全 文 ：·1656· 中草菊c帖Ⅱ馏eTraditionalandHerl衄lDrags第38卷第11期2007年11月
(C一4)，128．1(C一5)，67．0(C一6)，65．8(c一7)。以上数
据与文献报道01基本一致。
4讨论
色谱分离方法的选择：紫玉盘醇和大花紫玉盘
醇G为一对同分异构体，仅C一6的绝对构型不同，
极性十分相近，普通方法很难将它们分离开。由于紫
玉盘醇和大花紫玉盘醇G的极性较小，适合用正相
HPLC分离．但正相色谱试剂要求较高，价格昂贵，
故采用反相HPLC分离制备单体，正相HPLC鉴定
质量分数。
制备条件的选择：紫玉盘醇和大花紫玉盘醇G
的极性小，性质相近，实验起初采用ODS柱，甲醇一
水(75l 25)为流动相，流量2mL／min，120rain出
峰，未分离开。根据它们的性质，考虑改用苯基柱分
离制备单体，经摸索采用甲醇一水(70t 30)为流动
相，可将它们基本分开，时间虽J然稍长，但每次制备
量较大，基本达到半制备目的。
致谢：感谢贵州省林业研究所邓朝义研究员采集植
物材料，军事医学科学院陈舍兵和薛燕等同志代洲
NMR和MS谱。
References；
E1]L_e100eufM．CaveA。BheumikPK．etd．Thephytochem-
istryofthe&rtllonaceae[J]．Phytochonistry，1982t21(12)l
2783—2813．
[2]NkunyaMHH，WeenenH．KoylNJ，“d-Cyclohexene
epoxides．(+)一pandoxide，(+)一B．senepoxideand(一)一
pipoxide，fromUvariapandenm[J]．Phytochemlstr，，1987，
26(g)：2563—2565．
[3]LiuA．XuLZ，ZouZM·矗“．Thephytochemistryofthe
u抛mgenus[J]ForeignMed5一ITraditChinMed(国外
医学：中医中药分册)，2001，23(4)l195—204．
[4]LiaoYH，XuLz，YangsL，eta／．Threecyclohexene
oxidesfromU口ariagrandiflora[J]．Phymchemistry，1997．
45(4)f729—732．
[53XuQM，XuLZ，YangSL．Newpo|yoxygenatedcyclohex—
enesfromUzⅢ，i4kwtichow棚sisandtheirantitumoractivities
[盯．ChemPhmBull．2005t53(7)}826·829．
象皮与拟替代品黄牛皮、水牛皮中蛋白的研究
李蓥1，李秀兰3，张燕玲1。石森2，王昊1，李惠芬”
(1．天津医科大学，天津300070；2．天津市天津医院。天津300210；3．天津市安定医院，天津300052)
象皮屑象科动物亚洲象Elephasm acimusLin-
naeus．的皮，具有止血敛疮、祛腐生肌作用。其主要
成分为蛋白质、氨基酸及微量元素“]。以象皮为君药
的生肌象皮膏可以促进表皮细胞的增生、分化，对巨
噬细胞膜Fc及C。b受体有明显的增强作用，还可以
使伤口的pH值变化过程加快，促进伤口愈合o]。但
是《中华人民共和国野生动物保护法》已将大象列为
国家一级保护动物。为寻找替代品，本实验选择与象
皮具有相似药效作用的黄牛皮和水牛皮作为比较对
象，将3种样品提取液中蛋白质的量及组成进行对
比分析。
1仪器与材料
日本日立U一3310分光光度计，DYY—I型电
泳仪(北京六一仪器厂)。
象皮由天津医院骨研所组织工程室李秀兰研究
员提供，经天津医科大学药学院周晔副教授鉴定。黄
牛皮、水牛皮采自河北省承德市郊区，属于壮年期4
岁的牛，该年龄的牛其后背皮中的蛋白质的量较高，
宰杀放血直至放尽后取该部位的皮。对照品人胎盘
血蛋白由天津医科大学检验系生化教研室张燕玲教
授提供。丙烯酰胺(Act，电泳级)、甲叉丙烯酰胺
(Bis)、葡聚糖凝胶树脂(中国医药集团上海化学试
剂公司)，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1双缩脲法口“3测定蛋白质
2．1．1供试品溶液的提取[．．5]：精密称取象皮、黄牛
皮、水牛皮粉末各1g，加聚山梨酯80与少许石英砂
于研钵中冰浴研磨10min，加0．01tool／LTris—HCI
缓冲液300mL，于冰浴条件下超声混匀2h，0～4
℃冰箱中放置过夜使之充分溶胀。次日冰浴超声提
取6h后，4000r／min离心15min，转移上清液，下
层沉淀加缓冲液300mL，重复操作4次，弃去沉淀，
合并上清液，加固体(NH。)。SO．至100％饱和度，
4000r／min离心15rain，沉淀以Tris—Hcl缓冲液
溶解定容50mL量瓶，得初提液，0～4℃冰箱中短
期保存。
警銎是首：笑鼙等1畜；科学基金蕈点资助项目(。338。2911)
*通讯作者李亳芬Tell(022)23529243E—maillihuiien@tijmu．edu．c11
万方数据
中革嚆 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第30卷第1I期2007年11月
2．1．2供试品溶液的透析[6’7]：量取初提液各4mL
于透析袋中，置Trls—HCl缓冲液中纯化，每30rain
换1次透析液，以萘试剂颜色反应检识透析液，直至
无颜色反应。已透析好的溶液在O～4℃冰箱中短期
保存。
2．1．3对照品溶液的制备：精密称取人胎盘血蛋白
18mg，用Tris—HCI缓冲溶液溶解定容于5mL量
瓶，O～4℃冰箱中短期保存。
2．1．4回收率试验：精密移取象皮、黄牛皮、水牛皮
提取液各4mL，分别加人人胎盘血蛋白14．4mg，
制备供试品溶液，平行制备6份，测定，结果平均回
收率分别为101．儿％、99．84％、100．83％。
2．1．5样品测定：采用2005年版《中国药典》附录
双缩脲法测定蛋白质。制备象皮、黄牛皮、水牛皮供
试品溶液，每批各6份。分别精密量取供试品溶液与
对照品溶液各4mL置玻璃试管中，分别加入双缩
脲试剂3mL，混匀，置37℃水浴中30min，照紫外一
可见分光光度法，在波长540nm处测定吸光度。另
精密量取Tric—HCL缓冲溶液4mL，同法操作，作
为空白对照。测定样品的吸光度值，计算其质量分
数，结果见表1。
寰1蠹皮、水牛皮和黄牛皮中蛋白质的测定结果(n一6)
Table1 DeterminationofproteinInCoriumElcphantls
CoriumBubati．andCoriumBos(n=6)
2．2聚丙烯酰胺凝胶电泳法o“分析
2．2．1胶板制备：取一定量琼脂粉溶于蒸馏水中，
加热使其黏稠，均匀涂在电泳专用玻璃板周边，使其
成袋状，冷却备用。将配制好的分离胶与浓缩胶胶液
于冰箱中冷却，待其较黏稠时置于袋状玻璃板中，并
在瑗璃板上方插入梳子，夹紧，冷却．备用。
2．2．2样品上样：将聚合好的胶板放入电泳槽中夹
紧，上，下槽分别加人适量电泳缓冲液，小心拔去梳
子，将蔗糖与溴酚蓝混合液分别加入对照品溶液和
供试品溶液中混匀，用可调式移液器吸取混合对照
品溶液10止、混合供试品溶液30pL，上样。
2．2．3电泳过程及显色：先调节电泳仪电压至100
V，电泳2h后再调节电压至140V，再电泳2h，取
出胶板。将胶板置于盛有考马斯亮蓝染色液的染缸
中染色2h。取出放入考马斯亮蓝脱色液中脱色，1h
更换1次洗脱液，直至胶板染色完全被洗脱，取出并
记录图像，见图l。其中相对分子质量1．2×105对应
肌动结合蛋白ABP一120及胶原蛋白，9．74×10‘
对应辅肌动蛋白，7．4×10‘对应肌动蛋白结合蛋
白，6．4×10‘对应血红蛋白，4．7×1矿对应肌球蛋
白，4．3×10‘对应肌动蛋白[1“。
1一供试品z-人胎盘血置白
1一sampleZ—humanplacentaBeiUm
圈1象皮(A)、水牛皮(B)、黄牛皮(C)和人胎盘血蛋白
的电泳谱围
Fig．1ElectrophoregramorproteinsofCoriumEIe-
．鼻妇“fi|(A)，CorlumBubali(B)，andCorium
Bos(C)withhumanplacentaserum
2．3醋酸纤维索薄膜电泳法[s,93分析
2．3．1薄膜制备：取醋酸纤维素薄膜(8cm×2
era)，将无光泽面向下浸入pH8．6巴比妥一巴比妥钠
缓冲液中，待完全浸透取出，夹于滤纸中以吸去多余
的缓冲液，备用。
2．3．2样品上样：取样品液分别采用葡聚糖凝胶树
脂和透析法脱盐纯化。取溶液于膜条一端2cm处条
状点样，上样量为2～3．uL。
2．3．3电泳过程及显色：将已点样的醋酸纤维素薄
膜置于盛有巴比妥一巴比妥钠缓冲液的电泳架上，
100V电压条件下电泳1h，电泳后的薄膜以氨基红
溶液染色2～3min，漂洗数次，直至脱去底色为止。
结果见图2。透析法纯化的蛋白溶液浓度较高，出现
明显的红色电泳带，而葡聚糖凝胶树脂法纯化的蛋
白无明显的电泳带，分析原因可能是在分离过程中
葡聚糖凝胶树脂吸附了蛋白，致使其浓度较低。
3讨论
由于炮制后的象皮十分坚硬，其细粉经石英砂
研磨后加入聚山梨酯80呈黏团状，且不易被缓冲液
溶胀并分散，故需超声分散并溶胀过夜，又因高温易
使蛋自质变性，故实验操作需O～4℃球浴超声提
取，提取液以茚三酮试剂检识蛋白质是否提取完全，
根据茚三酮试剂的颜色反应判断每次提取6h方能
万方数据
·1658· 中革焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第11期2007年11月
References2
[1JEditorialBoardofChinaHerbal．StateAdministrationof
TrnditiormlChineseMedicine，China．ChinaHerba／(中华本
草)[M]．ShanghailShanghaiScientificandTechnicalPub-
lishers．1999．
[2]LiJ．MechanismofactionofShengjiXiangpoMastic[J]．J
Lianningc“zTraditChinMed(江宁中医学院学报)，2005，
7(4)t329．
[3】ChP(中国药兵)[S]．Vol1．2009．
图2透析法(A)与葡聚糖凝胶树脂法(B)纯化叠白藏的[43iL。i匕三：：：：。：：挈紫：2。篡=翟?裟：：：e寰0：：：盅
电诛请圈produc曲[J]．ActaAcadMedJiang矗(江西医学院学报)，
Fig·2Electrophoregram“proteIMpurlnedby 嘲嚣蛊般2盛Ⅵ“．sludy“tiinfI㈣mn舶tof
dJaJysis(A)andSepha ex(B)methodsCori蜊Vower[J]．China凸tB甜(中国骨伤)，1993，6(2)l6一
提取完全· [6]：。叫DLchoo。epT。t。i。p。rifi州．。。[J]．P加。J删
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中优化筛选了4种分Pharm(实用医学杂志)，2004．12，21(12)：1121．
离胶Act／Bis的配比，分别为20、25、37．5、60，结果n1黧M。而H,。蠹三鼍盛0：0。玉：勰。C。J。edG’：：：支。n．A
发现比例在25～37．5时显色比较明显，故选择 ‘a“n!athromb|ncleavagesite[J]·Aria／B一^一·200l，
z9bLz，：Jdu·
Acr／Bis为32．33配比。 [8]ChengzY．Cl：ni．a[Biochemistry彻dShorfprotocolshBio-
从蛋白质量角度分析象皮与拟替代品黄牛皮近毒：：善嚣警盥绻和P盎墨!譬盖警验20指03．导’m3’
似，水牛皮差距较大I从蛋白质组成成分角度分析，3 [9]TaoJY．Applificationofelectrophoresismethodinpharimic
种样品中均含有药用所需的肌球蛋白、肌动蛋白、原 ；嚣‰P3’山hi胁dP妇mJ‘安徽医药’’2004’§‘2’‘
肌球蛋白、血红蛋白等，为今后进一步深入探讨象皮 n阳茹；龆．勰喜名!麓篇篡岁篇烹等蠹：嚣蠹
比色法测定阿诺宁脂肪乳注射剂中总内酯
潘小平，吴萍，林立东。
(中国科学院华南植物园，广东广州 510650)
阿诺宁是我园从国产番荔枝科植物番荔枝An—
nonasqua，，zosa种子中发现的一个具有高抗癌活性
的番荔枝内酯有效部位药物。该药是由质量分数大
于90％的5～6个番荔枝内酯化合物和质量分数小
于IO％的未知成分组成o]。阿诺宁的活性部位为番
荔枝内酯，含有一个不饱和五元内酯环，在碱性溶液
中，双键转位形成活性次甲基，从而能够与Kedde
试剂反应而显色口]，在534nm波长下有最大吸收
值，可用于总内酯的测定o]。因此本实验建立比色法
测定阿诺宁脂肪乳注射剂中番荔枝总内酯的方法。
1试剂与仪器
Kedde试剂：193，5-二硝基苯甲酸溶于50mL
无水乙醇中，缓慢加入S0mL1mol／LN日OH，摇匀
待用(新鲜配置)。阿诺宁脂肪乳注射剂由桂林三金
制药有限公司生产，squamocin对照品(华南植物园
植物化学实验室制备)，Lambda25Uv／Vis紫外分
光光度计，PerKinElmer公司。
2方法与结果
2。1对照品储备液的制备：精密称取squamocin约
24．5mg，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得对
照品储备液(4．9mg／mL)。
2．2供试品溶液的制备：精密移取阿诺宁脂肪乳注
射剂5mL，加人少量无水乙醇，用旋转蒸发仪浓缩，
得淡黄色透明油状物。加入约4mL氯仿溶解，过2
g硅胶柱(内径：8mm，100～200日柱色谱硅胶，青
岛海洋化工厂)，再用15mL氯仿洗脱油脂后，用30
mL氯仿一甲醇(95·5)洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸
发仪浓缩蒸去溶剂后，加入1mL乙醇溶解，即得。
收藕日期：2006—12—08尊耋纂荏挚镳紊’铺％燃{盟：蹴鼎怒晋”。5”E’md⋯”Ⅱ@小s“一
万方数据
象皮与拟替代品黄牛皮、水牛皮中蛋白的研究
作者： 李鋆， 李秀兰， 张燕玲， 石森， 王昊， 李惠芬
作者单位： 李鋆,张燕玲,王昊,李惠芬(天津医科大学,天津,300070)， 李秀兰(天津市安定医院,天津
,300052)， 石森(天津市天津医院,天津,300210)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(11)
被引用次数： 5次

参考文献(10条)
1.Editorial Board of China Herbal State Administration of Traditional Chinese Medicine China 中华本
草 1999
2.Li J Mechanism of action of Sheng ji Xiangpo Mastic 2005(04)
3.中华人民共和国药典(三部) 2005
4.Li L;Zhu H F Applification of sepctrophotometric method in determination of the contents of the
protein in the milk products[期刊论文]-江西医学院学报 2005(02)
5.Wang X Y;Li X L Study of antiinflammation effect of Corium power 1993(02)
6.Yang D L Choose protein purification 2004(12)
7.Hefti M H;van Vμgt-Van der Toorn C J G;Dixon R A novel purification method for histidine-tagged
proteins containing a thrombin cleavage site[外文期刊] 2001(02)
8.Cheng Z Y 临床生物化学和生物化学检验实验指导 2003
9.Tao J Y Applification of electrophoresis method in pharimic analyse 2004(02)
10.Wang L F;Yang L F 蛋白质与核酸 1998

引证文献(5条)
1.石森.李惠芬.李新元 工业提取重楼薯蓣皂苷元的工艺研究[期刊论文]-天津药学 2010(5)
2.王智慧.赵红心.谷小芳 龟象膏治疗糖尿病肢端坏疽40例疗效观察[期刊论文]-河北中医 2009(11)
3.杜韦静.陈宝元.薛晓东.刘芳 生肌象皮膏与无象皮处方生肌膏的体外抗炎及免疫调节作用[期刊论文]-中国组织
工程研究 2012(7)
4.王春来.梁海英.王智慧.赵红心.谷小芳 龟象膏皮肤毒性实验研究[期刊论文]-中国中医急症 2011(12)
5.王智慧.赵红心.吴连杰 于晓东治疗糖尿病肢端坏疽经验[期刊论文]-河北中医 2011(10)


本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200711020.aspx