(1971一)，女，吉林省蛟河县人，博士，副教授，副主任医师，研究生导师，主要从事肾小管间质纤维化及中西医防治方
面的研究，曾发表科研论文30余篇，曾获湛江市科技进步一等奖及广东省科技进步三等奖。
Tel：(0759)2387164E—mail：liuhy71@yahoo．corn．en
万方数据
·246· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月
Keywords：Panaxnotoginsenosides(PNS)；uremicerum；renalt bu arep theliacells；extracellular
matrix(ECM)；renaltubulointerstitialfibrosis
目前临床上对慢性肾衰竭(chronicrenalfail—
ure，CRF)的治疗主要集中在控制加剧肾功能恶化
的危险因素，如高血压、高血糖等。然而随着对肾纤
维化的细胞和生化机制的不断了解，许多学者认为
新的治疗措施应针对防止肾纤维化的发生。三七为
五加科多年生草本植物，其味甘、微苦，性温，有散瘀
止血、消肿止痛、补血活血、滋补强壮等功效。现代医
学研究发现，三七可调节细胞免疫功能，对机体非特
异性免疫功能和特异性体液免疫功能具有调理作
用；另外，三七是活血化瘀的经典药物，可消除系膜
增生性肾炎大鼠血液流变学浓、黏、凝、聚的特征，使
全血比黏度、聚集指数、红细胞压积等均有不同程度
降低。由此可见，三七通过扶正固本、活血化瘀而起
到抗肾纤维化的作用，较好地体现了传统中医扶正
化瘀法治疗肾纤维化的原则。三七总苷(Panaxno—
toginsenosides，PNS)是三七的主要成分，与三七
生药相比，药效更为突出。为了进一步明确PNS对
肾小管～间质纤维化的保护作用，本研究通过体外实
验的方法探讨PNS对尿毒血清诱导的人肾小管上
皮细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)分泌
及降解的影响，以期为肾纤维化的防治探索一条新
的途径。
1材料与方法
1．1血清制备：共收集40份尿毒症病人血清[肾小
球滤过率(GFR)<10mL／min，血清肌酐(SCr)
7071685弘mol／L]，无菌条件下将全部血清混匀、
灭活、抽滤分装，一20℃保存。同期收集20例正常
人血清，收集方法同上。
1．2人肾小管上皮细胞培养与鉴定：人肾小管上皮
细胞株HK一2是由上海第二医科大学附属瑞金医院
陈楠教授惠赠，细胞培养于含10％小牛血清的
REMI一1640培养液中，常规培养传代。用相差显微
镜、扫描电镜观察细胞形态结合细胞角蛋白18
(CK一18)免疫组化鉴定HK一2细胞。
1．3药物：三七总苷(PNS，质量分数大于99％)，
云南植物药厂产品。将PNS以无血清RPMI一1640
培养液稀释为100、200、400、600、800mg／L，用于
实验。
1．4 实验分组：正常对照组，10H正常人血清加
90％RPMI一1640培养液；10％尿毒血清组，10％
尿毒血清加90％RPMI-1640培养液；100～800
mg／LPNS组：10％尿毒血清加100～800mg／L
PNS再加90％RPMI一1640培养液，于37℃、5％
CO。培养箱中培养24h后收集细胞。
1．5 消化法检测HK一2细胞培养上清液中胶原蛋
白水平：严格按试剂盒说明书操作，用M550型酶标
仪在550nm处检测HK一2细胞培养上清液吸光度
(A)值，计算样品中羟脯氨酸及总胶原蛋白水平。
羟脯氨酸质量浓度(tug／mL)一等冀
总胶原浓度(／tg／mL)一羟脯氨酸质量浓度×7．46×稀
释倍数
7．46是从羟脯氨酸换算为胶原的计算常数
1．6 ELISA方法检测HK一2细胞培养上清液中纤
连蛋白(FN)、金属蛋白酶一1(MMP一1)、金属蛋白
酶组织抑制因子一1(TIMP一1)蛋白水平，严格按试
剂盒说明书操作。
1．7 RT—PCR方法检测MMP一1、TIMPI和p
actinmRNA的表达：(1)Trizol试剂一步法抽提细
胞总RNA，取4弘LRNA样品加入996弘L二乙基
焦磷酸胺(DEPC)处理的水中，混匀，752型紫外分
光光度计测定260、280nm处A值，A2。。／Az80>1．8
可用。(2)cDNA第一链的合成：应用SuperScriptTM
First—StrandSynthesisSystemforRT—PCR试剂盒
进行cDNA第一链的合成，严格按说明书方法操
作，反应总体积20肛L。(3)引物的设计与合成：引
物设计参照有关文献方法[1’2](见表1)，经基因库核
实，由上海生物工程公司合成。(4)PCR扩增反应条
件：MMP一1：94℃变性3min，94℃45S，60℃45
S，72℃1rain，扩增35个循环，72℃延伸10min。
TIMP一1：94℃变性3min，94℃45S，55．7℃45
S，72℃1min，扩增32个循环，72℃延伸10min。
p-aetin：94℃变性3min，94℃45S，55．4℃45
S，72℃1min，扩增27个循环，72℃延伸10min。
(5)PCR产物分析：取目的基因和p_actin产物各6
ttL，6×上样缓冲液2．4弘L，1．5％琼脂糖凝胶电
泳，稳压电泳5V／cm约1．5h，0．5弘g／mL溴化乙
锭(EB)染色20min。凝胶在UVP凝胶成像系统
中扫描观察结果、拍照。
1．8 统计学处理：数据以z±5表示，使用SPSS
10．0统计软件进行统计描述，多个样本均数的比较
采用单因素方差分析(One—WayANoVA)，多个样
本均数间每两个均数的比较根据方差齐性检验
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月·247·
衰1低聚核苷酸引物序列
Table1 SequencesofoIigonucIeotideprimers
目的基因碱基数 引物序列
(homogeneity—of—variance)，当总体方差齐同时选择
Bonferroni法；当方差不齐时选择Tamhane’ST2法。
2结果
2．1 人肾小管上皮细胞的鉴定：相差显微镜观察
HK一2细胞呈多边鹅卵石样，体积较大，镜下透明度
及折光性强，细胞紧密衔接，可见融合成单层。CK一
18免疫组化片可见胞核周围和胞浆内不均匀散在
分布、散度不一棕褐色颗粒状、点状染色。阴性对照
胞核紫兰色，胞浆未着色。扫描电镜可见细胞表面具
有较多的微绒毛，细胞紧密衔接，呈多极状，以上证
实培养细胞为人肾小管上皮细胞。
2．2 PNS对尿毒血清作用下的HK一2细胞培养上
清液中胶原蛋白水平和FN分泌量的影响：10％尿
毒血清组与正常对照组相比，HK一2细胞培养上清
液中胶原蛋白和FN分泌量显著增高。PNS100、
200mg／L对尿毒血清增加的胶原蛋白分泌量无显
著影响，丽400、600、800mg／L可使胶原蛋白分泌
量回降；PNS100mg／L对尿毒血清增加的FN蛋
白分泌量无显著影响，而200、400、600、800mg／L
可使FN蛋白分泌量回降，且随着PNS质量浓度的
升高而降低，见表2。
裹2 PNS对尿毒血清作用的HK一2培养上清液胶原蛋白
及FN蛋自分泌量的影响(；±s，露一6)
Table2 EffectofPNSoncollagenproteinandFN
proteinxcretionofKH一2cellstreated
byuremicserum(；±s，一一6)
与正常对照组比较：～P
’+P
及TIMP一1蛋白分泌和基因表达的影响：10％尿毒
血清组与正常对照组相比，MMP一1／TIMP一1蛋白分
泌和基因表达的比值降低，PNS100、200、400、600、
800mg／L使尿毒血清降低的MMP一1／TIMP一1蛋
白和基因表达的比值回升，结果见表3和4及图1。
表3 PNS对尿毒血清作用下的HK一2细胞MMP一1
及TIMP一1蛋白分泌■的影响(J±S，n=6)
Table3 EffectofPNSonMMP-·1andTIMP·‘1protein
secretionofHK一2cellstreatedbyuremic
serum(；士s，辟一6)
与正常对照组比较：～P
△△P
及TIMP一1基因表达的影晌(J±S，tl一6)
Table4 EffectofPNSonMMP一1andTIMP一1
geneexpressionofHK一2cellstreated
byuremicserum(jis，露一6)
与正常对照组比较：一尸<0．01
与10％尿毒血清组比较：AAp
针对肾纤维化的病理机制，临床上应用扶正化
瘀方进行抗肾纤维化的治疗取得了较好的疗效。三
七补血而不留瘀、化瘀而不伤血的功效较好的体现
了传统中医扶正化瘀法治疗肾纤维化的原则。近20
年来，国内外学者对三七进行了广泛的研究，证实了
三七具有抗脂质过氧化、改善微循环、抑制肝脏胶原
合成和促进胶原降解的作用，从而延缓或阻止肝纤
维化的进程。同时也有报道称PNS能够抑制胶原增
万方数据
·248· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月
MMPs的活性，从而抑制ECM的降解，其中以
TIMP一1尤为重要。多种实验模型研究显示，肾小
管一间质纤维化病变中，均有MMPs活性下降或
MMPs／TIMPs比例下降，提示MMPs／TIMPs参
与了肾小管一间质纤维化的形成，TIMPs高表达，和
(或)MMPs活性下降，即MMPs／TIMPs功能紊乱
参与了肾小管一间质纤维化的发生机制。本研究结果
表明尿毒症毒素可导致MMPs／TIMPs系统平衡失
调，可能通过降低MMP一1／TIMP一1蛋白和基因表
达的比值，进一步加速了肾小管一间质纤维化进程，
而PNS均可显著增加MMPs／TIMP一1比值，进一
M—M。，k。，1—10％尿毒血清组2～6—10％尿毒血清+PNs
步说明PNS可通过抑制尿毒血清诱导的人肾小管
(100、200、400、600、800mg／L)组 上皮细胞ECM的分泌，改善MMP一1／TIMP一1系
M—Marker1-lO％uremicserumgroup2 6一lO％uremic统平衡失调状态，从而延缓肾小管一间质纤维化进
serum+PNS(100，200，400，600，and800mg／L)groups 程，改善肾功能。
图1 PNS对尿毒血清作用下的HK一2细胞MMP一1 PNS价格低廉，无明显副作用，且有补血活血、
和T1MP一1基因表达的影响 滋补强壮之功效，CRF患者长期应用，还可减少失
ng·1E‘‘。。‘0fPNs。nMMP一1andT1MP一1g。n。ex一
血、贫血的发生。如果能在临床上普遍应用，对保护残
生，促进磊生胶原降解，明显促进人吾间质成纤维细 肾功能，延缓肾衰竭的进展，具有较大的现实意义。
胞凋亡Ⅲ。 篙’=G⋯。№‰。呱～M⋯⋯螂施钾
ECM在肾间质内过度沉积是引起肾小管一间质 saponi。snd。。。d。popto。i。ofhumanrenalinterstitialfibro_
纤维化的主要原因‘2~4]，而造成ECM大量沉积的 blastsanditsmechanisms[J]．ChinJNephrol(中华肾脏病
直接原因则是肾间质中ECM产生增多和分解减 r2]慧；，E{翟麓：省：：9R30le-95。．f。。b。l。epithelial。。lI。i。叫ho_
少。胶原蛋白和FN是ECM中最丰富的结构成分， g。。。。i。oftubuloint。rstiti。1fib。 ind。。。dbyglomerul。，
羟脯氨酸是胶原蛋白多肽链中特异的氨基酸成分，diseaseFJI·CurrOpinNephrolHypertens，1998，7：2495一
是影响胶原纤维形成的决定因素之一，因此测定羟 ⋯二u∑’⋯⋯ ． ⋯
脯氨酸的水平能反映胶原代谢的情况[5]。本研究结 。。giotensi。1。。dti。。。。rep。i，[J3．SemiNeph。l，1997，
果说明尿毒症毒素促进胶原和FN等间质型ECM 17：467—491·
的合成，从而在肾小管一间质纤维化进程中起重要作 E43。Ki。nane。tfoTHG,FM—porMri罴0i：,。。M。cCobr。a=点’三兰。TfhⅢee。x篡
用，而PNS可显著抑制尿毒血清诱导的人肾小管上 unilateralligatio。[J]．Kid俐Inf，1993，44：313—321．
皮细胞胶原蛋白和FN的分泌，从而减少ECM在肾[53ShimizuT，FukagawaM，KurodaT，et1．Pirfenidonepre一
间质内过度沉积，延缓肾小管一间质纤维化的进展。 舞』：篡：篓：：葛；．1羔兰j罴8。n。t。k，i，dn。e。y(si。npplra)ti
目前研究表明ECM不是静止不动的，而是处 。239_。243．
在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中。而 [6]LiYY，MeTiernanCF，FeldmanAM·Interplayofmatrix
MMP一1／TIMP一1系统在ECM的合成与降解代谢”：81÷o?”垤⋯a。sest．issue，．inhlbnorsm“黑儿0p：：teln．ases
平衡的调解中起主要作用[6~9|。MMPs表达下调和diov。R。，2000，46：214—224．
酶活性过度抑制参与了许多表现为ECM堆积的病 E73DaviesM，MartinJ，ThomasGJ，ela1．Proteinasesa d
理过程如动脉粥样硬化、多种结缔组织疾病和重要 ：粤”u1””Ⅱix¨“”“[J]·尉幽纠h“1992“：671。
脏器进行性纤维化。MMP一1是第一个被定性的主 [8]M。。。。，。I，K0tr。LP，Frid。。。R，“a1．M。trix。。t。11。p。
要间质胶原酶类，主要降解I、Ⅱ、m、Ⅶ、Ⅷ型胶原teinases：structure，evolution，anddiversificat on[J3．
及蛋白聚糖(PG)的核心蛋白。金属蛋白酶抑制物 [9]2鬟麓，1熹二。。12。：F10，7翼曼：H，甜以讹。。。inhib的，。
(TIMPs)常常由分泌金属蛋白酶的同一细胞所合 。f。。t。lloprotei。。。。。；。t。t。re，reg。1。tion。。dbiol g 。。l
成，可通过阻止MMPs酶原活化，并抑制已活化的 function[J]．EurJCellBiol，1997，74：111—122．
万方数据
三七总苷对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质分泌及
降解的影响
作者： 刘海燕， 陈孝文， 刘华锋， 梁东， 唐德燊， LIU Hai-yan， CHEN Xiao-wen， LIU
Hua-feng， LIANG Dong， TANG De-shen
作者单位： 广东医学院附属医院肾脏病研究所,广东,湛江,524001
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(2)
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