全 文 ：·综述·
美洲商陆抗病毒蛋白及其在艾滋病治疗中的应用
林爱玉 ,王秋颖
⒇
(中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京 100094)
摘　要: 美洲商陆抗病毒蛋白是一种天然的广谱抗病毒试剂 ,其抗 HIV活性 ,已引起国内外学者的广泛兴趣和重
视。 旨在综述美洲商陆抗病毒蛋白的结构、核糖体失活活性、抗病毒活性及其在艾滋病治疗中的应用 ,并展望其在
临床上的应用前景。
关键词: 美洲商陆抗病毒蛋白 ( PAP) ;核糖体失活蛋白 ( RIP);抗病毒活性 ;艾滋病
中图分类号: R286. 87　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 09 附 3 04
Pokeweed antiviral protein and its therapeutic application to AIDS
LIN Ai-yu, WANG Qiu-ying
( Institute of Medicinal Plant, CAM S and PUM C, Beijing 100094, China)
Key words: pokew eed antiv iral pro tein ( PAP) ; ribo some-inactiv ating protein ( RIP) ; antiv iral activi-
ty; AIDS
　　美洲商陆抗病毒蛋白 ( PAP)分离于美洲商陆 ,相对分子
质量约 3× 104 ,是一种单链核糖体失活蛋白 ( RIP ) ,有多种
类型 ,即 PAP I, PAP II, PAP I II, PAP-S, PAP-R和 PAP-
C,分别分离自春天、初夏、晚夏的叶子、种子、根和细胞培养
物 ,都显示了高特异性的 RN A N -糖苷酶活性 ,可催化切割
真核和原核核糖体大 rRN A中高度保守的 SRL ( sarcin-ricin
loop)上的四环 GAGA的腺嘌呤碱基的 N -糖苷键 ,脱去一
个腺嘌呤碱基。 SRL脱嘌呤后 ,核糖体构象发生改变 ,从而
影响了 EF1-氨酰 t RN A和 EF2-GTP与核糖体的结合 ,导致
蛋白质合成过程中移位阶段的不可逆抑制。
PAP是一种天然的广谱抗病毒试剂 ,能抗多种植物和
动物病毒 ,在不抑制寄主细胞蛋白质合成的浓度下就可有效
地抑制病毒的复制 ,特别是由于其抗 HIV活性 ,已引起国内
外学者的广泛兴趣和重视 ,对治疗 AIDS可能有广泛的应用
前景。
1　结构
　　结构 X射线衍射分析 , PAP由 8个α-螺旋和 1个六链
β -折叠组成 ,形成 3个结构域: N -端结构域 ( 1-69aa残基 )、中
心结构域 ( 70-179 aa残基 )和 C-端结构域 ( 180-262 aa残
基 ) [1]。中心结构域包含酶的所有活性催化残基: Ty r72,
Ty r123, Glu176, Arg179,且在 RIP中是高度保守的。 经结
构和生化分析表明 , Ty r72和 Tyr123将底物 rRNA的腺嘌
呤环夹在中间 (三明治状 ) ,至少形成 4个氢键 ,形成能量有
利的堆积构象 ,而 Glu176和 Arg179则直接催化 SRL的脱
腺嘌呤作用。
在中心结构域和 C-端结构域的连接面有一个明显的罅
隙 ,能容纳底物 rRNA分子 ,这与 RN A和核糖体蛋白 L3
( RPL3)的结合有关。 Ra jamohan等 [2]应用分子模型 ( PAP-
RNA复合物 )研究、定点诱变 ,结合生物测定来评价催化位
点和活性中心罅隙残基对 rRN A脱嘌呤的重要性。直接参与
脱嘌呤的 Ty r72, Ty r123, Glu176, Arg179的 Ala替代导致
其活性下降 3个数量级 ;同样 ,保守的活性位点残基 T rp208
的 Ala替代 ,其活性也下降 3个数量级 ,这可能是由于其与
底物 RNA的磷酸骨架形成的氢键的不稳定及与核糖体疏
水相互作用的不稳定造成的。罅隙残基的 Ala替代也明显地
影响 rRNA的脱嘌呤活性。
2　核糖体失活活性
　　 PAP催化切割真核和原核核糖体大 rRN A中高度保守
的 SRL上的四环 GAGA的腺嘌呤碱基的 N -糖苷键 ,脱去
一个腺嘌呤碱基后 ,核糖体构象发生改变 ,从而影响了 EF1-
氨酰 t RNA和 EF2-GT P与核糖体的结合 ,导致蛋白质合成
过程中移位阶段的不可逆抑制。 RN A N -糖苷酶活性经历 3
个步骤:底物 rRN A的识别、结合和特异 N -糖苷键的断裂。
2. 1　识别:几乎所有的 RIP对裸露的 28S rRN A有相同的
脱嘌呤活性水平 ,但对完整的核糖体则显示出不同的活性水
平。 对于 PAP来说 ,与完整的核糖体相比 ,它对裸露的
rRN A的脱嘌呤活性下降了 3个数量级。 这说明在 RIP-
rRN A相互作用过程中核糖体因素起重要作用 ,即 r RN A和
RIP与核糖体蛋白之间的相互识别和相互作用。
诱导酵母体内 RAP表达后产生抑制细胞生长的效应 ,
可能是由于 PAP表达后翻译被抑制 [3]。但由于 PAP的底物
SRL接近肽酰转移酶中心 ,与肽酰转移反应有关的核糖体
蛋白突变可能抗 PAP的抑制细胞生长的效应。 核糖体蛋白
RPL3则参与肽酰转移酶中心的形成 ,而且是催化肽键形成
　　　　　　　　中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月　　　　　　· 附 3·
⒇ 收稿日期: 2002-12-02作者简介:林爱玉 ( 1977— ) ,女 ,浙江象山人 ,在读博士生 ,专业为生药学 ,研究方向为药用真菌分子生物学。
的一个必要蛋白。 Hudak等 [4]发现酵母中含 RPL3的 Mak8-
1等位基因的突变株具有抗 PAP效应 ,这是由于这种细胞
的核糖体不与 PAP结合 ,因此不能脱嘌呤 ,而在野生型酵母
中 PAP表达并脱嘌呤 ,这说明野生型核糖体蛋白 RPL3对
核糖体脱嘌呤是必要的。 共免疫沉淀实验证明在体外 PAP
直接与 RPL3和 Mak8-1p相结合 ,然而用完整的核糖体时 ,
PAP只与野生型 RPL3而不与 Mak8-1p相结合 ,这说明
PAP不与核糖体中的 Mak8-1p相互作用。Mak8-1基因编码
的突变型 RPL3与野生型只有两个氨基酸的不同即 W255C
和 P257S,但这足以改变蛋白质形状 ,从而影响其与核糖体
其他成分的相互作用 ,因此改变了核糖体的四级结构 ,掩盖
了 PAP的结合位点。另外 , RPL3和 Mak8-1p翻译后修饰的
不同也可能影响其在体内与 PAP的相互作用。 PAP结合于
核糖体需要野生型 RPL3的参与 ,故认为 RPL3是一种位于
核糖体肽酰转移酶中心的高度保守的蛋白质 ,涉及到 PAP
与核糖体的结合及随后的 SRL的脱嘌呤。 而在表达突变型
RPL3的酵母细胞中核糖体不脱嘌呤 ,这说明 PAP与 RPL3
的相互作用对于其结合于核糖体并通过脱嘌呤使其失活是
必要的 ,首次证明 RPL3为 PAP提供了一个受体结合位点 ,
即 PAP通过识别并结合于 RPL3而接近核糖体。因为 RPL3
在不同种核糖体中是高度保守的 ,因此 PAP与 RPL3的相
互作用可能是 PAP广谱抗核糖体活性的重要原因。
2. 2　结合: PAP活性位点残基的 Ala替代导致其活性下降
3个数量级 ,罅隙残基的 Ala替代也明显地影响 rRNA的脱
腺嘌呤 ( 69NN70替代 ,其活性下降 191倍 ; 90FND92替代 ,
其活性下降 352位 ) ,而远离活性位点和罅隙残基的 Ala替
代则对 PAP的活性无多大影响。由此提出一个假说 ,活性中
心罅隙的高度保守的带电的极性残基通过静电相互作用使
底物 rRNA正确定位并稳定结合于活性位点的口袋中。为了
进一步了解罅隙残基对 rRN A脱嘌呤的分子基础。 Rajamo-
ha等 [5]应用定点诱变、表面等离子体共振技术分析了突变
PAP与 SRL的结合状况。 与野生型 PAP相比 , FLP-4
( 69AA70)和 FLP-7( 90AAA92)与底物 rRNA的亲和力大
大降低 ,这解释了它们脱嘌呤活性的下降。 相似地 , FLP-9
( 122AA123)影响底物在活性位点的定位 ,与 rRNA的结合
亲和力下降 ; 催化位点突变 FLP-12 ( Ala179)和 FLP-13
( Ala208)与 rRNA的结合亲和力也下降 ,这与以前认为的
Arg179和 T rp208在 rRN A结合与脱嘌呤中具有重要性相
一致。 相比之下 ,远离活性位点和罅隙残基的 Ala替代如
FLP-1 ( 28 AA29)和 FLP-8( 111AA112)则显示出正常的
rRN A结合亲和力 [1]。由此可看出 ,除了催化位点 ,罅隙也参
与了 PAP与 rRN A四环结构的结合。
根据 PAP-RNA茎环复合物的分子模型 [5] , PAP罅隙
残基 43, 67(与 97残基配对 ) , 69, 70, 92, 206-210, 212-213,
217, 224-225和 253-255参与其与 rRNA的相互作用 ,其中
Asn69, Asn70, Asp92与活性位点残基 Arg122则特异地与
rRN A的 SRL环的磷酸骨架相互作用 ,即有一半的罅隙残
基与 SRL相结合 ,而组成四环区的另一半残基包括 40-44,
69-70, 91-96和 120-122则部分与 SRL结合 ,部分暴露于溶
剂环境中 ,推测这些部位暴露的罅隙残基可能与 RPL3的结
合有关。 经模型研究 [6] ,证明罅隙残基 69-70, 90-96和 118-
120与 RPL3相互作用。因此 ,这些残基的突变导致 PAP与
RPL3结合亲和力的下降和 PAP与 rRN A结合的不稳定。
单氨基酸的突变结果进一步证实了罅隙在 PAP-rRNA和
PAP-RPL3相互作用中的重要性。 RPL3与 r RN A结合可稳
定其构象 ,以使 SRL能有效地与 PAP结合并反应。 因此 ,
RPL3, r RN A和 PAP并不是独立存在的 ,它们形成一个完
整的复合物 ,即 RPL3-PAP-rRNA ,并有一个重叠结合区。
2. 3　脱嘌呤: 根据底物类似物与 RIP形成的结晶结构以及
生化实验 ,曾先后提出 3种脱嘌呤机制的假说: 其一 ,
A rg179的 Ala替代使活性严重下降 ,而 Lys替代则活性只
下降了 4倍 ,说明该位点的正电荷对其活性是必要的。
Arg179使腺嘌呤环上的 N3质子化 ,引起腺嘌呤环内电子的
转移 ,最终导致 N9-C1糖苷键的断裂。糖苷键断裂后 ,核糖带
正电 ,通过酸性氨基酸 Glu176使之稳定 ;腺嘌呤环的负电通
过 Arg179对 N3的质子化来稳定 , A rg质子化 N3后 ,增强了
其侧链的碱性 ,可从 H2O分子中吸引一个质子 ,这样产生一
个氢氧根离子亲核攻击核糖 C1 ,从而释放一个腺嘌呤碱
基 [7 ]。 其二 , Ren等 [8]提出糖苷键的变弱并不是直接由质子
化引起的 ,而是由于在腺嘌呤核苷酸中核糖以高能量构象存
在。 Arg179通过中和腺嘌呤环的负电荷而稳定过渡态。 其
三 , Huang等 [9]提出一个典型的酸催化机制: 活性中心酸性
氨基酸残基 Asp92通过 Ser121使腺嘌呤环 N 7质子化 ,构象
变化和电子转移最终导致 N-C键的断裂 ,同时 C1与 H2O分
子间形成新的键。 反应后 ,蛋白质原子和核糖原子间的范德
华力使修饰后的核糖体离开活性中心。而腺嘌呤碱基与蛋白
质结合较紧 ,推测可能是下一个核糖体接近 RIP后引起的
构象改变导致了腺嘌呤碱基的释放。 Poyet等 [10]应用定点诱
变分析 PAP II的活性位点残基 ,却发现以上的 3种机制没
有一种能完全解释所得到的实验结果 ,因此对于这种酶的催
化活性还有待于做更深入的研究。
3　抗病毒活性
　　 PAP对 TMV、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒和
HIV等病毒都有抑制作用。 PAP与 mAb (识别 CD4、 CD5、
CD7)的结合物在无细胞毒性浓度下可有效抑制正常 T细胞
中 HIV-1的复制 [11]。因此 , PAP的抗病毒活性 ,尤其是其抗
HIV的活性 ,仅用 RIP活性来解释是不够的。
最近发现 PAP对含腺嘌呤碱基的多聚核苷酸、单链
DNA和双链 DNA都有脱嘌呤作用 ,因此 PAP的脱嘌呤活
性可能并不限于 rRN A的 SRL环。 Rajamohan等 [12 ]应用
HPLC检测到了从病毒 RNA释放的腺嘌呤碱基 ,证明了
PAP对 HIV-1、植物病毒 ( TMV )和噬菌体 ( MS2)的基因组
RNA浓度依赖性脱嘌呤 ,即 PAP能识别病毒 RN A并使其
脱嘌呤。虽然 RT A在无细胞翻译体系中与 PAP一样抑制蛋
白质的合成 ,但即使在 RTA的浓度为 5μmo l / L时也没有检
测到病毒 RN A的脱嘌呤。 在人的外周血单核细胞 ( PBMC)
· 附 4· 　　　　　　中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月　　　　　　　　
中 PAP I, PAP II, PAP II I抑制 HIV-1复制的 IC50分别为
17, 25, 16 nmol /L。 这些结果说明单凭与 rRNA脱嘌呤有
关的 PAP或 RT A高度保守的活性位点残基对病毒 RN A
的识别和脱嘌呤是不够的 , PAP潜在的抗病毒活性可能部
分是由于其独特的对病毒 RN A的脱嘌呤能力 (包括 HIV-1
的 RNA)。
三核苷酸 GGG在 RNA N -糖苷酶 PAP脱嘌呤活性位
点的分子模型研究表明鸟嘌呤碱基进入 PAP的活性位点的
口袋中并不影响其独特的构象 ,鸟嘌呤碱基被夹在 Tyr72和
Ty r123中间 ,与腺嘌呤碱基很像。鸟嘌呤碱基与活性位点残
基 Ser121和 Va173形成两个独特的氢键。 带负电的磷酸基
团与 PAP表面的两个正电荷族 (一面的 Lys210和 Arg179,
另一面的 Arg122和 Arg135)通过静电相互作用使之稳定。
rRN A和 HIV-1 RN A经纯化的重组 PAP处理后 ,可用
HPLC检测到鸟嘌呤碱基的释放。 重组 PAP对 HIV-1的腺
嘌呤碱基和鸟嘌呤碱基的释放比为 1∶ 1,而对 E. co li rRN A
的则约为 3∶ 1,这说明 PAP的 RN A脱嘌呤活性可能不仅
仅限于腺嘌呤碱基 ,它还能脱 rRN A和病毒 RNA的鸟嘌呤
碱基 [13 ]。所以 PAP潜在的抗 HIV-1活性可能部分由于目前
并不了解的对病毒 RNA的脱鸟嘌呤活性。
另外 , PAP的 C-端缺失突变抑制病毒感染 ,但不使寄主
核糖体脱嘌呤 [14] ,所以 PAP的抗病毒活性可能不是由于对
寄主核糖体的脱嘌呤。 应用 PAP突变发现 PAP抑制 BWV
和 PVX的翻译 ,但其核糖体并没有脱嘌呤。通过增加帽子类
似物 m 7GpppG(而不是 Gppp G或 GT P)的浓度可去除 PAP
对 BMV RN A的翻译抑制 ,说明 PAP识别帽子结构。 进一
步研究 PAP处理 BMV RNA或加帽的虫荧光素酶转录产
物时 ,导致 RNA脱嘌呤 ;相反 ,在此浓度下 ,未加帽的虫荧
光素酶的转录产物则不脱嘌呤 [15 ]。 这些结果首次证明 PAP
能通过识别帽子结构并特异地使带帽子的 RN A脱嘌呤 (不
是通过使核糖体脱嘌呤 )而抑制翻译。
4　在 AIDS治疗中的应用
　　 PAP在抗 HIV-1活性是由于其独特的抑制病毒蛋白的
合成和具有使 HIV RN A脱嘌呤的能力。 PAP抑制 HIV-1
的繁殖 ,与胞内 HIV-1蛋白质的水平下降有关 [16]。利用植物
凝集素刺激来自血清阴性的 PBMC,然后感染 HIV-1,用此
系统研究 PAP-S的抗病毒活性 ,发现 PAP-S能明显地降低
感染细胞中逆转录酶的活性和 p24核心蛋白的表达 ,其抗
HIV活性可与 AZT相比 [17 ]。作用机制要求在病毒感染之前
或感染过程中有 PAP的存在。 PAP能抑制缺少逆转录酶的
病毒复制 ,感染后用 PAP或 PAP-m Ab处理 1 d,并不降低
其功效 ,因此 PAP并不是在感染的早期抑制 HIV-1的复
制。虽然 PAP在体外可使核糖体 60S亚基失活 ,抑制多肽的
延伸 ,但抑制 HIV-1抗原产生的浓度低于抑制正常 CD4+ T
细胞增殖的浓度 [16] ,这说明 PAP的抗 HIV活性不仅仅是由
于其核糖体特异的 N -糖苷酶活性。 除了能抑制病毒蛋白质
的合成外 , PAP还能直接使病毒 RN A脱嘌呤。
HIV进入细胞并开始复制是从病毒包膜蛋白 gp120识
别并与细胞表面上的 CD4受体蛋白结合开始的 ,因此以
CD4为靶点的抗病毒试剂在对预防感染和抑制 HIV-1的繁
殖上有潜在的应用价值。有报道 PAP能抑制正常初级 CD4+
T细胞中 HIV-1的复制 ,若 PAP通过单克隆抗体 (抗 CD4+
细胞中表达的 CD4, CD5, CD7)与 CD4+ T细胞结合 ,则可
大大提高其抗病毒活性及对细胞的选择性 ,其抗 HIV能力
增加了 1 000倍 [11 ]。 PAP免疫结合物在 1 pmo l / L浓度下就
能抑制 HIV-1的复制 ,而此浓度不会抑制正常 CD4+ T细胞
的增殖和依赖 CD分子的反应 ,因此 PAP-anti-CD4仅与细
胞表面 CD4分子的 3%相结合 ,不会抑制一些依赖 CD4的
生物效应。单独 PAP的半衰期小于 30 min,而 PAP-m Ab的
则为 16～ 18 h [11] ,而且 PAP-anti-CD4抑制血清阳性病人
CD4+ T细胞的 HIV-1的复制 ,用 5 pmol /L的 PAP-anti-
CD4处理病人的 CD4+ 细胞 ,在 22 d内均可抑制 HIV-1的
复制 [18 ]。因此 PAP-anti-CD4在对 HIV-1感染的病人的治疗
上更有应用前景。
通过 CD4+ 细胞正常抗原的单克隆抗体将抗病毒试剂
PAP靶向没有感染或潜伏感染的 CD4+ 细胞的方法与其他
新方法 (依赖感染细胞中 HIV-1表面抗原 gp41或 gp120的
表达不同 ) ,避免了由于不同分离得来的 HIV-1表面抗原的
多样性或血浆抗表面蛋白抗体的存在所引起的潜在问题。将
这种免疫结合物应用于临床治疗可能会提高对 AIDS病人
的诊疗 ,但是对 mAb及免疫结合物的毒素部分的体液免疫
反应限制了它们在临床上的应用。 TXU-PAP处理过的猴子
则产生抗 PAP及抗鼠 IgG的抗体 [19]。通过检测 TXU ( anti-
CD7) -PAP的体外及在人类 AIDS的替代 Hu-PBL-SCID鼠
模型中的抗 HIV-1活性来评估其作为一种新的生物治疗抗
HIV试剂的临床应用潜力。 显示 TX U-PAP在猕猴耐药力
的剂量下对 AIDS的 Hu-PBL-SCID鼠模型有潜在的抗
HIV-1活性 ,并且无任何副作用 ,说明 TXU-PAP是一种有
潜力的无毒抗 HIV试剂。 TXU-PAP处理过的猕猴的血浆
样品也显示了体外抗 HIV-1活性 [20 ]。
即使浓度为抗 HIV-1的 IC50的 2 000倍时 , PAP对精子
和正常的女性生殖道皮膜细胞都没有毒性。而且 , PAP处理
后 ,对精子在宫颈黏液中的游动或体内精卵的结合和融合无
不利影响 [21]。 以白兔为模型 ,对 PAP处理过的精液进行人
工授精 ,结果对怀孕率、妊娠期长短、围产期结果及后代的成
长发育没有不利影响 [22]。因此 ,在一方感染 HIV-1的夫妇的
辅助生殖中 , PAP可作为一种安全的预防性的抗病毒试剂。
5　展望
　　鉴于 PAP对一些其他的人类病毒也有抑制活性 ,所以
PAP-mAb对治疗其他的病毒病有潜在的临床应用价值。目
前已克隆了 PAP的 cDN A,并分别在细菌和酵母细胞中表
达了具有生物活性的重组 PAP[23～ 25 ]。重组 PAP的获得为大
规模生产临床应用的 PAP提供了基础 ,并可对这种有希望
的无毒抗病毒试剂作更深入的研究和开发。
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药用紫草的研究进展
葛　锋 ,王晓东 ,王玉春⒇
(中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室 ,北京　 100080)
摘　要: 对药用紫草的研究状况 ,包括自然资源状况、有效成分的分离和提纯、紫草素及其衍生物的生物合成途径、
药理研究现状以及植物细胞工程运用于紫草的研究进展进行综述 ,并对药用紫草今后研究发展的方向作了展望。
关键词: 新疆紫草 ;硬紫草 ;滇紫草 ;紫草素 ;植物细胞工程
中图分类号: R282. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 09 附 6 05
· 附 6· 　　　　　　中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月　　　　　　　　
⒇ 收稿日期: 2002-12-05基金项目: “十五”国家攻关项目 ( 2001BA701A10)作者简介:葛　锋 ( 1979— ) ,男 ,云南昆明人 ,中国科学院过程工程所在读研究生 ,主要从事植物细胞工程。 Tel: 010-82627059
* 通讯作者