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Optimizing preparation technique of Polyporus umbellatus polysaccharides long circulating liposomes by orthogonal test

正交试验优选猪苓多糖长循环脂质体制备工艺的研究



全 文 :-1484· 中革蒋ChineseTraditionaIandHerbalDrugs第38卷第10期2007年10月
工艺中收率因素对包封率的影响,因此认为以此公
式计算包封率更为科学可靠。
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正交试验优选猪苓多糖长循环脂质体制备工艺的研究
汪继缸,杨瑞,范巧娜,王凯平,胡明慧
(华中科技大学同济医学院药学院,期北武汉430030)
摘要:目的研究猪苓多糖长循环脂质体的处方和制备工艺。方法采用逆相蒸发法制备脂质体。以紫外分光光
度一Scphadex法测定脂质体中猪苓多糖的包封率和载药量,采用单因素和正交试验法优化猪苓多糖长循环脂质体
的处方和制备工艺。结果优化后的脂质律平均包封率为98.24%,平均载药量为27.20%。绪论脂质体制备工
艺合理,紫外分光光度一Sephadex法测定猪苓多糖长循环脂质体包封率准确性高,重现性好,简便易行。
美键词:猪苓多糖;长循环脂质体;逆相蒸发法}正交试验法}制备
,中田分类号:R283.1-R286.02文献标识码:A 文章编号t0253—2670(2007)10—1484—04
Optimizingpreparationtech iqueofPolyporusumbellatuspolysaccharides
longcirculatingliposomesbyorthogonaltest
wANGJi—hong,YANGRui,FANQiao—na,WANGKai—ping,HUMing—hui
(schoolfPharmacy.TongjiMedicalCo lege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)
Abstract;ObjectiveTostudythprocessingtechniquesforprescriptionandpreparationofPolyporus
urabellatuspoIysaccharideslongcirculatingl posomes(PUPSLCLs).MethodsT eliposomeswerepre—
paredbythereverseevaporatingmethod.Themaininfluencingfactorswereidentifiedbysinglefactor
analysis.thenthetechniquesoftheprescriptionandpreparationofl posomeswereoptimized.Theentrap—
mentefficiencya dthecarryingamountweredeterminedbyUV—Sephadexmethod.ResultsAfteropti—
mized,theaverageentrapmentefficiencyofIiposomeswas98.24%andtheaveragecarryingamountwas
27.20%.ConclusionPreparationmethodofPUPSLCLsiSavailable.UV—Sephadexmethodissimple
andsuitableforqualitycontrolofPUPSLCLswithdesirablereproducibilityandtheresultsarereliable.
Keywords:Polyporusumbellatusp01ysaccharides(PUPS)}longcirculatingliposomes(LCLs)Jre—
verseevaporatingmethod;orthogonaltest‘preparation
猪苓是多孔菌科多孔菌属猪苓Polyporusum—
bellatus(Pers.)Fr.的菌核。猪苓多糖是猪苓的主
要有效成分,具有抗癌和保肝等多种药理作用“]。传
统的脂质体易被单核吞噬细胞吞噬,在血液循环中
驻留时间较短,极大地影响其作为药物载俸的应
用[2]。采用聚乙二醇(PEG)修饰制成的长循环脂质
体能提高脂质体的亲水性,逃避网状内皮系统对脂
质体的识别,提高药物的抗肿瘤活性。本课题组前期
研究制备出的猪苓多糖脂质体韵包封率和载药量都
较低o]。故本实验以猪苓多糖为模型药物,采用正交
设计筛选PEG4000修饰的长循环脂质体的处方,
研究其制备工艺,并进行质量评价。
l仪器与试剂
722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有
限公司),台式离心机(上海安亭科学仪器厂),超声
波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司),葡聚糖
凝胶G一50(中国医药集团上海化学试剂公司),大
豆卵磷脂(北京奥博星生物技术责任有限公司),胆
收精日期:2007—01—08
作者简介:汪继红(1976一).女,朔北省应城市人.讲师,硬士,研究方向为药物新剂型的研制与开发
Tel=(027)83657549E—mail:Wj200510@126.COrn
万方数据
中草黄 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第10期2007年10月
固醇(北京奥博星生物技术责任有限公司),聚乙二
醇4000(PEG4000,进口分装),猪苓多糖(质量分
数≥80%,连云港东风制药厂),所用试剂均为分析
纯,实验用水为双蒸水。
2方法和结果
2.1标准曲线的绘制o]:精密称取干燥至恒重的葡
萄糖对照品10mg,置100mL量瓶中,加水稀释至
刻度,即得对照品溶液。精密量取葡萄糖对照品溶液
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL,分别
置试管中,加蒸馏水适量使成2.0mL,再加苯酚溶液
1.0mL,摇匀。迅速滴加浓硫酸5。0mL,放置5mln后
沸水浴中加热15rain,取出后置冷水中冷却。以不舍
对照品溶液的一管做空白,按分光光度法于490nm处
测吸光度(A)值。以A对葡萄糖质量浓度(c)进行线
性回归,得回归方程A一0.0152C+0.0026,r一
0,9982。表明葡萄糖在4.80~43.2pg/mL与吸光
度存在良好的线性关系。
z.2换算因子的测定H]:精密称取猪苓多糖20
mg,置250mL量瓶中加水溶解稀释至刻度,精密吸
取0.6mL,以苯酚一硫酸法在490nm处测吸光度
值,将数值带人回归方程算出供试品溶液中葡萄糖
的质量浓度,计算得换算因子,=1.27。
f=IV/CD
其中Ⅳ为多糖的质量,c为多糖渡中葡萄糖的质量分
散.D为多糖的稀释倍数。
2.3脂质体的制备:采用逆相蒸发法口棚。按比例称
取大豆卵磷脂、胆固醇和PEG4000并用适量的三氯
甲烷溶解,称取猪苓多糖用PBS缓冲液配成3%的
溶液,将以上两种溶液转入圆底烧瓶内,超声混匀得
w/0型乳剂,置旋转蒸发仪上于恒温水浴中减压蒸
发15rain除去氯仿,得稠厚的胶化物,放置4h后
加入适量PBS缓冲液,超声成均匀的乳状液,5000
r/rain离心,得乳白色胶体溶液,即为猪苓多糖长循
环脂质体。按照猪苓多糖长循环脂质体的制备方法
操作,只是采用PBS缓冲液代替猪苓多糖溶液,同
法制备空白脂质体。
2.4脂质体包封率的测定
2.4.1脂质体洗脱曲线的绘制:吸取0.5mL载药
脂质体加到G一50凝胶柱上,控制流量为1mL/min,
以PBS缓冲液作为流动相洗脱。每管收集2mL,共
30管,分别以苯酚一硫酸法在490rim处测定A,以A
为纵坐标,管号为横坐标绘制洗脱曲线.见图1。可见
脂质体(乳白色)在15mL左右开始流出,大约到20
mL,后续液为游离药物的冼脱液,大约到25mL。




O 5 10 15 20 25 30 35
管号
圈1猪苓多糖长循环脂质体的洗脱曲线
Fig.1ElutioncllrTeofPUPSLCLs
2.4.2包封率测定:用紫外分光光度一Sephadex
法。吸取0.5mL载药脂质体加到G一50凝胶柱上,
控制流量为1mL/min,用PBS缓冲液洗脱。收集脂
质体洗脱液20mL和后续液25mL。分别置100mL
量瓶中,加PBS缓冲液稀释至刻度,另取空白脂质
体过柱洗脱做空白。分别取1.2mL溶液接苯酚硫
酸法在490nm处测定A值.带人回归方程中计算
猪苓多糖的质量浓度,计算包封率。
包封率=(c4--cm)/cjXloo%
C·为脂质体中猪苓多糖的包封量和C.之和,c·为过
柱后游离的猪苓多糖的质量浓度.
根据脂质体包裹药物的质量与脂质体中所含固
体总质量之比,计算载药量。
载药量一Ⅳl//Ⅳ4×IOO%
Ⅳ,为脂质体中猪苓多糖的质量,由标准曲线换算而得;
Ⅳt为所有固体总质量;,为换算因子。
2.5影响脂质体制备工艺因素的考察
2.5.1胆固醇与磷脂用量的比例对包封率的影响:
在固定油水两相比例、PEG4000质量等因素条件
下,选取胆固醇与磷脂物质的量为1 t 2、1t 3、1:
4、1:5、1t 6时制备脂质体,测得包封率分别为
91.43%、78.93%、75.53%、87.68%、63.69%。可
见,当胆固醇与磷脂为1:2时,脂质体的包封率最
高,且制备过程中产生气泡较多,超声较完全,制备
的脂质体质量也较好。因此将胆固醇与磷脂的物质
的量比例固定为l:2。
2.5.2PEG4000加入量对包封率的影响:固定其
他因素,选取PEG4000质量分别为2、3、4、5、6mg
时,包封率分别为65.80%,74.82%、76.09%、
78.25%、74.70%。即当PEG4000的质量为5mg
时,脂质体的包封率最高。
2.5.3水相与有机相比例对包封率的影响t在固定
PEG4000的质量、磷脂与胆固醇的比例等因素条
件下,选取PBs缓冲液与氯仿的体积比为1t 2、1t
3、1;4时,测得包封率为91.43蹦、79.71%、
万方数据
·1486· 中革茵Chin∞eTraditlo叫andHerbalDrugs第38卷第10期2007年10月
47.07%,即当水相与有机相的比例为l。2时,脂质
体的包封率最高,比较合适。其中试验还选取了水相
与有机相的比例为l:l和l,5,但是比例为1;1
时,在制备过程中将水相与有机相混合时出现固体
块状物,超声也不溶解,故该比例不宜。当比例为It
5时,旋转蒸发后的脂质体膜很难完全超声成溶液
状,测定的包封率超过了i00%,原因可能是比例不
合理和操作时的误差造成,故该比例也不宜。
2.5.4水浴温度对包封率的影响:固定其他所有因
素条件,选取水浴温度分别为30、60℃时,钡4定的包
封率分别为91.43%、90.88%,可认为温度对包封
率的影响程度较小。从节能和方便实验操作的角度
考虑,将水浴温度控制在30℃。
2.5.5猪苓多糖加入量对包封率的影响:固定其他
所有因素条件,当猪苓多糖加入量为30、40、50、60、
70mg时,以包封率为衡量指标,测得结果分别为
87.10%、88.31%、93.40%、93.80%、95.91蹦。当猪
苓多糖的质量继续增加时,其溶解性能受到影响。
2.6正交设计优化脂质体处方
2.6.1影响因素和水平的确定:在单因素考察的基
础上,确定胆固醇与磷脂的比例(A)、PEG4000质
量(B)、水相与有机相的比例(c)和猪苓多糖质量
(D)为因素,每个因素取3个水平,因素水平见表1。
表I因素与水平
TableFactorsandIeve]s
2.6.2脂质体处方优化设计:以包封率和载药量为
指标,按正交设计的原理选用L。(34)设计表进行试
验,实验方案及测定结果见袁2。
寰2正交试验方案及结果
Table2 DesignandresultsofoMhogonaltest
编号 A B C D 包封宰/“载药量/“
l l 1 l 1 90.94 2086
2 l 2 Z 2 92.24 24.91
3 1 3 3 3 95.91 z5.93
4 2 1 2 3 93.70 26.52
5 2 2 3 1 95.92 21.2i
6 2 3 1 2 96.12 20.58
7 3 1 3 2 95.21 24.25
8 3 2 I 3 92.97 2882
9 3 3 2 l 94.98 19.81
包封率Kx 27909279.85280.03281.84
K228574281.13280.92283.57
K3283.16287.0l287.0428z.58
R 缸65 7.167.01 I.73
载药量五1 71.7071.6370.266188
K268.3l7494 71.2469.74
X^72.88663271.3981.27
R 4 57 8.6Z1.1319.39
比较R值的大小可以看出,当以包封率为指标
时,B>C>A>D,即对脂质体包封率影响最大的是
PEG40G0的质量,其次是水相与有机相的比例、胆
固醇与磷脂的比例,对脂质体包封率影响最小的是
猪苓多糖的质量,筛选的最佳处方为AzBsCaD2。而
当考察各因素对载药量的影响时,影响程度为D>
B>C>A,可看出猪苓多糖的质量对载药量影响最
大,其次是PEG4000的质量、胆固醇与磷脂的比
例,影响最小的是水相与有机相的比例,最佳处方为
A。B。C。D。。综合考虑包封率和载药量两个指标,胆固
醇与磷脂的比例为1;2.o和l:2.5时,包封率差别
不大,而载药量相差较大,故确定该比例为1;2.5I
PEG4000的质量为4mg和5mg时,包封率和载药
量相差均较大,由于载药量为本实验主要考察项目,
故选取PEG4000的质量为5mg;猪苓多糖的质量
对载药量的影响很大,而对包封率的影响很小,故只
需考虑其对载药量的影响。从而确定猪苓多糖的质量
为70mg。由此,通过正交设计筛选出猪苓多糖脂质
体的最佳处方:A。B。C,D,,即磷脂与胆固醇的比例为
1:2.5,PEG4000质量为5mg,永相与有机相的比
例为1:2.5,确定猪苓多糖的质量为70mg。
2.7验证试验:采用正交试验筛选出的最佳处方制
备猪苓多糖长循环脂质体4批,测定其平均包封率
为98.24%,平均载药量为27.20%。
3讨论
脂质体在酸性和碱性环境中包装率均下降,在
中性条件下脂质体的稳定性较好o],故本实验选用
pH7.0的PBS缓冲液。
本实验以猪苓多糖为对照,计算出猪苓多糖与
葡萄糖的换算因子,再乘以用苯酚一硫酸法测出的葡
萄糖的质量浓度,这样避免了直接用葡萄糖作为对
照引起的系统误差。
猪苓多糖为永溶性药物,同时又是生物大分子,
因此本实验通过正交设计优化处方,采用逆相蒸发
法制备出包封率高、载药量大的大单室脂质体。
猪苓多糖的测定方法一般为分光光度法9]。本实
验建立紫外分光光度一Sephadex法测定脂质体的包
封率,结果猪苓多糖长循环脂质体包封率高、重现性
好。在过Sephadex柱时,洗脱速度和上样量均对分
离效果产生影响。上样量大时,脂质体有拖尾现象,选
取0.5mL可避免拖尾。洗脱速度太快时,凝胶微孔
内外的猪苓多糖来不及平衡提前出峰,造成分离不
好,洗脱峰变宽,故控制流量不大于lraL/min。另外
在测定脂质体中猪苓多糖时,采用空白脂质体作空白
管可以消除脂质体膜材成分对测定的干扰。
万方数据
中革,舂Chine耻TraditionalandHerbalDrugs第38卷第10期2007年10月‘1487‘
PEG在本处方中起抑晶作用o”,同时能包裹猪
苓多糖脂质体,脂质体膜表面引人聚合物分子而形 [5]
成空间稳定性的脂质体。PEG一脂质体表面白蛋白浓
度高达80.0H,具有高度亲水性,有效的保护脂质 [6]
体不被肝脾巨噬细胞吞噬,达到长循环的目的。同
时.PEG一脂质体表面可形成较厚的立体位阻层,也 r71
阻碍了MPS的作用。
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宝泻灵提取物的体外透皮吸收研究
王冬梅,,李静1,徐月红2,唐志1,陈宝2,李欢1
·(1.中山大学药学院天然药物与中药研究所,广东广州510080,2.中山大学药学院
药剂学与射药工程实验室,广东广州 510080)
摘要:目的研究不同透皮促进剂对宝泻灵提取物中各指标性成分体外经皮渗透的影响,筛选出有效的透皮吸
收促进荆。方法采用改良的Franz扩散池,以离体大鼠皮肤为透皮屏障,通过体外透皮实验,用高教液相色谱法
测定不同渗透促进剂对提取物中各指标性成分吴莱萸次碱、丁香酚和肉桂醛的累积渗透量、逢皮渗透速率等体外
透皮吸收动力学参数的影喃。结覃低比例氮酮、以及3%氨酮与不同比例雨二醇联合使用时的累积渗透量均有明
显提高,其中以3%氨酮+10%丙二醇作为复合促进剂时的促謦作用最强。结论通过考察渗透促进剂对宝泻灵提
取物各指标性成分的影响,为研究其透皮给药提供了参考依据。
关键河:宝泻灵提取物,吴茱黄次碱I丁香酚;肉桂醛;透皮吸收;促渗荆
中国分类号;R283.31R286.02 文献标识码:A 文章组号;0253—2670(2007)10—1487—04
InvitrotransdermalabsorptionofBaoxielingextract
WANGDong—meil,LIJin91,XUYue—hon92,TANGZhil,CHENBa02,LIHuanl
(1.InstituteofNaturalProductandTraditionalChineseMedicine.SchoolofP armaceuticalSCiences,SunYat—sen
University.Guangzhou510080,Chinal2.L boratoryofPharmacyandPharmaceuticalEngineering,
SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat·senU iversity,Guangzhou510080,Chins)
Keywords:BaoxielingextractI rutaecarpin;eugenol;cinnamaldehyde}transdermalabsorption}per-
meationenhancers
宝泻灵作为民间验方,在治疗小儿腹泻方面有
很好的『i缶床疗效,由吴茱萸.丁香、肉桂等组成。该验
方为外用散剂,用醋调和后贴敷给药。传统用药方式
存在着粘着力差、药粉易于散落、药膏易于干涸、用
药量大、质量稳定性差、生物利用度不足等缺点。为
了使该验方更好地服务于临床,笔者拟将其开发成
一种新型的透皮制剂。本实验首先对其提取物的透
皮吸收特性进行了研究,以吴茱萸次碱、丁香酚和肉
蛙甍日期:2006一12一ll
荛妻蔷异:里妻砉慧器譬%錾2着!譬炎热麓蓍莒崔辇螺翳勰警‰‰⋯。Unive。ity留学工作,z。。。年至
夸在中山大学生命科学学院和药学院工作,研究方向:天然药物和功能食品的研究,以厦中草药质量标准化研究.
Tel/FaxI(020)87333159 E—mail:isswdm@mail.sysu.edu.cn
万方数据
正交试验优选猪苓多糖长循环脂质体制备工艺的研究
作者: 汪继红, 杨瑞, 范巧娜, 王凯平, 胡明慧, WANG Ji-hong, YANG Rui, FAN Qiao-na
, WANG Kai-ping, HU Ming-hui
作者单位: 华中科技大学同济医学院药学院,湖北,武汉,430030
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(10)
被引用次数: 2次

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10. 王凯平.张玉.张俊.WANG Kai-ping.ZHANG Yu.ZHANG Jun 猪苓多糖长循环脂质体的制备[期刊论文]-中草药
2005,36(3)

引证文献(2条)
1.颜仁梁 正交试验优选黄芩素长循环脂质体制备工艺研究[期刊论文]-江西中医学院学报 2013(1)
2.颜仁梁.刘志刚 黄芩素长循环脂质体处方优化研究[期刊论文]-中药材 2010(1)


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