全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·527·
缘静脉注射，发现家兔有抽搐现象，而以0．2g／kg
剂量给药后，家兔在实验过程中状态正常。兼顾实验
仪器的灵敏度，将给药剂量定为0．2g／kg。
3．2 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的
技术。采用内标法定量时，要求内标物与待测组分结
构相似，并且在色谱条件下与待测物质能够较好的
分离。实验参考相关文献报道[6]，选择正十五烷为内
标物。
3．3血浆样品的预处理：实验曾使用乙腈沉淀蛋
白，效果较好，但由于甲基正壬酮溶于乙睛，致使药
物在蛋白沉淀过程中大量损失，影响药物浓度的测
定。故采取液一液萃取法，以正己烷为萃取剂[6]。由于
在液一液萃取中尽可能采用极性溶剂，这样可得到合
适的回收率，又使干扰杂质的提取量减至最小。为了
克服碳氢化合物的弱极性，溶剂中常加少量醇类[7]。
故本实验中对照品、内标物均由无水乙醇配制，大大
提高了药物的萃取率。
References：
[1]Wu．AdvaneesinstudiesonHouttuyniacordata[J]．Chin
TraditHerbDrugs(中草药)，2001，32(4)：367—368．
[2]GongYQ，WuYJ．Advancesinstudiesonclinicalpharma—
cologyHouttuyniacordataI-J]．ChinaPh rm(中国药业)，
2005，14(3)：73—74．
[3]WeiLP，WuMH．Pharmacokineticsof}asaroneandp
asaroneinvolatileoilfromAcroustatarinowiiSchottinrab—
bits[J]．JFourthMilMedUniv(第四军医大学学报)，
2005，26(15)：1431—1434．
[4]YuJD，HuYX．Determinationofmethyl—n—nonylketonein
Houttuyniacordata[J]．ChinMedAnal(药物分析杂志)。
1999，19(1)：50—51．
Es]ZhengXY．Investigation＆DirectionsPHncip如ofChemicals
andBiologicalProductforTherapy(化学药品和治疗用生物
用品研究指导原则(试行)EM]．Beijing：ChinaMedio—Phar—
maceuticalS ienceandTechnologyPublishingHouse，2005．
I-6]ShiCY，FangJG．Determinationofmethyl—n—nonylketone
inYuxingcaoInjectionbySPE—GC口]．HeraldMed(医药导
报)，2005，24(3)：225—226．
[7]ZhangJR，ZangHC．MedicineAnalysisInVivo(体内药物
分析)[M]．Beijng：ChemicalIndustryPress，2002．
聚氧乙烯一马来酸酐聚合物改性纤维素酶催化酸水解盾叶薯蓣
薯蓣皂苷元的研究
张裕卿，李滨县
(天津大学化工学院，天津300072)
摘要：目的提高纤维素酶在催化过程中的稳定性，并考察聚氧乙烯一马来酸酐聚合物改性纤维素酶在盾叶薯蓣
薯蓣皂苷转化为薯蓣皂苷元过程中的可行性。方法采用聚氧乙烯一马来酸酐共聚物对纤维素酶进行化学改性，并
以相对酶活考察改性酶的稳定性。以薯蓣皂苷元的提取率和熔点为指标，比较了纤维素酶和改性酶的辅助催化作
用。对改性酶催化所得薯蓣皂苷元产品进行元素分析和HPLC分析。结果改性酶在高温下的活力衰减速率减小，
在50℃pH4．8的醋酸一醋酸钠缓冲溶液中放置100min，保持了初始酶活的69．4％。改性酶辅助催化盾叶薯蓣中
薯蓣皂苷的转化时，较未改性酶的效果好，所得薯蓣皂苷元产品提取率为97．6％以上，为白色或乳白色，熔点为
200203℃，元素分析结果为H：77．96％，0：10．11％，HPLC法测定的质量分数高达96．03％。结论聚氧乙烯一马
来酸酐聚合物改性纤维素酶在较高温度下能够保持较高的催化活性，可以更有效地促进盾叶薯蓣薯蓣皂苷向薯蓣
皂苷元的转化。
关键词：盾叶薯蓣；聚氧乙烯一马来酸酐聚合物改性纤维素酶；薯蓣皂苷；薯蓣皂苷元
中图分类号：R284．2；R286．02文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2007)04—0527—04
Biocatalyticacidhydrolysisofd osgenini D oscoreazingiberensisthrough
polyOxethyleneoxide-maleicacidanhydridemo ifiedcelluloseenzyme
ZHANGYu—qing，LIBin—xian
(SchoolfChemicalEngineeringandTechnology，TianjinUn versity，Tianjin300072，China)
Keywords：DioscoreazingiberensisC．H．Wright；polyoxethyleneoxide—mal iccidanhydridemodi—
fiedcelluloseenzyme(PEo—MA)；dioscin；diosgenin
收稿日期：2006-08—19
基金项目：中国博士后科学基金资助项目(413395—0306)；天津市科技攻关计划项目(033180811)，天津大学青年教师基金资助项目
(411716)
作者简介：张裕卿(1963一)，男，天津人，生物化工专业博士后，副教授，研究生导师，研究方向为生物催化医药、化工新型材料和分离。
Tel：(022)27890470E—mail：zhangyuqing@tju．edu．ca
万方数据
·528· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs，第38卷第4期2007年4月
薯蓣皂苷元(diosgenin，25R—spriost-5一en一3p
01)俗称薯蓣皂素，属异螺旋甾烯烷的衍生物，为薯
蓣科薯蓣属植物根茎中薯蓣皂苷(dioscin)的水解产
物，其以糖苷的形式广泛存在于自然界的植物中，是
合成甾体激素药物重要的医药中间体，其经裂解、氧
化和消除反应后生成的醋酸孕甾双烯醇酮再经过改
造后可以得到数千种甾体药物，在医药界被称为“药
用黄金，，[1’引。近年来，国内外一些研究学者采用纤维
素酶[3|、淀粉酶[43等单一的酶制剂对薯蓣原料进行
酶处理后结合酸水解进行研究，结果能够使药材中
70％左右的薯蓣皂苷元成分提取出来。考虑到生物
酶的专一性不同，笔者利用阶梯生物催化转化薯蓣
皂苷元，产品的收率和质量均得到了较大地改善[2]。
由于催化环境的复杂性，生物酶在催化过程中随着
时间、热作用和产物的影响，生物活性会逐渐的衰
减，致使催化效率降低。为了提高酶的热稳定性和抗
原性，应国清等c53采用单甲氧基聚乙二醇修饰蚓激
酶，修饰后热稳定性优于天然酶；Park等[6]利用亲
水和疏水性共聚物修饰纤维素酶，结果亲水性共聚
物的引入提高了酶糖化纤维素的转化速率和改变了
酶的吸附参数。本实验选用聚氧乙烯一马来酸酐聚合
物改性纤维素酶一方面提高了纤维素酶的稳定性和
降低酶的失活速率，另一方面应用到薯蓣皂苷元的
转化中，证实了酶改性在薯蓣皂苷元转化过程中的
可行性。
l药品与材料
薯蓣由陕西省旬阳县黄姜研究所提供，标本由
该所陈钢鉴定为盾叶薯蓣Dioscoreazingiberensis
C．H．Wright的根茎；纤维素酶(酶活1．0×104
U／g)由天津诺奥生物技术有限公司提供；120。汽油
由天津石油公司提供；定性滤纸由天津市科威仪器
公司提供；聚氧乙烯、马来酸酐、葡萄糖等均为分析
纯试剂。
2方法与结果
2．1 改性酶的制备：纤维素酶的改性依据马来酸酐
与蛋白质中氨基的反应原理[7]。马来酸酐提供功能性
基团与蛋白质中的氨基发生反应，而聚氧乙烯则改变
化合物周围的亲水性环境。反应条件为：温度为4℃，
pH7．9～8．2(加入0．2mol／LNaOH溶液调节)，聚
合物逐步加入到纤维素酶溶液之中，缓慢搅拌混合溶
液。聚氧乙烯与马来酸酐通过醚化、酯化和缩合反应
合成聚合度和支链不同的聚氧乙烯一马来酸酐
(polyethylerieoxide—maleicacidanhydride，PEO—
MA)共聚物[8]。本实验选择k一30、n一10的共聚物
作为纤维素酶的改性剂。改性剂的结构式见图1。
r一占H cH——c一占H—]
l o又声oH2÷H：I
l
V
(} l
l(CH=-CH,-O)nl
L 占H。J。
图1 PEO—MA聚合物的结构
Fig．1StructureofPEO—MAcopolymer
2．2 薯蓣皂苷元的转化：称取干燥盾叶薯蓣粉末
25．0g，加定量水于三口烧瓶中，搅拌均匀充分润湿
30min，平行实验两组。然后分别在两原料液中按照
酶与底物的比例为0．1％加入改性纤维素酶和未改
性纤维素酶，调节反应体系温度为60℃，催化作用
2．0h，然后用H。S0。水解料液，烘干，提取结晶，即
得薯蓣皂苷元[2]。
2．3未改性酶与改性酶的稳定性比较：酶的稳定性
是通过测定一定温度下保温一段时间残留酶的相对
酶活反映。酶的活力测定方法参照文献报道[9]。本实
验选择定性滤纸为底物，定义1．0mg酶1min产生
1．0mg葡萄糖作为一个酶活单位。葡萄糖质量浓度
的测定采用3，5一二硝基水杨酸(DNS)比色法。规定
原纤维素酶的酶活为100o／／0，其他各种条件下的酶
活以此作为基准，以相对酶活表示。
未改性酶和改性酶分别溶解在pH4．8的醋酸一
醋酸钠缓冲溶液中，恒温50℃下放置一段时间，在不
同的时间间隔测定相对酶活，结果见表1。可以看出，
相对于未改性酶，改性酶的活力有所降低，但是稳定
性明显提高。未改性酶50℃恒温100min后的残留
酶相对酶活仅为初始酶活的32．8％，而改性酶经过
同样的处理后，残留酶相对酶活仍能够保持在原来的
69．4％左右。改性酶活力降低的原因可能是由于部分
活性基团参与了与大分子的结合反应，但是大分子引
入的同时也大大提高了酶的相对稳定性。
由于天然纤维素酶的最适宜催化温度一般为
45～60℃，在低于或者高于此温度范围时纤维素酶
都不能有效地催化降解纤维物质，通过表1可以看
出在50℃下天然酶的活力衰减速率比较大，仅保持
为原来的32．80／／，可以推测在更高温度条件下酶活
力衰减会更大。
通过测定残留酶相对酶活研究改性酶的耐温
性，考察改性酶在5S、60、65oC下的酶活力变化趋
势，结果见图2。可见随着温度的升高和反应时间的
万方数据
中革焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第’38卷第4期2007年4月·529·
延长，酶的活力逐渐降低。相对于未改性酶，虽然初
始酶活力低于未改性酶，糖化速率较未改性酶慢一
些，但是改性酶具有较高的稳定性，随着反应的进行
还能够保持较高的酶活，总催化效率高于未改性酶。
裹1 50℃恒温一定时间后未改性酶和改性酶残留酶
相对酶活的比较
Table1 Comparisonofremainingrelativeenzymic
activityat50℃thermostasisbe ween
celluloseandmodifiedenzyme
残留相对酶活／％反应时间7“i“——j五矗五i————1再五广
乎＼
艇
溢
靛
罂
滥
艇
缀
t／min
圈2不同温度下改性畸残留酶相对臻活随时间的变化
Fig．2Remainingrelativeenzymicactivityofmodified
enzymel皤timeatvarioustemperatures
2．4 改性酶和未改性酶辅助催化转化薯蓣皂苷元：
在应用硫酸水解薯蓣皂苷之前，对原料粉末进行酶
的预催化处理，改性纤维素酶和未改性纤维素酶的
2组重复性实验结果见表2。可见改性酶催化得到的
薯蓣皂苷元有较好的收率和熔点，并且均高于未改
性酶的结果。
寰2砖催化所得薯蓣皂苷元的提取辜和熔点
Table2 Extractionyielda dmeltingpointof
diosgeninobtainedby nzymiccatalysis
纤维素酶在催化过程中的失活主要是由于热作
用和底物或者产物与酶的强吸附弱脱附作用造成
的。反应体系中自由酶的浓度较高，则表现出较高的
生物活性，底物的转化速率也随之增大。Park等no]
报道非离子表面活性剂的引入会提高纤维素酶对底
物的转化和糖化作用，从而提高生物酶的循环催化
速率，即转化成自由酶的速率。因此，提高纤维素酶
对底物的糖化作用和在纤维素表面的吸附和解吸过
程中表面活性剂提供的亲水环境非常重要。同样本
实验中亲水性物质聚氧乙烯的加入对纤维素酶在温
度较高的情况下的解吸和吸附起到了积极的作用，
能够加快纤维素酶在产物上的解吸，提高了自由酶
的浓度，进而使得体系中酶的活性始终保持较高的
活性，提高了酶的催化效率。
在实验过程中，相应的减小了纤维素酶的作用
时间和降低了硫酸的浓度与用量相对于文献报道¨j
中的时间和用量，结果也具有很好的重现性。因此可
以说明纤维素酶改性在催化薯蓣皂苷元的转化中起
了很好的作用，较大程度地软化了纤维组织和破坏
了坚固的植物细胞壁结构，为薯蓣皂苷的酸水解减
小了阻力，更有利于薯蓣皂苷元的浸出。
2．5 薯蓣皂苷元产品的表征：改性酶生物催化酸水
解得到的薯蓣皂苷元产品的元素分析结果见表3。
可见皂苷元中所含碳元素和氢元素的实验值与理论
计算值基本相符。薯蓣皂苷元产品和对照品的
HPLC色谱图中薯蓣皂苷元的保留时间分别为
23．029、23．100min，通过积分峰面积归一化法可得
产品的质量分数为96．03％，见图3。
表3薯蓣皂苷元产品的元素分析
Table3 Elementa alysisofdiosgeninsample
一}——r——r——r——r——r——r——r——r——r——r——r—1——’——T————1——’——1’—_P——r——r——r——’叫0 5 10 1 5 20 25 30O 5 10 l5 20 25 30
t／rain
图3薯蓣皂苷元产品(A)和对照品(B)的HPLC色谱图
Fig．3HPLCChromatogramsofdiosgeninsample(A)
andreferencesubstance(B)
3讨论
综上所述，对纤维素酶利用聚氧乙烯一马来酸酐
亲水性共聚物进行化学改性，改性后纤维素酶在高
温下的稳定性得到了提高，并且能够保持较高的生
万方数据
·530· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
物催化活性。利用修饰后纤维素酶催化薯蓣原料酸
水解转化薯蓣皂苷元具有很好的应用价值，提取率
可以达到98,2％，产品质量分数和熔点分别为
96．03％和201～203℃。
References：
E13HuangYX．Researchprogressoftheproductionprocessesof
diosgeninEJ]．ShanghaiJTr ditChinMed(上海中医药杂
志)，2004，38(4)：56—58．
[2]ZhangYQ，WangDQ，LiBX，eta1．Extractionofdios—
geninfromDioscoreazingberensisthroughtepwisebio ataly—
sisEJ]。ChinTraditHerbDrugs(中草药)，2006，37(5)：
688—691．
[33LiuGJ，LuoN，ChenJY，eta1．Studyonseveralenzyme
methodsfextractingd osgenin[J]．JZhengzhouUniv；
EngSci(郑州大学学报：工学版)，2005，26(4)：48-50．
[4]TongL，ZhangSK，LiJ，eta1．Extractingsapo eninsfrom
dioscoreazingiberensisthroughenzymatichydrolysis[J]．J
ShaanxiNormUniv：NatSci(陕西师范大学学报：自然科学
版)，2003，31(2)：81—83．
[53YingGQ，YiY，ShiLE，eta1．Preparationandpr perties
ofearthwormfib inolyticenzymemodifiedwithmPEGEJ3．J
ChemEngChinUniv(高校化学工程学报)，2005，19(8)：
527—531．
[6]JinWP，KwinamP，HocheolS，eta1．Saccharificationand
adsorptioncharacteristicsofmodifiedeellulaseswithy—
drophilic／hydrophobiceopolymers[J-I．JBiotechnol，2002，
93：203—208．
[7]ButlerPJG，HarrisJI，HartleyBS，eta1．Theuseofmale-
icanhydrideforthereversibleblockingofaminogroupsin
polypeptidechains[J]．BiochemJ，1969，112：679—689．
[8]KwiNP，JinWP．Modificationofcellulaseby ynthesized
copolymerwithpolyethyleneoxideandmaleicacidanhydride
[J]．JApplPolymSci，2000，77：368—373．
[9]LiuML，WangJ．Theinfluencefa torsinthemeasurement
oftheactivityof heellulase[J]。FoodFermentl (食品
与发酵工业)，2006，26(6)：37—39·
[103ParkJW，TakahataY，KajiuchiT，eta1．Effectsofnon—
ionicsurfactantone zymatichydrolysisofusednewspaper
[J]．BiotechnolBioeng，1992，39(1)：117-120．
聚酰胺对紫锥菊提取物中菊苣酸的分离纯化研究
刘轶琛1’2，曾建国1’2，陈波¨，姚守拙1
(1．化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室，湖南师范大学，湖南长沙410081；
2．湖南省中药提取工程研究中心，湖南长沙410331)
摘要：目的采用聚酰胺柱色谱分离纯化紫锥菊提取物中菊苣酸。方法采用50％乙醇溶液洗脱，HPLC法对产
品中菊苣酸进行检测分析。结果该法能把紫锥菊提取物中菊苣酸的质量分数(4．9％)提高10倍左右，回收率达
到98％以上。结论该法操作简单，可用于紫锥菊提取物中菊苣酸的分离纯化。
关键词：紫锥菊提取物；菊苣酸；聚酰胺柱色谱；高效液相色谱
中图分类号：R284。2；R286．02文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2007)04—0530—04
Isolationandpurificationofc choricacidfromextractsofEchinaceapurpurea
bypolyamidecolumnchromatography
LIUYi—chenl一，ZENGJian—gu01”，CHENB01，YAOShou—zhu01
(1．KeyLaboratoryofChemicalBiologyandTraditionalChineseMedicineResearch，MinistryofEducation，
HunanNormalUniversity，Changsha410081，China；2．HunanEngineeringResearchCenter
ofBotanicalExtract，Changsha410331，China)
Keywords：theextractsofEchinaceapurpureaMoench；cichoricacid；polyamidecolumnchromatog—
raphy：HPLC
紫锥菊为菊科松果菊属多年生革本植物，原产
于北美洲的中西部地区，有9个品种，主要药用种是
狭叶松果菊EchinaceangustifoliaDC．、紫花松果
菊E．purpurea(L．)Moench和淡紫松果菊
E．pallida(Nutt．)Nutt．。紫锥菊是目前国际上受
到普遍重视的一种免疫促进剂和免疫调节剂D3，也
是极少数具有免疫力增强和抗炎双重作用的植物药
之一[2’3]。 苣酸为咖啡酸衍生物，是紫锥菊中重要
收稿日期：2006—12—11
基金项目：“973”项目(2006cB504701)；湖南省重点科技项目(05SK2006)
作者简介：刘轶琛(1980一)，男，湖南新化人，在读硕士，主要从事中草药与保健食品的研究与开发。E—mail；1yc6666666@163．eom
*通讯作者陈波Tel：(0731)8865515E—mail：dr—chenpo@vip．sina．com
万方数据
聚氧乙烯-马来酸酐聚合物改性纤维素酶催化酸水解盾叶薯蓣
薯蓣皂苷元的研究
作者： 张裕卿， 李滨县， ZHANG Yu-qing， LI Bin-xian
作者单位： 天津大学化工学院,天津,300072
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 1次

参考文献(10条)
1.Huang Y X Research progress of the production processes of diosgenin[期刊论文]-上海中医药杂志
2004(04)
2.Zhang Y Q;Wang D Q;Li B X Extraction of diosgenin from Dioscorea zingberensis through stepwise
biocatalysis[期刊论文]-中草药 2006(05)
3.Liu G J;Luo N;Chen J Y Study on several enzyme methods of extracting diosgenin[期刊论文]-郑州大学
学报(工学版) 2005(04)
4.Tong L;Zhang S K;Li J Extracting sapogenins from dioscorea zingiberensis through enzymatic
hydrolysis[期刊论文]-陕西师范大学学报(自然科学版) 2003(02)
5.Ying G Q;Yi Y;Shi L E Preparation and properties of earthworm fibrinolytic enzyme modified with
mPEG[期刊论文]-高校化学工程学报 2005(08)
6.Jin W P;Kwinam P;Hocheol S Saccharification and adsorption characteristics of modified cellulases
with hydrophilic/hydrophobic copolymers[外文期刊] 2002(3)
7.Butler P J G;Harris J I;Hartley B S The use of maleic anhydride for the reversible blocking of
amino groups in polypeptide chains 1969
8.Kwi N P;Jin W P Modification of cellulase by synthesized copolymer with polyethylene oxide and
maleic acid anhydride[外文期刊] 2000
9.Lin M L;Wang J The influence factors in the measurement of the activity of the cellulase 2006(06)
10.Park J W;Takahata Y;Kajiuchi T Effects of nonionic surfactant on enzymatic hydrolysis of used
newspaper[外文期刊] 1992(01)

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3. 汤兴利.徐增莱.夏冰.史云云 用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元预发酵与水解条件优化[期刊论文]-植物资源与环境学
报2004,13(3)

引证文献(1条)
1.王庆宇.金凤燮.鱼红闪 薯蓣皂苷元制备方法的研究进展[期刊论文]-安徽农业科学 2011(5)


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