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四倍体菘蓝转抗虫基因研究
Ⅱ . 转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测
许铁峰 1 ,张　磊 1 ,刘成洪 1 ,谭秋敏 2 ,唐克轩 2 ,郭美丽 1 ,乔传卓 1 ,张汉明 1⒇
( 1. 第二军医大学药学院生药教研室 ,上海　 200433; 2. 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室 ,上海　 200433)
摘　要: 目的　获得转基因菘蓝的分子生物学证据。 方法　对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式
反应 ( PCR) , Southern杂交和 RT-PCR检测。 结果　 PCR和 Southern杂交检测结果表明 ,外源半夏凝集素基因已
经整合到转基因菘蓝的基因组中 , RT-PCR结果表明其 DNA可以正常转录成 mRN A。 结论　可以利用农杆菌介
导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。
关键词: 菘蓝 ;半夏凝集素基因 ;聚合酶链反应 ; South ern Blo t; RT-PCR
中图分类号: R282. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 09 0846 04
Agrobacterium tumefaciens mediated transgenic tetraploid Isatis indigotica
carrying anti-insect gene fromP inellia ternata agglutinin (Ⅱ )
XU Tie-feng
1
, ZHANG Lei
1
, L IU Cheng-hong
1
, TAN Qiu-min
2
, T ANG Ke-xuan
2
,
GUO Mei-li
1
, QIAO Chuan-zhuo
1
, ZHANG Han-ming
1
( 1. School of Pha rmacy , Second Milita ry Medica l Univ er sity, Shanghai 200433, China; 2. State Key Labo rato ry
of Genetic Eng iner ring , Schoo l o f Life Sciences, Fudan Univ e rsity , Shanghai 200433, China)
Abstract: Object　 To get mo lecula r proof o f t ransgenic Isat is indigotica Fo rt. Methods　 The regen-
erated I. indigotica plantlets on kanamycin-containing media w ere analysed wi th po lymerase chain reaction
( PCR) , Southern Blo t and RT-PCR methods. Results　 PCR and Southern Blo t analysis show ed that the
fo reign PTA gene w ere inser ted into the genome of the t ransformed I. indigot ica plants. Fur ther RT-PCR
show ed that the fo reign PTA gene could be t ranscripted into m RNA no rmally. Conclusion　 Pest resistant
I . indigot ica can be obtained through Agrobacterium -mediated t ransfo rmation.
Key words: Isatis indigot ica Fo rt. ; Pinellia ternata agg lutinin; polymerase chain reaction ( PCR) ;
Southern Blo t; RT-PCR
　　植物凝集素是指含有至少一个非催化结构域并
能够可逆性结合到特异单糖或寡糖上的所有植物蛋
白质。自然界中广泛分布 ,多存在于植株最易受攻击
的部位 ,对病原真菌、细菌、昆虫都有一定的抑制作
用 [1 ]。目前发现有些外源凝集素对同翅目、鞘翅目和
双翅目的昆虫有毒性。 植物凝集素确切的作用机制
现今并未研究清楚 ,一般认为植物凝集素的抗虫毒
性基于它们一旦被害虫摄食 ,外源凝集素就会在昆
虫的消化道中被释放出来 ,特异结合到昆虫肠的糖
缀合物上 ,这些结合影响了营养物质正常吸收 ,同时
还可能在消化道内诱发病灶 ,促进消化道内细菌繁
殖 ,对害虫本身造成危害 ,抑制害虫生长、发育和繁
殖 ,从而达到杀虫目的。
天 南 星 科 属 三 叶 半 夏 Pinellia ternata
( Thunb. ) Brei t.为我国特有的一种多年生草本药
用植物 ,其块茎为多用途中草药。凝胶过滤法测定半
夏凝集素 ( PT A)相对分子质量为 4. 4× 104 ,由 4个
约 1. 2× 104的相同亚基组成 ,结合甘露糖 ,与雪花
莲凝集素 ( GN A)相似。 PTA具有凝集细胞和促使
细胞分裂的作用。 PTA基因是一种有重要价值的抗
虫基因。 PT A粗提液对刺吸式同翅目害虫 (如棉蚜
等 )有显著致死作用 [2 ]。通过对根癌农杆菌介导获得
的转半夏凝集素基因四倍体菘蓝进行了分子生物学
检测 ,分析了外源基因的表达特征。
·846· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
⒇ 收稿日期: 2002-11-13
* 通讯作者　 Tel: ( 021) 65513056
1　材料和方法
1. 1　转基因植株的 PCR鉴定:为了初步验证外源
基因是否转入植物细胞内 ,对抗生素抗性植株进行
了 PCR检测。经 Km抗性筛选存活的 114株转基因
四倍体菘蓝 ,每株各摘取一小片叶 ( 0. 1 g ) ,微量提
取基因组 DNA,用 PT A基因引物 99011PXF1和
99011PXR1进行 PCR分析 ,扩增 PTA基因。
1. 1. 1　植物 DNA抽提方法: SDS提取法参照文献
方法 [3 ]。
1. 1. 2　转基因水稻植株中 PTA基因的 PCR检测:
PTA基因的 PCR引物 (引物 1和 2由 Sangon公司
合成 )序列 PX F1 ( 5’ -ATGGCCTCCAAGCTCCT-
CCT-3’ 　 Mw= 6 051. 0) ; PX R1 ( 5’ -GCT TAT T-
AA TTCACCT TCTCCGTC-3’ 　 Mw= 7 266. 0)
PCR反应体系: H2O 15. 8μL, 10× Buffer 2. 5
μL, 25 mmol /L MgCl2 1. 5μL,引物 1 ( 20 ng /μL)
1μL,引物 2 ( 20 ng /μL) 1μL, dN TP ( 2. 5 mmo l /
L ) 1μL,模板 2μL, Taq酶 ( 5 U /μL) 0. 2μL,总体
积 25μL。
PCR反应条件: 94℃ /3 min→ [94℃ /40 s→ 58
℃ /30 s→ 72℃ /40 s ]× 35 cycles→ 72℃ /5 min→ 4
℃ ,保存。
电泳检测条件: 0. 8%的琼脂糖凝胶 , 1× TAE
电泳缓冲液 , 70 V , 45 min。在 FR— 200型凝胶电泳
成像系统上用 Smart View软件进行扫描记录。
1. 2　 Southern Bolt分析:由于 PCR只能证明在转
基因植株体内存在外源目的基因片段 ,而不能完全
确定外源目的基因片段已整合进植物基因组 ,且
PCR可能存在假阳性结果 ,因此进一步采用 South-
ern Blo t分析验证。将抽提好的菘蓝植株总 DNA
( 10μg ) ,用 Sac I酶切过夜 ,上样于 0. 8%琼脂糖胶 ,
电压 50 V ,电泳时间 9 h后转到尼龙膜上 ,转移方
法和探针的制备见《分子克隆实验指南》 ,预杂交 2 h
后 , 68℃杂交过夜。 杂交后洗膜 ,先室温下用
2× SSC /0. 1% SDS溶液洗 30 min(两次 ) ,然后在 55
℃室温下轻摇孵育 40 min,将尼龙膜用塑料薄膜包
起来 ,在暗室里将尼龙膜对 X光片曝光大约 7 d后 ,
进行显影液 8 min,水浴 1 min, X光片定影液 16
min,流动水冲洗 5 min后观察。
1. 3　 One Step RT-PCR的方法:提取 6棵 PTA基
因的 Southern Blo t分析阳性植株与 1棵未转化植
株 ,抽提植物的总 RNA,进行 RT-PCR检测 [4 ]。 在
RNase-free 0. 2 mL PCR管中加入 ( 50μL体系 )
10× One Step RT-PCR buf fer 5 μL, MgCl2 ( 25
mmol /L ) 10μL, dN TP Mix ture ( 10 mmol /L ) 5
μL, RNase Inhibi tor ( 40 U /μL) 1μL, AMV Rtase
XL ( 5U /μL) 1μL, AMV-Optimized Taq ( 5U /μL)
1μL,上游特异引物 ( 20μmo l /L) 1μL,下游特异引
物 ( 20μmol /L ) 1μL, Total RN A (≤ 1μg ) 1μL,
RNase Free ddH2O 24μL, To tal 50μL /Sample.
RT-PCR的反应条件为: 逆转录 50℃ /30 min→
预变性 94℃ /3 min→合成 [ 94℃ /40 s→ 58℃ /
30 s→ 72℃ /40 s ]× 40 cycles→延伸 72℃ /5 min→
4℃ 保存。
2　结果
2. 1　 PTA基因的 PCR分析: 114株 Km抗性植株
的 DNA 用 PT A 基 因 引 物 99011PX F1 和
99011PX R1进行 PCR分析 ,有 28株得到约 870 bp
的扩增片段 ,与质粒 pCAMBIA2200-PT A中 PTA
基因的扩增产物大小一致 ,可以初步表明 PT A基
因已经转入这 28株再生菘蓝植株中。 结果见图 1。
2. 2　对转基因菘蓝所含 PT A基因进行 Southern
M -DL2000,片段大小依次为 2 000; 1 000; 750, 500, 250, 100 bp　阳性 -用阳性质粒为模板 ,所得的扩增片段为 870 bp　阴性 -用
非转基因植株的 DNA为模板　 1～ 11为转 PTA基因的 T0代植株 ,其中 4为 PCR阴性植株
M -DL2000 molecular marker sequence as 2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp　 Posi tive plasmid as posi tiv e cont rol to get amplip-
ied f ragment 870 bp and DN A of wi ld type as negative cont rol　 1— 11: to PT A transg ene T0 plant lets　 4: PCR negative plan tlet s
图 1　转 PTA基因植株的 PCR结果
Fig. 1　 PCR analysis of PTA transgene plantlets
Blo t分析:用 EcoRI和 Pst I酶切质粒 PT A,得到含
半夏基因片段 ,大小分别为 3. 9, 3. 0, 0. 9 kb,充当
阳性对照及 marker。随机选取未转化的菘蓝及 PCR
阳性的菘蓝植株 ,抽提总 DNA,用 HindⅢ (探针中
不含此酶切位点 )消化总 DNA,杂交。 3和 4的杂交
结果分别为三条和两条带 ,未转化的菘蓝无条带。证
·847·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
明半夏凝集素基因已经转入菘蓝基因组中 ,且整合
入多个拷贝。 结果见图 2。
1-阳性对照及 marker,条带大小依次为 3. 9, 3. 0, 0. 9 k b
2-未转化的四倍体菘蓝　 3, 4-T0代独立转化四倍体菘蓝植物
1-posi tive cont rol and marker s equence as 3. 9, 3. 0, 0. 9 kb
2-wi ld type plant　 3, 4-T0 t ransgene plants
图 2　 PTA基因的 Southern Blot分析
Fig. 2　 Southern Blot analysis of PTA transgene.
2. 3　对转基因菘蓝所含 PTA基因进行 RT-PCR
分析: 为了证明转基因植株所含 PTA基因是否在
植株中表达 ,就需要从植物的总 RNA中检测是否
有 PT A基因的 DNA转录成 m RNA。发现有 4棵阳
性植株扩增出与目的片段大小一致的条带 ( 870
bp) ,初步证明转入的 PT A基因发生了转录 ,能够
表达。结果见图 3。
3　讨论
3. 1　转基因的方法: 转基因技术发展至今 ,已有许
多转基因方法得到广泛应用 ,如: 农杆菌法、基因枪
法、 PEG法、电击法、脂质体法和超声波介导法。 在
以上这些转基因方法中 ,采用农杆菌转化具有许多
明显的优势。农杆菌介导的转化法可以避开许多栽
培品种的原生质体难于再生的问题 ,而且相对于直
接转化法来讲 ,外源基因整合入受体基因组更为精
确 ,通常为单拷贝或低拷贝整合 ,并大多符合孟德尔
遗传 (外源基因在受体植物中整合的拷贝数会影响
M-DL2000片段大小依次为 2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp　 1-为非转化植株　 2～ 8-转 PTA基因经
South ern Blo t分析为阳性的 T0代转基因植物 ,其中 2～ 5为 RT-PCR阳性 , 6～ 8为 RT-PCR阴性
M-DL2000 molecular marker s equence as 2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp　 1-w ild type　 2— 8-T0 t ransgenic
plantlets w hich Southern Blot is posi tive　 2— 5 give the 870 bp posit ive band and 6— 8 are negativ e
图 3　转 PTA基因的转基因植物的 RT-PCR分析
Fig. 3　 RT-PCR analysis of PTA transgene plantlets
他们在受体植物中的表达 ,整合的拷贝数过高容易
导致基因沉默 )。 所以农杆菌法尽管转化效率不高 ,
还受到菌种和植物材料的限制 ,但仍广泛应用于转
基因植物的研究。 从 PCR结果来看 ,本实验的转化
率有 25%。不同的农杆菌和不同的植物品种转化率
不同。
3. 2　转基因的遗传表达:农杆菌介导的转化和直接
转化已被广泛用于转入外源基因。但是在转化中 ,只
有小部分植物细胞接受外源 DNA的整合 ,大多数
细胞仍保持非转基因状态。 T-DNA在植物染色体
中的整合是随机发生的 ,既可以单拷贝方式整合 ,也
可以多拷贝方式整合 ,大量拷贝数会导致基因的沉
默 [5 ]。 用 Southern杂交的方法可以估计外源 DNA
整合到植物细胞中的拷贝数。 对 DNA进行酶切时
选用的是插入片段内部没有识别位点的限制酶 ,由
于插入片段是随机插入菘蓝基因组中的 ,如果是多
拷贝整合 ,酶切后含有不同拷贝的酶切片段长度可
能不同 ,就可以通过电泳将其分开 ,从而估计插入片
段的拷贝数。分子杂交结果证明 ,在农杆菌介导的转
基因四倍体菘蓝植株中 ,不同转基因植株具有不同
PT A基因杂交条带 ,说明这些植株为独立转基因植
株。 PT A基因的拷贝数大多数为 1～ 3个左右。与基
因枪法介导的植物遗传转化相比 ,农杆菌法可获得
较多的单拷贝转基因植株 ,表达效果好 [6 ]。 6株转化
菘蓝以总 RNA为模板进行反转录 ,然后再经 PCR
扩增 ,有 4株得到特异的 cDN A扩增条带 ,表明半
夏凝集素基因实现了转录 [ 7]。 但是由于在提取
RNA,作 RT-PCR分析时 ,没有对各个植株的 RNA
作定量分析 ,所以扩增出的目的条带的明亮对比不
能代表 mRNA表达量的高低。
3. 3　植物凝集素的研究现状及问题:抗虫基因工程
相对起步较晚 ,有许多方面需进一步研究改进 [8 ]。植
·848· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
物凝集素对刺吸式害虫杀虫性同 BT的杀虫性相比
效果不尽如意 ,一方面有必要深入研究清楚其作用
机制 ,从而制订相应策略提高抗虫效果 ,比如从蛋白
质结构、凝集素的结合位点相互作用等方面研究入
手 ;另一方面应着手新的抗虫基因的克隆。
在植物中表达凝集素要求相对较高的水平才具
有较好的抗虫效果 ,要求构建强的高效表达载体 ,采
用合适的强启动子 ,针对害虫取食部位是韧皮部可
采用特异性表达启动子。随着越来越多植物凝集素
的鉴定和对它们结构功能及其基因的深入研究 ,凝
集素在农业、医学等领域及生命科学研究中用途越
来越广泛。凝集素参与植物体内组成防卫和诱导防
卫的机制及其基因克隆和转化研究 ,仍将是一个活
跃的研究领域。
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对数期继代对南方红豆杉细胞培养动力学的影响
仇　燕 ,王　丽 ,刘子会 ,王　刚⒇
(河北师范大学生命科学学院 ,河北 石家庄　 050016)
摘　要: 目的　解决南方红豆杉细胞生长缓慢及代谢水平低下的问题。方法　对对数期 ( 20 d)和静止期 ( 30 d)的红
豆杉细胞分别进行继代 ,在整个生长周期中测定了培养基中的碳源、氮源、磷酸盐的变化并分析了红豆杉细胞生长
及紫杉醇的合成情况。 结果　对数期继代细胞吸收碳源和硝态氮早于静止期继代的细胞 ,且前者的比生长速度是
后者的 1. 5倍 ,紫杉醇含量提高了近 4倍。 结论　对数期继代有利于生物量的积累及紫杉醇的合成。
关键词: 对数期 ;紫杉醇 ;动力学
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 09 0849 04
Effect of subculture at logarithmic phase on kinetics of cell cultures
of Taxus chinensis var. mairei
QIU Yan, WANG Li, LIU Zi-hui , WANG Gang
*
( Co llege o f Life Science, Hebei Normal Univ er sity , Shijiazh uang 050016, China)
Abstract: Object　 To solv e the problem of low grow th rate and metabolism level in Taxus chinensis
va r. mairei ( Lemé e et Lé v l. ) Cheng et L. K. Fu. Methods　 Cells on log ari thmic phase ( 20 d) and sta-
tionary phase ( 30 d) w ere subcul tured individua lly. Theuptake o f ca rbohydrate, nit rog en and phosphate
f rom the medium was examined, the g row th rate o f Taxus cell and the synthesis o f taxo l w ere analyzed too
during the who le grow th period. Results　 The Taxus cell subcultured at lo garithmic phase upto ok carbo-
hydrate and ni trate earlier than tha t subcultured at sta tionary phase. The special g row th rate o f the former
w as 1. 5 folds of tha t of the la t ter. The production rate o f tax ol w as increased by nearly 4 times. Conclu-
·849·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
⒇ 收稿日期: 2002-11-29基金项目:河北省自然科学基金 ( 300162)作者简介:仇　燕 ( 1977- ) ,女 ,河北石家庄人 ,河北师范大学博士研究生 ,植物学专业 ,研究方向为植物抗逆生理学。
E-mai l: qiu-yan-yan77@ sohu. com
* 通讯作者