全 文 ：表 2　 TMP和丹参对 Lewis肺癌小鼠移植瘤组织
MVD及 VEGF表达的影响 (x± s, n= 10)
Table 2　 Ef fect of TMP and DS on MVD and expression
of VEGF of tumor tissue in mice with Lewis
lung carcinoma ( x± s , n= 10)
组　别 剂量 / ( g· kg- 1) MV D /(个·视野 - 1 ) V EG F (A值 )
生理盐水 　　 - 27. 17± 7. 97 0. 63± 0. 08
TM P 　　 0. 050 14. 32± 9. 11* 0. 45± 0. 07*
0. 100 12. 27± 11. 19* 0. 44± 0. 06*
0. 200 13. 01± 8. 34* 0. 51± 0. 08*
丹参 5 25. 44± 11. 23 0. 63± 0. 05
10 24. 97± 8. 85 0. 61± 0. 06
20 26. 99± 13. 01 0. 62± 0. 05
鱼精蛋白 0. 060 11. 31± 12. 24* * 0. 59± 0. 06
　　与生理盐水组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs NS group
并形成了丰富的新生血管 ,从而促进了肿瘤的生长
和肺转移。
肿瘤属于中医“ 瘕”范畴 ,运用活血化瘀法及
其方药治疗肿瘤已被公认。 但有关中药抗肿瘤机制
中 ,抗血管生成的研究报道不多。本实验显示 ,在给
予 TM P治疗后 , Lewis肺癌的体积、质量、MVD和
肺转移灶数均显著降低 ,证明 TM P有抗肿瘤生长
和转移的作用。同时本研究首次表明 , TM P可抑制
肿瘤血管生成 ,降低 MVD,抑制 V EGF的表达 ,说
明 TM P抗肿瘤生长和转移的作用与其抑制肿瘤血
管生成 ,降低肿瘤 MVD密切相关 ,其确切机制很可
能是通过抑制 V EGF的表达来实现的。
实验结果还表明 ,给予鱼精蛋白后 ,虽然肿瘤的
生长和转移均受到了显著抑制 ,但是肿瘤细胞分泌
的 V EGF与模型组相比并没有显著差异 ,这与既往
的研究是一致的。鱼精蛋白作为一种抗血管生成剂 ,
其机制并非是抑制 V EGF的产生 ,而是阻碍 V EGF
与其受体结合而抑制 V EGF的生物功能的实现 [7 ]。
眭建 [4 ]、张培彤 [8 ]等通过体外细胞实验证实 ,丹
参素和丹参酮Ⅱ A均有一定的抗肿瘤活性。本实验
所用的丹参注射液是以丹参素为主的水溶性成分 ,
结果显示其对 Lew is肺癌小鼠移植瘤生长和肺转
移无明显抑制作用 ,对肿瘤 MVD和 V EGF的分泌
亦无明显影响。这一现象再次表明 ,体外细胞实验与
体内实体瘤模型实验存在着较大的区别。其原因可
能是 ,体外实验的药物浓度通常较高 ,体内很难达到
如此高浓度 ;体外实验影响因素单一 ,而体内用药干
预因素较多等。 动物实体瘤模型实验更接近于人体
的实际情况 ,或许更有参考价值。
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益气平悬饮对艾氏腹水癌小鼠肿瘤浸润淋巴细胞杀伤活性的影响
黄立中 ,伍参荣 ,肖　雅 ,何　欣 ,唐小梅 ,王大安
(湖南中医学院 ,湖南 长沙　 410007)
摘　要:目的　探讨益气平悬饮对肿瘤浸润淋巴细胞 ( tumo r-infiltrating lymphocy tes, T IL) 杀伤自体肿瘤细胞
( a nto-tumo r cells, ATC)活性的影响。方法　取昆明种小鼠 40只 ,腹腔接种艾氏腹水癌瘤株 ( EAC)瘤液建立移
植瘤模型 ,接种次日随机分为 4组: 益气平悬饮大、小剂量 ( 37. 0, 18. 5 g /kg )组、环磷酰胺对照组、模型对照组。益
气平悬饮大、小剂量组当日 ig给药 ,共给药 9 d,环磷酰胺组 ip环磷酰胺 75 mg /kg ,自接种第 3日起 ,隔日给药 ,共
·299·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 35卷第 3期 2004年 3月
收稿日期: 2003-07-17基金项目:国家中医药管理局基金资助 ( 02-03 JP30) ; 湖南省自然科学基金资助 ( 01J J2037)作者简介:黄立中 ( 1956— ) ,男 ,河北抚宁人 ,医学博士 ,副教授 ,副主任医师 ,硕士研究生导师 ,主要从事肿瘤的中医药防治研究。
E-mai l: HLZ992002@ 163. com
4次。末次给药次日 ,无菌抽取 EAC小鼠腹水 ,用不连续密度梯度离心收集 T IL作为效应细胞 ,分离出 ATC作为
靶细胞 ,培养液中培养 ,效靶比为 10∶ 1,以 M TT法计算细胞杀伤活性。并在光镜下观察混合培养 2, 4, 10, 14, 24 h
细胞形态学变化。 结果　益气平悬饮大、小剂量组 T IL杀伤活性均高于模型对照组 ,差异显著 (P < 0. 05)。 结论
益气平悬饮能提高 T IL杀伤 ATC的活性。
关键词: 益气平悬饮 ; 癌性胸水 ; 肿瘤浸润淋巴细胞 ; 自体肿瘤细胞
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 03 0299 03
Influence of Qi-boosting and Suspended Rheum-dispersing Beverage on killing activity
of tumor-infiltrating lymphocytes to auto-tumor cells in EACmice
HUANG Li-zhong, WU Can-rong , X IAO Ya, HE Xin, TAN G Xiao-mei , WANG Da-an
( Hunan Co lleg e of T raditional Chinese Medicine, Chang sha 410007, China )
Key words: Qi-boosting and Suspended Rheum-dispersing Beverage ( QBSRDB) ; malignant pleural ef-
fusion; tumo r infi lt rating lymphocytes ( TIL) ; auto-tumo r cells ( A TC)
　　肺癌合并癌性胸水病人意味着病变已局部或全
身播散 ,生存期多在 6个月以内 ,而肺癌癌性胸水
患者中位生存期仅 2. 2个月 [1 ]。因此 ,积极探讨更有
效的治疗方法 ,对改善病人生活质量 ,延长生命具有
重要意义。本实验对具有益气蠲饮、行气散结作用的
益气平悬饮 ( QBSRDB)影响艾氏腹水癌肿瘤浸润
淋巴细胞 ( tumo r inf ilt rating lymphocy tes, TIL )
杀伤自体肿瘤细胞 ( auto-tumo r cel ls, ATC)的作
用进行研究 ,寻找治疗肺癌癌性胸水的药物。
1　材料
1. 1　动物与瘤株: 昆明种小鼠 ,雌雄各半 , 18～ 22
g ,本院实验动物中心提供。艾氏腹水癌 ( EAC)瘤
株 ,购自中山大学肿瘤研究所。
1. 2　药物与试剂:益气平悬饮处方由人参、生黄芪、
椒目、葶苈子、瓜蒌壳、半夏、刺蒺藜等组成。从本院
第一附属医院一次购回 ,经中药教研室鉴定后 ,三蒸
水浸泡 4 h ,煮沸 25 min,滤过 , 50℃ 水浴中浓缩成
含生药 2 g /mL的药液。RPM I1640 ( Gibco ,美国 ) ,
小鼠淋巴细胞分离液、肿瘤细胞分离液 (天津市灏
洋生物制品科技有限公司 ) ;四甲基偶氮唑盐、二甲
基亚砜 ( DM SO, Sigma, 美国 )。
1. 3　主要仪器: M K3全自动酶标仪 (芬兰 ) , SW—
CJ— IF超净工作台 (苏州净化设备厂 ) , CJ— 1088
CO2培养箱 (长沙长锦应用技术研究所 ) , TD5台式
多管架低速离心机 (长沙美泰仪器有限公司 ) ,
X S— 200光学显微镜 (江南光学仪器厂 ) , X SB— 1A
生物倒置显微镜 (广西梧州光学仪器厂 )。
2　方法
2. 1　分组及给药: 无菌抽取 EAC瘤液 ,生理盐水
1∶ 3稀释 ,取小鼠 40只 ,每只小鼠腹腔接种瘤液
0. 3 mL。接种次日随机分成 4组 ,益气平悬饮大、小
剂量组、环磷酰胺组、模型对照组 ,每组 10只 ,雌雄
各半。益气平悬饮大、小剂量组分别按 37. 0, 18. 5
g /kg ig给药 ,模型组 ig蒸馏水 20 mL /kg ,每日 1
次 ,连续 9 d;环磷酰胺组 ip环磷酰胺 75 mg /kg ,从
接种瘤株后第 3天开始 ip,隔日 1次 ,共 4次。
2. 2　 TIL的制备:末次给药后次日 ,无菌抽取 EAC
小鼠腹水 4 m L,肝素抗凝 , 1 200 r /min离心 10
min,去上清液 ,取沉淀 1份 ,加入到 2份淋巴细胞
分离液表面 , 1 200 r /min离心 10 min,收集界面上
的细胞 ,洗入 Hanks液中 , 1 200 r /min离心 5 min,
反复洗 2次 ,得所需 TIL细胞 ,调整细胞浓度为
1× 107 /mL,作为效应细胞。同时 ,另取沉淀 1份 ,以
肿瘤细胞分离液同法制备 ATC作为靶细胞 ,调整细
胞浓度为 1× 106 /mL,用以测定 TIL的杀伤活性。
2. 3　 T IL杀伤活性的测定:取 96孔培养板 ,每实验
孔加入效应细胞和靶细胞各 100μL,效、靶细胞比为
10∶ 1,同时设靶细胞孔、效应细胞孔、空白孔 ,在
37℃、 5% CO2条件下 ,作用 4 h后每孔加入 MT T
( 2 mg /mL) 5μL,同样条件下继续作用 4 h ,每孔取
上清液 150μL,加入 96孔反应板 ,每孔加入 DM SO
150μL,以溶解形成的色素颗粒 ,于酶标仪 630 nm
波长下测 A值 ,计算细胞杀伤活性 [2 ]。
T IL杀伤活性= 1- A效靶细胞 - A效应细胞A靶细胞 × 100%
2. 4　 TIL体外杀伤 ATC的形态学观察:将 TIL与
ATC混合培养 2, 4, 10, 14, 24 h,用生物倒置显微
镜观察培养的细胞并拍照记录。
3　结果
3. 1　对 EAC小鼠腹水中 TIL杀伤 ATC活性的
影响: 见表 1。 结果显示 ,益气平悬饮大、小剂量组
TIL杀伤活性均有所提高 ,与模型对照组比较 ,经
Dunnet t-T检验 ,差异显著 ( P < 0. 05)。
3. 2　对 TIL杀伤 ATC活性影响的形态学观察 :
·300· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 35卷第 3期 2004年 3月
表 1　益气平悬饮对荷 EAC小鼠腹水中 TIL
杀伤 ATC活性的影响 (x± s, n= 10)
Table 1　 Influence of QBSRDB on killing activity
of TIL to ATC in hydroperitonia
of bearing-EAC mice (x± s, n= 10)
组　别 剂量 / ( g· kg- 1) 杀伤活性 /%
模型对照 　　　　 - 　　 11. 27± 4. 42
环磷酰胺 　　　 0. 075 12. 98± 3. 88
益气平悬饮 37. 0 18. 72± 5. 64*
18. 5 17. 69± 6. 82*
　　与模型对照组比较: * P < 0. 05
　　* P < 0. 05 vs model g roup
EAC小鼠腹水中的 T IL (图 1-A)与 ATC共同孵
育 2 h ,光镜下即可见 TIL向 ATC靠拢 ,开始形成
花环 (图 1-B) ;培养 4 h, TIL攻击 A TC,与 ATC
接触 ,呈花环状 (图 1-C) ;培养 10 h, TIL与 ATC
接触更密切 , ATC细胞膜已有破损 (图 1-D) ;培养
14 h,被 TIL包绕的 A TC细胞膜破碎 (图 1-E) ;培
养 24 h, ATC细胞裂解成碎片状 , T IL完好 ,可攻
击其他 ATC细胞 (图 1-F)。 形态学的改变为 T IL
杀伤 ATC细胞提供了有力证据 ,同时提示 TIL杀
伤 ATC细胞具有主动性和一定的特异性。
图 1　 EAC小鼠 TIL杀伤 ATC形态学变化
Fig. 1　 Cell-morphological changes of TIL killing ATC in bearing-EAC mice
4　讨论
　　 T IL由 Mac Carty 1992年首次描述 ,其后一直
受到关注。这种渗入到肿瘤组织内的细胞的活性及
表型分布 ,与恶性肿瘤发生、发展直接相关。研究表
明 , T IL是一种抗肿瘤效应细胞 ,其抗肿瘤效价是
淋巴因子激活的杀伤细胞 ( LAK ) 的 50～ 100
倍 [3 ] ,具有重要潜在价值。近年 ,随着 TIL分离制备
技术和体外扩增培养方法的建立 , T IL在免疫生物
学和功能研究方面进展快速 ,已经从实验研究进入
临床应用研究 ,显示了良好的前景。
T IL是以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群
体 ,大多聚集在肿瘤周围或其间质中 ,也存在于癌性
胸腹水中 ,其杀伤功能主要依赖其中的 CTL (细胞
毒性 T细胞 )是否能有效地激活和行使功能。但研
究显示 , T IL原位功能是抑制或麻痹的 ,从而造成
肿瘤免疫不能奏效 [3 ]。 因此 ,激活和扩增 TIL,成为
肿瘤免疫治疗的又一重要手段。近年 ,有学者对癌性
胸水中 TIL进行体外培养 ,再回输体内抗癌 ,取得
较好疗效。但由于技术设备条件要求高 ,推广困难。
所以 ,在体内提高 TIL杀伤活性从而积极发挥其抗
癌作用 ,具有重要意义。 研究表明 ,益气平悬饮对
Lew is肺癌有明显抑瘤作用 ,并显著延长荷艾氏腹
水癌小鼠生存期 ,与榄香烯胸腔注射联合治疗肺癌
性胸水 22例有效率达 95. 5% ,抗癌作用明显 [4 ]。本
实验在给药后分离培养细胞中直接观察到益气平悬
饮大、小剂量组均能提高 TIL杀伤 ATC活性 ,并加
速 ATC死亡 ,为其用于治疗肿瘤提供重要依据。
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