全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月·1059·
药材与资源
Applicationofm tochondrialad1 ntron2sequencestomolecular
identificationofsomespeciesofendrobiumSw．
ZHANGTin91，WANGZheng—ta01*，XULuo—shanl，ZHOUKai—ya2
(1．DepartmentofPharmacognosy，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210038，China；2．JiangsuKeyLaberatory
forBioresourceTechnology，CollegeofLifeScience，NanjingNormalUniversity，Nanjing210097，China)
Abstract：ObjectiveAppl cationofanewmolecularmarkertotheidentificationofDendrobium
(Orchidaceae)species．MethodsComplet 。sequencesfthmitochondrialad1 ntron2forninespecies
ofDendrobiumSw．wereamplifiedandetermined．ResultsS ven eenvariablesit swerefoundinthe
aligned872bpofnad1intron2sequences．EightofthenineDendrobiumspeciesexceptD．10ddigesii
couldbeidentifiedbythenad1intron2 sequences．ConclusionThemitochondrialad1 ntron2 se—
quencesouldbeusedasanewmolecularmarkerfotheidentificationofDendrobiumspecies．
Keywords：DendrobiumSw．；mitochondrialna1intron2；molecularmarker
线粒体nad1内含子2序列在石斛属植物分子鉴定中的应用
张婷1，王峥涛¨，徐珞珊1，周开亚2
(1．中国药科大学生药学研究室，江苏南京210038；2．南京师范大学生命科学学院
生物资源技术江苏省重点实验室，江苏南京 210097)
摘 要：目的 在兰科石斛属药用植物鉴定中应用新的分子标记。方法 扩增并测定9种石斛属植物线粒体中
NADH脱氢酶亚基1编码基因(nad1)内含子2(intron2)的全长序列。结果 比对后的nad1intron2序列长872
bp，其中有17个变异位点，可以鉴别除粉花石斛Dendrobiumloddigesii以外的8种植物。结论线粒体nad1in—
tron2序列可以作为一种新的分子标记用于石斛属植物的鉴定。
关键词：石斛属；线粒体nad1intron2；分子标记
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)07—1059—04
TheChinesecruderug“Shihu”iSder ved
fromthedriedorfreshstemsofDendrobium
species(Orchidaceae)．Asa precioustraditional
Chinesemedicinewithgreatdemand，substitutes
oradulterantsmadeupof“Shihu”arefoundin
marketsandusedbothclinicallyndinChinese
patentmedicinefactories．AccordingtotheCh ese
Pharmacopoeia(2000d)，onlyfivespeciesare
listedasthebotanicaloriginofqualified“Shihu”，
i．e．D．10ddigesiiRolfe，D．fimbriatumHook，
D．chrysanthumWall．exLindl，D．officinale
KimuraetMigo，andD．nobileLindl．Thespiral
orspringshapedcommoditymadeupofthestems
ofD．officinaleisknownas“TiepiFengdou”，
whilethecommoditiesmadupofthestemsofthe
收稿日期：2004—10—24
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30171144)
*通讯作者王睁涛Tel：(025)85391246
otherfourareknownas“Huangcao”．Both“Tiepi
Fengdou”and“Huangcao”aresubjecttosubsti—
tutesoradulterantsC川，whichhadbeenauthenti—
catedbasedonITSregionfnuclearribosomal
genome，respectively[2’引，matKgenesequencesof
chloroplastgenome[4]，andRAPDtechniqueC引．
MitochondrialDNA(mtDNA)variationhas
beensuccessfullyusedinthestudiesofphylogeo—
graphy，populationsubdivision，andbehaviorof
animalspecies，orhumanoriginandmigration．
YetmtDNAisrarelyappliedtophylogeneticor
populationgeneticstudiesofplants．Unliketoan —
mals，plantmtDNAshowslownucleotidesubsti—
tutionsrateandfrequentstructuralre rrange—
ments．However，therea ea fewcasesinwhich
万方数据
·1060· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月
plantmtDNAmarkershavebeenusefulinresolv-
ingphylogeneticrelationshipandmoleculargenetic
identificationofcloselyrelatedspecies．indetect—
ingphylogeogra—phicp tternsorinunravelingpop—
ulationge eticstructure[引．Inmostofthesetud—
ias。thes condintronofthemitochondrialNADH
dehydrogenasesubunit1(nad1)genehasbeen
showntobeusefulinrevealingintra——specificpoly——
morphisms[7’引．Thenad1geneisfragmentedinto
fivesingle-copycodingsegmentsthatarescattered
overatleast40kb．Thefivenad1 codingse —
mentsaredesignatednad1a～nad1einwheatmi—
tochondriao9|．RestrictionmappingandSouthern
blotanalysishavedemonstratedth nalaisat
minimumof20kbawayfromnadlb．Moreover，
atleasttwogenes，namelytp6andrps13，are
loeatedb tweenthem．Thenadlc／dandnadld／e
segmentsare timatedtobeseparatedbyatleast
7and12kb，respectively．Thenadbandnadlc
segmentsareseparatedby1422bpinwheatmito—
chondria，whichist enearestdistance．Thenad1
intron2islocatedexactlybetweennadlbandnad
1c．UPtonow，nad1intron2sequenceshavebeen
appliedtoneitherphylogeneticrelationshipstudies
nor identificationof medicinalplants．
Furthermore．nointro2sequencesofD 咒drobium
specieshavebeenreportedsofar．Thepurposef
thepresentstudyistodetectsequencevariationof
nad1intron2innineDendrobiumspecieswhich
areusedastheoriginof“Huangcao”inmarkets．
1 Materials
A11materialswerecollectedfromdifferent
placesinChina(Table1)．Duetotherestrictionin
collectingw ldDendrobiumspecies，eachspe ies
wastestedontwoplantsfromonlyonecollection，
exceptD．nobile，D．chrysanthum，andD．10ddi—
gesiiwhichwererepresentedby woifferentcol—
lections．Thevoucherspecimensw reidentifiedby
Dr．XUHongandDr．DINGXiao—yuandeposit—
edintheHerbariumofChinaPharmaceuticalUni—
versity，Nanjing，China．
10×PCRReactionbuffer，25mmol／LMgCl2，
TaqDNApolymerase(Promega)，dNTPsMix
(Sangon)，primers(synthesizedbyShanghai
BoyaBioengineering)，DNAPurificationKit
(ShanghaiWatsonBioengineering)；PTC一200
Thermocycler(MJResearch)，ABIPrism310Ge—
neticAnalyzer．
Table1 TaxaincludedinthisstudyandGenBankccessionnumbersofnad1intron2sequences
2 Methods
TotalgenomicDNAwasextractedfromfresh
leafandstembyaprotocolmodifiedfromRogers’
method．Amplificationo nad1intron2 wascar—
riedoutin3O弘Lreactionv lumescontaining3pL
10×PCRreactionbuffer，1．8gL25mmol／L
MgCl2，2弘L2 mmol／LdNTPsMix，1．0unitof
TaqDNApolymerase，1pL10 timol／Lforward
andreverseprimersandapproximately70一80ng
oftotalDNA．Theprimersusedforamplification
ofnad1intron2werelocatedinnadlbandnadlc
respectively，whichareP一1forwardp imer(57一
GCATTACGATCTGCAGCTCA一37)andP一2
reverseprimer(57一GGAGCTCGATTAGTT
TCTGC一3‘)[10]．Theprofileforthecyclesof
amplificationw s：ani itial4minat94℃fol—
lowedby30seeat94℃fordenaturation，45secat
54—57℃forprimerannealingand1minat72℃
forprimerextension，repeatedfor30cycles，anda
finalextensionof8 minat72℃．PCRreaction
wascarriedoutbyaPTC一200Thermocycler．PCR
productswerepurifiedbymeansofDNAPurifica—
tionKit．DNAproductsandthepurifiedproducts
weredetectedbyethidiumbromidestainingu der
UVafterelectrophoresisin1．O％agarosegel．
Accordingtothemanufacturer’sinstruction。the
purifiedPCRproductsweresequencedwiththe
BigDyet rminatormixonanABIPrism31O
GeneticAnalyzer．Forwardandeverseprimers
wereusedtosequenceallsamples．Theboundaries
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月·1061·
ofnad1 intron2weredeterminedbycomparison(theinter—specificvariationrangesfrom0．726％to
withthecorrespondingsequenceofTriticumaes一0．234％)，therearesomvariablesiteswhich
tivumL．(Gramineae)retrievedf omtheGenBankcouldbeusedasmolecularch actersoidentify
(AccessionX57967)．Thesequ nceswerealignedmostofthespeciesexceptD．10ddigesii．
usingClustalXandanalyzedusingtheprogram
MEGA．
3 Resultsandiscussion
Thecompletemitochondrialad1 intron2
fromnineDendrobiumspecieswasamplifiedand
sequenced．Thesequencesofnad1intron2range
insizefrom826to862bpwhiletheG+Ccontent
rangefrom56．0％to56．7％．Ther sultof M一2000DNAMarker1-D．t￡，illiam∞nii2-D．aphyll“m
agarosegelelectrophoresisisshownnFig．1．Sev一 3-D．noMle4-D．chrysanthum5-D·frepidatum
enteenvariablesiteswerefoundinthealigned
6-D·loddigesii7-D·thyrsiflorum8-D·crystallinum
872bpsequences(Fig．2)·Thedivergenca d 9。n篙XlinAgaggmroseelelectrophoresisofPCR
numbersofsubstitutionsbetweenthesequencesin
6
a三：Iifiedproducts：fmitochondrial
pairwisecomparisonsareshowni Table2· nad1intron2sequencesfromnine
Althoughthenad1intron2ishighlyconserved speciesofDendrobiumSw．
Table2 Numbersofsubstitutions(10wertriangle)andpercentofsequencedivergence(uppertriangle)formitochondrial
nad1intron2ofninespeciesinDendrobiumSw．withgapsdeletedineachpairwisecomparisonof equences
(Distancemethod：nucleotidenumberof ifferencesa dP—distance；pairwisedelet on)
D．williamsoniiD．aphyllumD．nobileD．chrysanthumD．crepidatumD．10ddigesiiD．thyrsiflorumD．crystallinumD．pH ulinum
D．aphyllum5——0．7010．704 0．726 0．467 0．587 0．584 0．467
D．chrysanthum5 6 4 —0．3630．469 0．590 0．587 0．469
D．crepidatum5 6 4 3——0．2420．608 0．605 0．484
D．10ddigesii3 4 4 4 2 —0·352 0-350 0·234
D．thyrsiflorum4 5 5 5 5 3——0．4690-352
竺：竺：!=兰!：兰竺竺 ! ! ! ! ! ! ! !
11 2Z 233 346 6 666 777
46 455 39 941 2 358 368
279 01 728 18
D．williamsoniiTCGTAGAACC
D．aphyllum
D．?tobile
D．chrysanthum
D．crepidatum
D．10ddigesii
D．thyrsiflorum
D．crystallinum
D．primulinum
．．．．．．G．T．
⋯．C．G．．T
．G．．C．GC．．
C一．．C．G．．．
．．．．．．G．．．
．．TG．．G．．．
．．．．．TG．．．
．．．．．．G．．．
9839 669
AACGCCC
CG．．A．．
．GT．．．．
．G．．．．．
．G．．．T．
．G．．．T．
．G．．．．．
．G．．．．T
．G．C．．．
Adotindicatesid ntity，adashindicatesdeletion，and
asterisksndicateparsimony—informativesites．
Fig．2Variablesitesofmitochondrialhad1 intron2
sequencesfromninespeciesofDendrobiumSw·
(Taxan mesareshownontheleft)
Authenticvariablesit shasnotbeenfoundin
thenad1intron2sequenceofD．10ddigesii．The
pointmutationG·A(position392，638)isrecog—
nizedasthemolecularmarkerfoD．williamsonii．
D．aphyllumhasanauthenticvariablesitatposi—
tion441(TsubstitutedforC)andtwoatposition
629(CsubstitutedforA)and736(Asubstituted
forC)．Theauthenticvariablesitfortheothersix
speciesaredemonstratedinTable3．Therefore，
Table3 Molecularch actersofmitochondrialad1in—
tron2sequencesforidentificationofninespecies
ofDendrobiumSw．exceptD．10ddigesii
D．williamsonii
D．aphyllum
D．nobile
D．chrysanthum
D．crepidatum
D．t yrsiflorum
D．crystallinum
392
638
441
629
736
618
653
167
398
142
167
249
250
337
789
G
G
C
A
C
C
C
Cor—
A
T
CorG
G
T
G
C
A
A
T
C
A
T
T
G
C
C—T
G
T
T
万方数据
·1062· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第7期2005年7月
suchmarkers(SNPs)canbefoundinthemito—
chondrialnad1intron2 sequencesandu edasa
newmolecularmarkerfotheidentificationof上Ⅺn—
drobiumspecies．
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利用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯的研究
葛正龙1，周鹤峰2，邵敏1
(1，遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563003；2．遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041)
摘要：目的研究野生天麻总DNA对马铃薯的转化，分析马铃薯转化植株中野生天麻的药用成分天麻素。方法
采用浸苗法将野生天麻总DNA导人马铃薯试管苗，通过紫外扫描法、PCR扩增筛选转化植株，对转化植株进行
SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)蛋白分析，通过TLC法检测天麻素。结果(1)在200株转化的马铃薯中
有21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异，且在220nm有明显吸收峰。(2)5’株经PCR扩增出野生天麻抗
真菌蛋白(GAFP)基因。(3)转基因马铃薯与正常马铃薯的蛋白表达有明显差异，并且在转基因马铃薯中有一条与
GAFP相同的条带。而正常马铃薯中无此条带。(4)通过薄层色谱法检测出3株转基因马铃薯表达野生天麻的有效
药用成分天麻素。结论 采用浸苗法进行外源总DNA导入是可行的。
关键词：野生天麻；马铃薯；浸苗法；天麻素
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)07—1062—04
AgeneticransformationstudyofintroducingwildGastrodiaelataDNA
intoSolanumt berosumbysoakingseedlingmethod
GEZheng—lon91，ZHOUHe—fen92，SHAOMinl
(1．DepartmentofBiochemistry，ZunyiMedicalCo lege，Zunyi563003，China；2．DepartmentofBioengineering，
ZhuhaiArea，ZunyiMed calCo lege，Zhuhai519041，China)
Abstract：ObjectiveUsinghesoakingseedlingmethodt introducewildGastrodiadatDNAinto
potatoplantletsandanalyzegastrodinftransformedSolanumt berosum．MethodsAfterthetuber
grownup，thesolutionofgastrodinwasextractedfromthepotatoeswhichweretransformedbywildG．
elataDNA．Thetransformedplantswerescanedbyultraviolet．PCRwasusedtoanalyzeGAFPgeneby
SDS—PAGE．TLCwasusedtoanalyzethgastrodinftransformedS．tuberosum．Results(1)The21
收稿日期：2004—1I-16
基金项目：贵州省省长基金和贵州省科技厅社发基金(2001112)
作者简介：葛正龙(1962一)，男(布衣族)，贵州修文人，副教授，硕士生导师，1985年毕业于遵义医学院临床医学专业，1988--1991年在
北京医科大学生物化学与分子生物学系攻读研究生，并获医学硕士学位，1999--2000年在英国Darham大学做访问学者，研
究方向为药用植物分子生物学。Tel：(0852)8204473Fax：(0852)8204792E—mail：zlongge@hotmail．corn
万方数据
线粒体nad 1内含子2序列在石斛属植物分子鉴定中的应用
作者： 张婷， 王峥涛， 徐珞珊， 周开亚， ZHANG Ting， WANG Zheng-tao， XU Luo-shan，
ZHOU Kai-ya
作者单位： 张婷,王峥涛,徐珞珊,ZHANG Ting,WANG Zheng-tao,XU Luo-shan(中国药科大学,生药学研究
室,江苏,南京,210038)， 周开亚,ZHOU Kai-ya(南京师范大学生命科学学院,生物资源技术
江苏省重点实验室,江苏 南京 210097)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(7)
被引用次数： 11次
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