全 文 ：中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月·1203·
47一甲醚一黄芩素诱导绒毛膜癌JAR细胞凋亡的实验研究
杨最素1’2，罗 莉1，朱利群1，仇黎丽1，徐昌芬r
(1．南京医科大学组胚教研室，江苏南京210029；2．浙江海洋学院医学院，浙江舟山316004)
摘要：目的探讨47一甲醚～黄芩素(4一MS)对人绒毛膜癌JAR细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡的相关机制。方
法应用MTT法、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞术和实时定量PCR法，体外观察4-MS对JAR缨胞的影响。
结果不同质量浓度(10、20、40mg／L)的4-MS对JAR细胞均有增殖抑制作用，呈剂量依赖，作用72h后其增
殖抑制率分别为(14．14±0．75)0A、(34．34±2．99)％、(61．11±2．99)％(尸<0．01)；4-MS作用72h后细胞内
Ca”浓度分别为81．3±6．7、103．3±5．9、120．7±11．0，与对照组相比差异有显著性(P用12、24、36h后其早期凋亡率分别为(2．36±0．19)％、(4．22士2．44)％、(7．34±0．56)％，明显高于对照组(P<
0．01)。20、40mg／L4-MS作用48h后hTERTm NA的表达量为0．05±0．01和0．02±0．01，明显低于对照组
(PhTERTmRNA的表达有关。
关键词：4’一甲醚一黄芩素(4一MS)；JAR细胞；早期凋亡；细胞内Ca件浓度；人端粒酶逆转录酶(hTERT)
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)08—1203—04
Inductionof47一methylether—scuteilareinonapoptosisfhuman
choriocarcinomaJARcell
YANGZui—sul～，LUOLil，ZHULi—qunl，QIULi—lil，XUChang—fenl
(1．DepartmentofHis ologyandEmbryology，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China；
2．MedicalCollege，ZhejiangOceUniversity，Zhoushan316004，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheinhibitionandthemechanismofapoptosisinducementtothe
cellproliferationby47一methylether—scuteltarein(4一MS)onhumanchoriocarcinomaJAReell1ine．
MethodsThetechniquesofMTTassay，flowcytometry，laserscanningconfocalmicroscopy(LSCM)，
andreal—timequantitativePCRwereusedtostudytheffectof4一MSonJARcellsinvitro．Results4-MS
hadoes—andtime—dependenti hibitoryeffectsonproliferationofJARcells．AfterthJARcellswere
treatedby4一MSindifferentconcentrations(10，20，and40mg／L)for72h，theinhibitoryrateswere
(14．14±0．75)％，(34．34±2．99)％，and(61．11±2．99)％(P<0．01)，andtheintracellularCaz+
concentrationswere81．3±6．7，103．3±5．9，and120．7士11．0，withthesignificantdifferencecompared
tothecontrolgroup(P<0．05)，respectively．AftertheJARc llsweretreatedby4一MS(40mg／L)for
12，24，and36h，theearlyapoptosisrateswere(2。36±0．19)％，(4。22±2．44)％，and(7。34±0．56)％，
muchhigherthanthatinthecontrolgroup(P<0．01)，respectively．AftertheJARc llsweretreatedby
4一MS(20and40mg／L)for48h，theexpressionsofhTERTmRNAwere0．05±0．01and0．02土0．01。
muchlowerthanthatinthecontr01group(P<0．01)．ConclusionTheproliferationc nbei hibitedand
theapoptosisfhumanchoriocarcinomaJARcelllinecanbeinducedbv4～MS．Itsmechanismisrelatedo
theiffcreaseofintracellularCa2上concentrationandthedecreaseofhTERTmRNAexpression．
Keywords：47一methylether—scutellarein(4-MS)；JARcelline；earlypoptosis；intracellularC 2+
concentration；humantelomer sereversetranscriptase(hTERT)
绒毛膜癌为滋养细胞恶性肿瘤，其破坏性强，转
移发生早，对妇女的健康及生命危害极大。为寻找低
毒、有效的抗绒毛膜癌药物，本研究室对马鞭草
VerbenaofficinalisL．抗绒毛膜癌JAR细胞进行
了系统的研究。前期的实验表明，一定浓度的马鞭草
醇提取液对JAR细胞具有明显的抑制作用，并呈剂
量依赖及时间依赖‘¨。醇提取液中有效部位为氯仿
萃取物，命名为C部位，能抑制JAR细胞增殖，并
收稿日期：2006—12—01
基金项目：江苏省自然科学基金资助项目(BK2003104)
作者简介：杨最素(1967一)，女，浙江定海人，在职研究生，讲师，主要从事肿瘤分子生物学研究。
Tel：(0580)8285660Fax：(0580)2554781E—mail：yzs@zjou．edu．ca
*通讯作者徐昌芬Tel：(025)86862904E—mail：cfxu@njmu．edu．ca
万方数据
·1204· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月
促进细胞凋亡[2。]。47一甲醚一黄芩素(47-methyl
ether—scutellarein，4-MS)为马鞭草C部位中提取
出的单体。为探讨4-MS对JAR细胞的作用，本研
究采用MTT法、激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)、
流式细胞术和实时定量PCR法，体外观察4-MS对
JAR细胞的增殖抑制作用、诱导凋亡及细胞内Ca2+
浓度和人端粒酶逆转录酶(humantelomerase
reversetranscriptase，hTERT)tuRNA表达的变
化，为抗绒毛膜癌中药的开发提供参考。
1材料
1．1 细胞来源、药物与试剂：人绒毛膜癌JAR细胞
株，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。
RPMI一1640培养液(Gibcol公司)加20％灭活的
小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，内含青霉素
100U／mL、链霉素100U／mL。MTT为美国Fluka
公司产品。AnnexinV—FITC／PI双染试剂盒(Bio
VisionI c，美国)，荧光探针Flou一3／AM
(Molecularprobes，美国)。Trizol试剂(Invitrogen
LifeTechnologies)，cDNA合成试剂盒和定量
PCR试剂盒(SybrGreenPCRKit)均为美国
Promega公司产品。PCR引物由上海生物工程公司
合成，内参13-actin引物序列为：上游5L
CCTGTACGCCAACACAGTGC一37， 下 游 5‘一
ATACTCCTGCTTGCTGATCC一37，扩增片段为
211bp。hTERTm NA引物序列为：上游57一
CAGATTCGCCATTGTTCACCC一37； 下游 57一
TTTACTCCCACAGCACCTCCC一37，扩增片段为
198bp。47一甲醚一黄芩素(4一MS)由江苏省中医药研
究院提取，其质量分数为99％。
1．2 实验仪器：HERAcell150CO。培养箱(德国
Heraeus公司)，倒置相差显微镜(Olympus)，
SunRise酶标仪(奥地利)，激光共聚焦扫描显微镜
(LSCM，LSM150，德国Zeiss公司)，FACS
Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，Rotor—Gene
3000RealtimePCR仪(澳大利亚Corbett
Research公司)。
2方法
2．1 细胞培养：JAR细胞置于RPMI一1640培养液
中，37。C、5％CO。饱和湿度恒温培养箱中培养，细
胞呈单层贴壁生长，0．25％胰蛋白酶消化，每2～3
天传代1次，实验时选用对数生长期细胞。
2．2 细胞形态观察：6孔培养板内放入盖玻片，
JAR细胞以1×105／mL接种，24h后换液，设对照
组及加药组，在倒置显微镜下观察细胞形态的变化
并拍照。实验结束弃培养液，用95％乙醇固定lo
min，常规HE染色，最后取盖玻片用中性树胶反面
封于载玻片上，光学显微镜下观察形态并拍照。
2．3 MTT法：JAR细胞以1×104／mL接种至96
孔板，每孔100肛L，培养24h后吸弃上清液。设对
照组及10、20、40mg／L4一MS加药组，每组设3个
复孔，分24、48、72h共3个培养时间段。培养结束
时弃上清，加入1mg／mLMTT100弘L，继续培养4
h，吸弃MTT，加入0．04mol／L盐酸一异丙醇100
弘L，混匀，酶标仪570nm波长测定各孔吸光度(A)
值，重复实验3次。计算4-MS对JAR细胞的增殖
抑制指数(IR)。
IR一(对照组A值一加药组A值)／对照组A值×100％
2．4流式细胞仪检测早期凋亡：JAR细胞以1x
106／mL接种于25mL培养瓶中，24h后换液。设对
照组和加药组，药物质量浓度为20、40mg／L，培养
时问为12、24、36h。检测方法按试剂盒说明书进行
操作，即培养结束时0．25％胰蛋白酶消化样品细
胞，PBS洗涤并悬浮细胞，1300r／min离心5rain，
去上清后加试剂盒专用缓冲液300肛L振荡为细胞
悬液，加入5弘LAnnexinV—FITC混匀，5肛LPI振
荡混匀，暗室室温下孵育5min，上机分析。流式细
胞仪激发光波长为488nm，每份标本收集1×105
个细胞。
2．5 LSCM测定细胞内Ca2+浓度：6孔培养板内
放入盖玻片，接种1×105／mL细胞，培养24h后换
液，培养时间与药物质量浓度同MTT法。操作方法
按试剂盒说明书，即取出盖玻片，PBS液洗2次，去
除残留的营养液；加入荧光染料Flou一3／AM以含
钙PBS液调整浓度为1pmol／L，37℃温箱中孵育
30min；用PBS液洗1～2次，洗去多余的染料。取
盖玻片在LSCM下观察，激发波长为488nm，在40
倍物镜下取任意4个视野，根据荧光强度来反映细
胞内Ca2+的浓度。
2．6 hTERTmRNA的检测：JAR细胞接种24h
后，分对照组和20、40mg／L加药组，继续培养48
h，分三步操作进行。按Trizol操作说明书提取总
RNA，经分光光度计及电泳检测RNA的量、纯度
与完整性。使用样品的RNA进行cDNA合成：配
制退火混合物和RT反应液，加10弘LRT反应液
到10肚L退火混合物中，37℃水浴60min，加热到
95℃维持5min，得到的RT终溶液即为cDNA溶
液，置冰浴待用。最后以cDNA进行实时定量PCR：
绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板，选择一个确
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月
定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应，45个
PCR循环(94℃、20S；退火温度72℃、30S)；
72℃延伸5min。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶
电泳确定为单一特异性扩增条带后进行10倍梯度
稀释，然后进行RealtimePCR反应，将梯度稀释的
cDNA模板以及所有cDNA样品分别配制Real
timePCR反应体系，于RealtimePCR仪上进行
PCR反应。反应条件为B—actin：94℃、5min；35个
PCR循环(94℃、20S；58℃、20S；72℃、20S；
87℃收集荧光10s)。hTERT：94℃、5min；35个
PCR循环(94℃、20S；58℃、20S；72℃、20S；
86℃收集荧光10S)。最后根据绘制的梯度稀释
DNA标准曲线，样品目的基因(hTERTmRNA)
和管家基因(1B—aetin)的浓度结果直接由机器生成。
每个样品的目的基因浓度与其管家基因的浓度比
2．7统计学处理：所有数据均采用SPSS11．5for
Windows统计软件进行单因素方差分析。计量数据
以；±s表示。
3 结果
3．1 JAR细胞形态学改变：倒置显微镜下观察
JAR细胞呈多边形，排列紧密，边界清楚，饱满。加
入药物后，细胞体积缩小，胞体变圆，细胞周围有数
个小突起，细胞间隙模糊，生长缓慢，细胞贴壁能力
下降，部分细胞漂浮于培养液中。HE染色观察，细
胞形态基本一致，呈多边形，细胞核大小不一，呈圆
形或卵圆形，核浆比例高；用药后细胞形态不规则，
异形性明显，部分细胞质出现大小数目不等的空泡，
细胞轮廓模糊，巨核细胞增多，染色质凝聚，核固缩。
3．2 MTT法：JAR细胞经4一MS作用后，呈现出
增殖的抑制现象，且随药物质量浓度的增加和作用
值，即为此样品此基因的校正后的相对水平。 时间的延长，IR明显上升。结果见表1。
表1 4-MS对JAR细胞增殖的抑制作用(i±s，席一9)
Table1 Inhibitionof4-MSonproliferationofJARcells(x±s，n一9)
与对照组比较：一P+。P3．3 流式细胞术检测结果：AnnexinV—FITC／PI
双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死和
凋亡细胞等区分开。从表2可以看出随着作用时间
和药物剂量的增加，早期凋亡细胞明显增加，差异非
常显著(P<0．01)。
表2 4-MS对JAR细胞早期凋亡率的影响(；±S，n一3)
Table2 Effectof4-MSonearlyapoptosisrate
ofJARcells(j±s，n一3)
与对照组比较：～P‘‘P<0．01口scontrolgroup：△△P<0．01US12hinsame
group 廿
3．4 细胞内Ca2．浓度变化：Fluo一3／AM荧光指示
剂能与Ca2．结合，它的荧光强度代表Ca抖浓度。经
LSCM检测显示，经不同质量浓度的4-MS作用后，
细胞内Ca2+浓度增加，呈剂量依赖性，与对照组比
较差异显著。结果见表3。
表3 4-MS对JAR细胞内ca2+浓度的影响(；±s，n一3)
Table3 Effectof4一MSonconcentration0fintracelIular
Ca2+inJARcells(；±s，n一3)
与对照组比较：。P<0。05；与同组24h比较：oP<0t05
。P3．5 hTERTmRNA的表达：实时定量PCR通过
在PCR反应体系中加入荧光基团SybrGreenI，利
用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通
过标准曲线对未知模板进行相对定量。4-MS作用
JAR细胞的hTERTmRNA相对水平见表4，作用
时间越长，剂量越大，hTERTmRNA相对水平越
少，差异具有显著性(P<0．01)。
4讨论
绒毛膜癌是一种对化疗药物敏感的实体肿瘤，
但化疗药物的不良反应和多药耐药的产生常导致治
万方数据
·1206· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月
表4 4-MS作用JAR纲胞后hTERTmRNA表达
(j±s，甩一3)
Table4 ExpressionofhTERTmRNAinJARcells
aftert eatedby4-MS(；±s，疗一3)
与对照组比较：一P’‘P疗的失败n]。马鞭草系马鞭草科马鞭草属植物，马鞭
草有效C部位能抑制JAR细胞增殖，阻滞细胞在
G：／M期，诱导凋亡，其机制可能与Fasl的表达下
调，Bax表达水平增加和Bcl一2表达水平下降有
关[2’3]。本研究室从有效C部位中提取出了单体化合
物4-MS，该单体在黄酮类化合物中尚未见报道。应
用MTT法表明该单体对JAR细胞具有明显的增殖
抑制作用，并与药物质量浓度有剂量效应关系。
AnnexinV—F1TC／PI流式细胞仪法是目前检
测细胞凋亡和区分坏死细胞特异性较好的方法。正
常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl
serine，PS)定位于细胞膜的内侧，在细胞凋亡的早
期，由于细胞膜失去极性，PS从胞膜内侧暴露于胞
膜外，可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)
的连接素V(AnnexinV)而呈AnnexinV—
FITC+／PI一。PS的外翻是细胞凋亡早期的一个重要
标志，也是细胞早期凋亡不可逆的特征，早于染色体
凝聚和DNA断裂的发生[s]。继发性坏死或凋亡晚
期细胞要同时结合AnnexinV—FITC和PI而呈双
阳性(AnnexinV—FITC+／PI+)。从本实验中可以看
出，JAR细胞经4-MS作用12h后出现少量的早期
凋亡细胞，但随着作用时间和药物质量浓度的增加，
凋亡细胞逐渐增加，由此说明4-MS抑制JAR细胞
增殖，其机制与诱导JAR细胞凋亡有关。
诱导细胞凋亡的细胞外刺激必须通过细胞信号
的传递才能发挥作用，信号传导通路已成为抗肿瘤
药物研究的新热点。Ca2+作为信号传导过程中重要
的信号分子，是各条信号传导途径的枢纽，病理状态
下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细
胞坏死或凋亡[6’7]。正常状态下细胞内游离钙的量很
低，主要存在于细胞外。细胞内Ca抖浓度增高可激
活内源性内切酶，导致DNA在核小体间降解，从而
阻断细胞生长周期的运行及促进细胞凋亡。本实验
将4-MS作用于JAR细胞，引起细胞内Ca2+浓度
上升，同时细胞的生长受到抑制，并出现凋亡，提示
4-MS通过升高细胞内Ca2+浓度引起细胞凋亡。对
于Ca2+浓度升高后引起的具体信号传导途径的改
变有待于进一步的研究。
近来的研究表明，端粒酶的激活与肿瘤的发生
密切相关，端粒酶是恶性肿瘤诊断的标志物和治疗
的新靶点Es]。人类端粒酶主要由3部分组成，包括人
端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和人端粒酶逆转录
酶(hTERT)。在端粒酶活性调节机制中，hTERT
是活性的限速步骤和决定因素[9]。众多的实验研究
都证实中药可抑制肿瘤端粒酶活性而发挥抗肿瘤作
用[10’11]。通过实时定量PCR检测，发现对照组
hTERTmRNA的相对水平明显高于加药组，作用
时间越长，剂量越大，下降越明显，进一步说明4一
MS通过抑制hTERT的表达进而降低端粒酶活性
而诱导JAR细胞的凋亡。
综上所述，4-MS可抑制人绒毛膜癌JAR细胞
的增殖，随着作用时间的延长、药物剂量的增加，IR
和早期凋亡细胞逐渐增加，其机制与提高细胞内
ca2+浓度和降低hTERTmRNA的表达有关。
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万方数据
4-甲醚-黄芩素诱导绒毛膜癌JAR细胞凋亡的实验研究
作者： 杨最素， 罗莉， 朱利群， 仇黎丽， 徐昌芬， YANG Zui-su， LUO Li， ZHU Li-qun，
QIU Li-li， XU Chang-fen
作者单位： 杨最素,YANG Zui-su(南京医科大学,组胚教研室,江苏,南京,210029;浙江海洋学院医学院
,浙江,舟山,316004)， 罗莉,朱利群,仇黎丽,徐昌芬,LUO Li,ZHU Li-qun,QIU Li-li,XU
Chang-fen(南京医科大学,组胚教研室,江苏,南京,210029)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(8)
被引用次数： 3次

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引证文献(3条)
1.杨最素.冯播.徐昌芬 4’-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌JAR细胞c-myc表达的影响[期刊论文]-中药新药与临床药理
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2.冯播.徐昌芬 马鞭草C部位单体4′-甲醚-黄芩素对人绒毛膜癌细胞增殖的抑制作用[期刊论文]-中国肿瘤生物治
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3.韩永禄.郁迪.杨最素 马鞭草抗肿瘤作用研究进展[期刊论文]-中国民族民间医药 2011(11)

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