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老瓜头愈伤组织诱导培养技术的研究
胡海英，叶芳芳
(宁夏大学生命科学学院．宁夏银川750021)
捕要；目的为老瓜头Cynanchumkmnarovii资源利用提供前期的生物技术实验参考。方法以老瓜头的根段、
茎段和叶片为外植体，采用正交试验方法。筛选诱导愈伤组织产生的最适培养基，进行愈伤组织增殖培养过程中。
测定了不同时间愈伤组织的鲜、干质量，绘制愈伤生长曲线；同时进行了愈伤组织分化培养基的实验筛选。结果
不同外植体诱导愈伤产生，其根诱导效果最好，各处理诱导率选90％～100“，茎段和叶片愈伤组织诱导最佳配方
分别为MS+2。4-D1．0mg／L+6-BA2．0mg／L+NAA0．5mg／L和MS+2，4-D0．5mg／L+6-BA0．5mg／L+
NAA0．5mg／L，茎段比叶片较容易诱导，各处理诱导出的愈伤组织质地松散t颜色鲜黄，几乎无褐化现象。愈伤组
织继代生长在第10天进^对数生长期+愈伤鲜生长量最大达4．961g，干质量0．496g。虑伤组织的分化率很低，很
难生芽，易分化出钉状根。结论对于诱导愈伤形成．根段是最佳的外植体，筛选出了茎段和叶片诱导愈伤的最适
配方．禽伤组织生长量较大，但分化困难。
关键词：老瓜头‘愈伤组织；生长量1分化
中国分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)1l一1716—04
InducingandculturingtechnologyofcallusinCynanchurakomarovii
HUHal—ying·YEFang—fang
(schoolfLifeScience．NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China)
Abstract：ObjectiveToprovidethinitiativeexperimentslreferencefor sourceutilizationofCy-
nanchumkomaroviibybiologicaltechnology．MethodsUsingroot，stem，andleafofC．komaroviiasex—
plants，thepropermediaforinducingofcalluswereoptimizedbyorthogonaltest．Inculturingprocessfor
proliferationofcallus，thefreshandryweightsweredeterminedatvarioustimesandcallusgrowthcurve
wasdrawn．Meanwhile，divisiont stofcalluswastaken．ResultsROOtcallustestshowedthebesteffect
insuccessfulinducingpercentageof90％一100％．ThebestmediacombinationofstemandleafwereMS+
2，4-D1．0mg／L+6一BA2．0mg／L+NAA0．5mg／LandMS+2，4-D0．5mg／L+6一BA0．5mg／L+NAA
0．5mg／L．ThestemsegamentwasmoreeasilyinducedthanIear．Thecallusinducedbyvarioustreat-
mentsisinloosecharacterandfreshyellowco]ourwithnobrownphenomenon．Atday10thegrowthen．
teredthexponentperiodofcallusoffspring，themaximalfreshweightto4．961gandthedryweightto
0．496g．Thedivisionrateofcalluswasratherlowandnoteasytoshoot．However，thenailootwastom—
monlyseeni thetest．ConclusionTherootisprovedtobethebestexplantsin hetestofinducingcal—．
1us，whichshowsthebestmediumofstemandleafforformingthecallus．Thegrowthofcallusisbigger，
警銎品翟：挈簧吴￥；热科学基金赍助项目(Ns。；。)
作者简介：胡海英(1976--)，女，硬士，讲师，主要从事植物生物技术方面的研究．E—mail：babying．hu@163．c蛳
万方数据
中革蟊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第11期2007年11月· 717-
buthedivisionisnoteasy．
Keywords：CynanchumkomaroviiA1．Iljinski；callus；growth；differentiation
老瓜头CynanchumkomarcroiiAlIljinski系萝
蘼科鹅绒藤属植物，其别名为牛心朴子、芦芯草、瓢
柴等。老瓜头全草可入药，性温，味苦，有毒。据报道，
老瓜头含有的两种主要生物碱7一脱甲氧娃儿藤次
碱和氧化脱氧娃儿藤次碱均具有细胞毒作用，其体
内化合物牡丹酚在临床上具有镇痛作用，槲皮素具
有抗炎及止咳、祛痰作用“3；又是一种较好的蜜源植
物，其蜂蜜质量为中上等o]。因此，可作为药用资源
利用。老瓜头广泛分布于次生沙漠中的半固定沙丘
和荒漠流沙区。为强早生适阳植物，喜光，极为耐旱，
耐高温。有人认为老瓜头是在沙化进程中，适应其环
境而保存下来的沙漠生态型植物，是土地严重沙质
荒漠化的指示植物之一，也是草原逆行演替过程中
最后阶段的指示种口]。有关老瓜头组织培养方面的
文献报道很少，曲玲等01以其茎段作为外植体，对老
瓜头的组织培养及快繁技术进行了初步研究。本实
验从老瓜头愈伤组织诱导及增殖培养方面人手，对
其愈伤组织最适诱导培养基、愈伤组织增殖生长规
律和愈伤组织的分化3个方面进行了较详细的实验
研究，以其为老瓜头体细胞胚胎发生、细胞成分开发
等生物工程技术奠定基础和提供参考。
1材料与方法
1．1材料：供试材料为老瓜头Cynanchumkomarovii
AI．Iljinski，采自宁夏盐池县郊区野生老瓜头种子。
1．2方法
1．2．1种子处理：选取生长健壮、无病虫害的老瓜头
种子，用肥皂水浸泡，多次冲洗，用无菌水浸泡1～2
h，置于超净操作台，先用75％的酒精消毒1rain后
倒出，倒人0．1％升汞浸没振荡10b12rain，后用无
菌水反复冲洗6～8次，在无菌滤纸上吸于水分。将消
毒好的种子接种在培养基MS+6-BA0．1mg／L+
NAA0．02mg／L+蔗糖30g／L+琼脂6g／L，使其
发芽。
1．2．2愈伤组织的诱导：以老瓜头无菌苗的叶片和
茎段为外植体，接种到愈伤组织诱导培养基，放置在
(24土1)℃温度条件下暗培养，3d后观察现象，生
长一个月后统计愈伤诱导率、颜色、大小、质地等。诱
导培养基以MS为基本培养基，采取正交试验设计，
比较2，4一D(o、0．5、1．0mgfL)，6-BA(O．5、1．0、2．0
mg／L)，NAA(0．05、0．5、1．0mg／L)3种激素3种
质量浓度水平组合对愈伤组织诱导的影响。
1．2．3愈伤组织生长量的测定“]：选取由无菌苗诱
导所得的愈伤组织，要求色泽鲜黄、疏松，无白化、无
褐化状态好的愈伤组织，接种到MS+6-BA2．0
mg／L+2，4一D1．0mg／L+NAA0．5mg／L和
MS+2，4-130．5mg／L+6-BA0．5mg／L+NAA
0．5mg／L增殖培养基上进行增殖培养，20d后选
取色泽鲜黄、疏松的愈伤组织转接到上述增殖效果
较好的培养基中，进行生长量的测定，每5天测其
鲜、干质量，进行5个重复。由此绘出愈伤组织生长
曲线图。培养条件为温度(24士1)℃，暗培养。
1．2．4愈伤组织的分化：选择色泽黄亮、松散易碎
的老瓜头愈伤组织转接到不同激素质量浓度的培养
基中进行分化培养，以MS为基本培养基，采取正交
试验设计比较6一BA(0．5、2．0、4．0mg／L)，KT
(0．2、1．0、2．0mg／L)，NAA(O、0．02、0．1mg／L)3
种激素3种质量浓度水平下对愈伤组织分化的影
响。培养条件为温度(24士1)℃，光照16h／d，光强
3000lx。
愈伤组织鲜、干质量测定方法“]：无菌称取一定
量的愈伤组织接种在新鲜培养基上，每隔5d取出
愈伤组织，称鲜质量，后置于已知质量的滤纸在60
℃恒温烘箱24h左右至恒重．称干质量，重复5次。
1．2．5实验结果统计方法”M：利用SPSS软件对
愈伤组织诱导培养实验数据进行方差分析。利用
Exeell软件绘制愈伤组织生长曲线图。
2结果与讨论
2．1不同激素配比对诱导老瓜头不同外植体产生愈
伤组织的影响：老瓜头的愈伤组织很容易被诱导，以
根和茎段为外植体明显优于叶片。根的茎段材料在不
同培养基上几天后均膨大并逐渐长出突起，30d后
为浅黄，疏松状态的愈伤组织。但在不同培养基中愈
伤组织的形态和质地没有明显的差异。结果见表1。
实验设计9种配方的诱导率差异很大。以根作
为外植体，其诱导率几乎为100％(除1号培养基)。
以茎段为外植体，在3号、7号、9号培养基上诱导培
养，愈伤组织诱导率均达100％·且诱导出的愈伤组
织质地松散，颜色鲜亮，是下一步增殖和悬浮培养的
最佳材料。以叶片为外植体进行愈伤组织诱导效果
较差，最高的诱导率为55．6％。由于对根诱导愈伤
化最为有效，不同浓度激素作用之间无明显差异。不
进行方差分析，只以茎段和叶片为外植体对以上实
万方数据
·1718· 中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第11期2007年11月
裹1不同激素配比对诱导老瓜头斑伤组织的影响
TableEfirectofdifferenthormonescombinations
oninducingforcallusofC-komaro试
验结果进行L9(33)方差分析，分析结果见表2。
直观分析可以比较出3因素的影响力，含有
2，4一D的配方中愈伤组织诱导率较高，只含有6-BA
和NAA两种激素的配方中，激素质量浓度越低，其
诱导率就越低。用方差分析的方法可知：在实验所选
的水平范围内，在显著性水平口=0．05下因素
2，4-D、6一BA、NAA对实验指标均无显著影响。在这
个过程中，3种激素的重要性主次顺序为2，4一D>6一
BA>NAA，通过重复实验，综合因素考虑，将2，4一D
1．0rag／L+6一BA2．0mg／L+NAA0．5mg／L作为
诱导茎段愈伤产生最适培养基；诱导叶片愈伤化的适
宜培养为2，4一D0．5mg／L+6-BA0．5mg／L+
NAA0．5mg／L。
裹2不同激素配比对诱导老瓜头茎段，叶片愈伤组织的
影响方差分析表
Tahie2 Varianceanalysisofdifferenthormonecombina—
tionsoncallusof temandleafofC．komarovii
2，4-D
6-BA
NAA
误差
总和
189O 9451．438
15817901．203
2331165 1．773
13l4 657
71l8
1305 6521．291
2741370．27l
1018 5091 007
101 505
3610
Foos(2·2)=19·00·FDol‘z，2)=99·01
2．2老瓜头愈伤组织生长量的测定：经诱导培养
后，所得愈伤组织在培养基2，4一D1．0mg／L+6一
BA2．0mg／L+NAA0．5mg／L上进行增殖培养。
同时进行愈伤组织生长量的测定并以此绘制愈伤组
织生长曲线。测定不同培养时间的愈伤组织鲜、干质
量，以培养时间为横坐标，分别以细胞的鲜质量和干
质量为纵坐标绘制愈伤组织生长曲线图。见图1。
从图1可见，老瓜头愈伤组织生长增重的变化
嘲
世
蛰
《
积
蛆
锚
■
峰
H_
《
g
啦
铂
帮乔时间／d
围1不同培养时间老瓜头血伤组织的生长情况
Fig．1CallasgrowthofC．komarovii
Indifferentcul uringt mes
情况表现为S形曲线，第1周愈伤细胞生长相对滞
后，生长缓慢，在1周后，愈伤组织增殖明显，约第
10天才进人对数生长期；尤其在第2周至第3周愈
伤组织生长最快，几乎呈现直线生长。愈伤鲜生长量
达到4．961g，干质量达0．496g。经过第30d后，由
于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒
代谢产物的积累H]，增长逐渐缓慢，最后进入静止
期，增长几乎停滞。所以，通过对老瓜头愈伤组织增
殖培养可以初步确定其增殖生长规律，即35d为一
生长增殖周期，在30d左右应尽快进行继代培养；
若要保持旺盛增殖，可在3周后继代，使愈伤细胞一
直保持对数生长口]。
2．3老瓜头愈伤组织的分化：老瓜头外植体诱导出
愈伤组织，经过1次继代培养后，设计了愈伤组织分
化实验。共设计3种因素3个水平，现象表明，老瓜
头愈伤组织不易分化成芽，出现了略泛红色的钉状
根，只有一种处理分化出2株芽。30d后统计结果，
见表3。一
衰3不同激素配比对老瓜头敷伤组织分化的影响
Table3 Effectofdlfferenthormonecombinations
oDcallusdifferentiationofC．komarovii
对结果分析表明，6-BA、KT、NAA3因子在设
计的3种质量浓度水平下对愈伤组织分化根和芽
中，3种激素影响均不显著。可见设计的激素种类和
万方数据
中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第11期2007年11月·17 9·
质量浓度水平未能达到预期结果，为了获得愈伤分
化再生植株，设计将分化出的钉状根上诱导芽再生。
或者对愈伤组织直接分化出丛生芽的培养基激素和
浓度水平做进一步的筛选试验口]。
3讨论
用采来的老瓜头植株的叶片和茎段做外植体，
通过表面消毒，可以获得无菌材料，但再生芽的生长
速度慢，丛生芽容易玻璃化，用无菌播种的方法获得
的材料，植株生长快而旺盛，实生根发达，进行老瓜
头愈伤组织的诱导可操作性强，而且不受污染的影
响，大大提高了诱导率。本实验中以根和茎段作为外
植体，加入适量的激素配比，很容易诱导出愈伤组
织，且愈伤组织状态比较好，在诱导过程中无褐化现
象发生，其增殖的生长量较大，在25d后仍然呈现
淡黄鲜亮疏松状态，增殖时问过长会有絮状老化、黄
褐色的现象发生。在实验中发现，愈伤组织能够分化
出钉状根，钉状根放到只有IBA的培养基上，伸长
很快，呈盘曲状。从很多研究文献中发现老瓜头的根
系发达，主要的有效成分来自于根部。通过以上实验
结果及现象，认为可以从老瓜头的根人手，深人研究
其根段产生的愈伤组织有效成分的量，而且可以设
计用毛状根的培养方法进一步研究其发根的有效成
分组成及量，最终为开发利用野生老瓜头资源提供
技术手段和理论基础。
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长春花突变细胞生理特征的研究
张秀省1，聂莉莉2，向蓓蓓2。王淑芳2，朱晔荣，王勇2
(1．聊城大学农学院，山东聊城252000s2．南开大学生命科学学院，天津300071)
摘要：目的研究以秋水仙碱处理的长春花突变细胞在继代培养过程中的生长规律，吲哚生物碱积累的规律及
营养成分的适宜浓度等方面的特征．期望得到适于工业化细胞培养的理想材料。方法将突变细胞培养于MS固
体培养基上，定期称取其鲜质量，用有机溶剂萃取吲哚生物碱，应用RP—HPLC法检测药用成分阿玛碱和长春质碱。
结果 突变细胞培养至第30代时，生长速度和吲哚总碱积累得最快，培养至第45代时，两者均明显下降。而药用
成分的量于第20代达到最高；在培养基中添加适量的色氨酸能提高药用成分的量；培养基中ca抖和zn件的质量
浓度分别为1760和12．6mg／L时，明显促进了药用成分的积累。结论长春花突变细胞可能是一种适于工业化
细胞培养的理想材料。
美键词：长春花；突变细胞；阿玛碱；长春质碱
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)11—1719—04
Physiologicalchar ctersofCatharanthusrosemutantcells
ZHANGXiu—shen91，NIELi—li2，XIANGBei—bei2，WANGShu—fan92，ZHUYe—ron92·WANGYon92
(1．CollegeofAgronomy，LiaochengUniversity，Liaocheng252000，China2．CollegeofLifeScience，
NankaiUn versity，Tianjin300071，China)
譬鍪是留；翟紧署蔷甚攻关项目(2005GG4402011)，南开大学科技刨新基金
*通讯作者朱晔荣E—mail：zhuyr@吐tlk缸．edu-cnTel：(022)23504382
万方数据
老瓜头愈伤组织诱导培养技术的研究
作者： 胡海英， 叶芳芳， HU Hai-ying， YE Fang-fang
作者单位： 宁夏大学生命科学学院,宁夏,银川,750021
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(11)
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