全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1867·
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天麻素对酸中毒诱导的大鼠海马神经元损伤的保护作用
曾祥慧，葛亚坤，严 明，郑筱祥。
(浙江大学生物医学工程与仪器科学学院，浙江杭州 310027)
脑组织pH值下降、酸中毒是很多疾病如脑外
伤、癫痫、脑中风的病理现象，也是导致神经元损伤
的主要致病因素[1’2]。天麻素是天麻的主要有效成
分，具有抗谷氨酸兴奋性毒性和氧自由基损伤作
用口“]，并且广泛用于神经系统疾病的治疗。近年来，
对天麻素的药理作用展开了广泛的研究，如抗血管
性痴呆、抗神经衰弱、抗癫痫等作用。本实验采用原
代培养的大鼠海马神经细胞，建立酸中毒细胞模型，
观察天麻素对酸性环境下海马神经元的影响，为该
药更好的临床应用提供进一步的理论基础。
1材料
1．1 动物：新生SD大鼠(1日龄)，由浙江省医学
科学院动物中心提供，动物合格证号：SCXK(浙)
2003—0001。
1．2药品与试剂：天麻素(质量分数99．6％)，由昆
明制药集团有限公司提供；阿米洛利(中国药品生物
制品检定所)；Fluo一3／AM(MolecularProbe，美
国)；PI染料(Caltag，美国)；胰蛋白酶(Amresco
公司，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公
司)；DEME培养基(Gibco，美国)；Neurobasal培
养液及B27补充物(Gibco，美国)。
1．3仪器：FACSort流式细胞仪，美国BD公司产
品；Zeiss510型激光共聚焦显微镜，德国Zeiss公司
产品；inoLabLevel1pH计，德国WTW公司产品；
BB5060型C02恒温培养箱为德国Heraeus公司
产品。
2方法
2．1 海马神经细胞原代培养：取1日龄SD大鼠，
处死后无菌条件分离出海马组织，剪碎后加入
0．25％胰蛋白酶液，37℃振荡消化20min，1000
r／rain离心10min，收集细胞，用DMEM完全培养
液(含10％胎牛血清)重新悬浮后，以2×105／cm2
将海马细胞分别接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培
养板和培养皿内。置37℃、5％CO。、饱和湿度的培
养箱内培养，12h细胞贴壁后DMEM完全培养液
换为Neurobasal培养液(加2％B27补充物、0．5
mmol／L谷氨酰胺、50U／mL青霉素、50yg／mL链
霉素)。以接种当天为培养第1天，至培养第3天加
入终浓度为3,umol／L的阿糖胞苷以抑制非神经细
胞的增殖，培养9d后用于各项实验。
收稿日期；2007-04-25
作者简介：曾祥慧(1976一)，男，江西省南康市人，博士研究生，研究方向为抗心脑血管疾病药物及抗肿瘤药物筛选与评价。
E—mail：zeng89@hotmail．com
*通讯作者郑被祥T。el：(0571)87951091E—mail；ZXX@mail．bme．zju．edu．cn
万方数据
·1868· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
2．2酸中毒细胞模型的建立：参考文献方法[2]。神
经细胞培养9d后，细胞分为正常组、模型组、天麻
素组(25、50．100弘g／mL)和阿米洛利组(100
／lmol／L)。正常组加入pH7．4的平衡盐溶液
(BSS)，其他各组加入pH6．5的平衡盐溶液EBSS
(mmol／L)NaCI140、KCl5．5、CaCl21．8、MgCl2
1．0、HEPES20、葡萄糖103，2h后，移去BSS液，
清洗细胞，加入新鲜Neurobasal培养液，继续培养
22h。实验结束后用流式细胞仪检测细胞死亡率和
活性氧(ROS)水平。BSS和新鲜Neurobasal培养
液含有阿米洛利和不同终质量浓度的天麻素。
2．3流式细胞仪检测细胞死亡率：根据本室建立的
实验方法[5]，将培养于24孔板的各组海马神经细胞
消化收集，每组5个复孔，PBS清洗1遍，细胞调为
8×104／mL，取0．2mL，加入20肛LPI染料浓缩液
(50肛g／mL)，孵育5min后，在流式细胞仪上检测，
数据用流式细胞仪携带的CellQuestTM软件分析，
实验重复3次。
2．4细胞内ROS水平的测定：将培养于24孔板
的各组海马神经细胞消化收集，PBS清洗2遍，细
胞调为8×104／mL，取0．19mL。加入lo弘L
H2DCFDA溶液(DCF，0．2mmol／L)混匀，室温下
避光孵育30min。离心吸弃上清液，PBS清洗2遍，
加入0．2mLPBS待测。流式细胞仪选用激发波长
为488nm，吸收波长为530nm，测定细胞内二氯荧
光素的荧光强度，DCF的荧光强度反映细胞内
RoS水平，实验重复3次。
2．5 细胞内钙离子浓度[Ca抖]；的测定：培养于35
mm培养皿的各组细胞经药物预处理15min后，
Fluo～3染色，室温下避光孵育30min。PBS清洗2
遍后，激光共聚焦显微镜进行时间序列扫描(激发
波长488nm，发射波长500～550nm)。每60秒扫
描一幅图像并自动记录细胞内钙离子荧光强度F
(第一幅图荧光强度值记作F。)，扫描时间为30
min。给药组细胞在扫描第一幅图像后迅速于培养
皿中加入含不同质量浓度药物的pH6．5的BSS，
正常组加pH7．4的BSS。用F／F。表示第30分钟
[Ca2+]i的变化。
2．6统计学分析：数据以z士s表示，采用SPSS统
计软件包，多组问比较用单因素方差分析(one—way
ANONA)，两两比较用Student7s—t检验。
3结果
3．1对神经细胞死亡率的影响：见表1。与正常组
比较，模型组海马神经细胞死亡率明显升高，差异极
显著(P<0．001)；与模型组比较，天麻素低、中、高
3个剂量组细胞死亡率都有不同程度的降低，尤以
中、高剂量组作用明显，差异显著(P<0．05)，阿米
洛利组神经细胞死亡率明显减少，差异显著(P<
0．01)。
3．2对神经细胞内ROS水平的影响：见表1。与正
常组比较，模型组细胞内ROS水平明显升高，差异
极显著(P
低，差异显著(P
3．3对神经细胞[Ca2+]i的影响：见表1。与正常组
比较，模型组细胞ECa-2+]i明显升高，差异极显著
(P<0．001)；与模型组比较，阿米洛利组和天麻素
中、高剂量组细胞[Ca2+]i升高明显减轻，差异显著
(P
细胞内ROS水平和[Ca2+]I的影响(x土S，拧一3)
Table1 Effectofgastrodinndeathrate，ROSlevel，
and[Ca2+]iinrath ppocampalneurons
inducedbyacidosis(；土s，n一3)
组别 浓度 死亡率／％ ROs(荧光强度)[Ca2+]i(F／F。)
正常 一 9。2士2。5 53。4士5。7 i。096士O。154
模型 一 37．6士5．3⋯108．6士8．7⋯3．131士0．351⋯
阿米搭利 100pmo卜L一120．3士3．4AA65．5：L6．5△△1．581士0．274／!A
25心·mLl31．6士5．5 98．7土7．9 2．864-[-0．302
天麻素 50耀·mL一128，!士4．2△ 92．2土6．3／1 2．529士0．244／1
100腿·mL一124．O士5．6△ 85．4土8．1△ 2．252士0．189A
与正常组比较：⋯P
△P<0．05△△P
Xiong等[13及Gao等[2]运用生化及电生理等手
段论证了酸敏感钙离子通道(ASICs)是介导缺血
性脑损伤的重要因子，发现酸敏感离子通道阻断剂
阿米洛利可以有效减轻脑中风的损伤。酸中毒是很
多疾病的病理现象，抑制神经细胞酸中毒则可能成为
重要的神经保护途径。本实验用原代培养的大鼠海马
神经元以酸性细胞外液诱导建立酸中毒细胞模型，研
究了天麻素对酸中毒损伤下神经细胞的调控作用，结
果显示天麻素降低了海马神经细胞的死亡率，表明天
麻素对酸中毒下的神经细胞具有保护作用。
神经细胞内钙超载是引起神经细胞坏死和凋亡
的重要途径。细胞内钙超载使ROS大量产生。ROS
能引起细胞膜的脂质过氧化，产生许多生化改变，如
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1869·
改变细胞膜的物理特性、使膜上结合的调节细胞膜
通透性的酶失活。研究证明细胞膜的脂质过氧化能
促进细胞的凋亡嘲，而且某些脂质过氧化产物还能
继发性地引起细胞内钙失衡[7]，加重细胞损伤。
在本实验中，天麻素可剂量依赖性地抑制酸中
毒引起的神经细胞ROS的升高，该结果与既往研
究结果一致[4]，表明天麻素有清除过多的ROS的作
用，这可能是其发挥神经保护作用的机制之_。本实
验还应用激光共聚集显微镜结合特异性荧光染色技
术，研究发现了天麻素对酸中毒引起的细胞[Ca2+]i
的升高具有明显的抑制作用，提示这可能是其发挥
神经保护作用的另一重要机制。
本实验在细胞水平上研究了天麻素对酸中毒神
经细胞的作用，结果显示天麻素具有明显的神经细
胞保护作用，为天麻素在神经系统疾病上的应用提
供了实验依据。
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升黄克痛软膏药效学实验研究
杨洁，赵夕秋，顾苏俊
(解放军总医院药品保障中心，北京100853)
带状疱疹是由水痘一带状疱疹病毒感染引起的
一种以沿周围神经分布的群集疱疹和以神经痛为特
征的病毒性皮肤病，中医称为缠腰火丹，其发病率
(0．14％～o．48％)在近年来呈现不断增高的趋势。
本课题组通过查阅大量的中医药经典文献和多年的
实际应用，研制出针对带状疱疹疗效确切的纯中药
复方制剂——升黄克痛软膏。其由大黄、升麻两味中
药组成，体外抗病毒实验证明作用相当显著，并对正
常细胞的毒性作用很小。在此基础上，本实验主要探
讨升黄克痛软膏的体内抗病毒作用。
1材料与方法
1．1 药物及剂量：升黄克痛软膏(生药量29g／lOO
mL)，由本院中药房提供。用时将其稀释成0．5g／
mL，豚鼠用0．8mL／200g，折合为生药0．58g／kg
(高剂量)，中、低剂量(o．29、0．14g／kg)依次对倍
稀释。酞丁安软膏(批号040702，0．01g／g)，北京协
和药厂生产，用时将其稀释成0．5g／mL，豚鼠用
0．8mL／200g，折合为0．02g／kg。
1．2实验动物：豚鼠，体重(180士10)g，北京通利实
验动物养殖场提供，动物合格证号第069总024号。
1．3病毒细胞株：单纯疱疹病毒I(HSV—I)，购自
中国预防医学科学院病毒学研究所，本实验室传代
后使用(由于带状疱疹病毒管制，目前都用单纯疱
疹病毒替代)。
1．4实验方法
1．4．1感染模型的建立[¨：将豚鼠背部去毛，划分
出前后．2个感染区，用针头刺人皮肤深层，1～1．2
cm直径内呈梅花样均匀刺7针，除正常对照组外，
以原倍HSV—10．07mL滴加于针刺区内，用无菌
玻棒涂开感染。
1．4．2给药：于感染后第5天，按组(除模型对照
组外，酞丁安软膏，升黄克痛软膏高、中、低剂量组)
每鼠分别取试药0．8mL滴于各感染区内，以无菌
玻棒涂开，每日1次进行治疗，连续5d。模型对照
组给予无菌蒸馏水。
1．4．3观察：每日按表1标准，观察记录感染区皮
收稿日期：2007—04—09
作者简介：杨洁(1973一)，女，河北人，主管药师，研究方向为中药药理。
万方数据
天麻素对酸中毒诱导的大鼠海马神经元损伤的保护作用
作者： 曾祥慧， 葛亚坤， 严明， 郑筱祥
作者单位： 浙江大学生物医学工程与仪器科学学院,浙江,杭州,310027
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(12)
被引用次数： 3次
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