全 文 ：酶转化三七叶总皂苷制备人参皂苷C-K 的工艺优化
姜彬慧1, 韩　颖1, 赵余庆23 , 胡筱敏1, 郑龙熙1Ξ
(11 东北大学 资源与土木工程学院, 辽宁 沈阳　110004; 21 辽宁中医学院, 辽宁 沈阳　110032)
摘　要: 目的　研究以三七叶总皂苷制备人参皂苷 C2K 的酶转化工艺。方法　利用 4 种工业酶制剂对三七叶总皂
苷进行转化, 筛选出最佳酶制剂; 以人参皂苷 C2K 的含量为指标, 采用正交试验法进行酶转化工艺的优化; 采用
TL C 及H PL C 法检测酶转化产物。结果　酶转化三七叶皂苷的最佳工艺条件为: 20% Β2葡聚糖苷酶, pH 514, 反应
温度 55 ℃, 反应时间 48 h。反应时间的影响最大, 其次是酶的体积分数。结论　Β2葡聚糖苷酶对三七叶总皂苷的转
化作用最强。
关键词: 三七叶总皂苷; 人参皂苷 C2K; 酶转化工艺; 正交试验
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 09 0986 03
Optim iza tion of enzyma tic tran sla tion for prepara tion g in senoside com pound K
in tota l sapon in s of P anax notog inseng
J IAN G B in2hu i1, HAN Y ing1, ZHAO Yu2qing2, HU X iao2m in1, ZH EN G L ong2x i1
(11 Co llege of R esources and C ivil Engineering, N o rtheast U niversity, Shenyang 110004, Ch ina;
21 L iaon ing Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, Shenyang 110032, Ch ina)
Abstract: Object　To study the enzym atic t ran sla t ion of the sapon in s of P anax notog inseng leaves
( SPNL ) fo r p repara t ion of g in seno side compound K1 M ethods　Fou r indu stria l enzym es w ere u sed to
screen their ab ility of enzym atic t ran sla t ion of SPNL fo r p repara t ion of g in seno side compound K1 U nder
the condit ion of o rthogonal test, the affect ing facto rs of enzym atic t ran sla t ion w ere studied and op t im ized
w ith the con ten t of g in seno side compound K, then analyzed by TL C and H PL C1 Results　T he best
op t im al condit ion w as ob ta ined as fo llow ing: 20% fo r Β2glucanase concen tra t ion, pH 514, 55 ℃ as react ion
temperatu r, 48 h as the react ion t im e1 T he react ion t im e w as the greatest affect ing facto rs among the fou r
ones, and enzym e concen tra t ion w as the second1 Conclusion 　Β2Glucanase w as the best of fou r indu stria l
enzym es fo r th is enzym atic t ran sla t ion techn ics1
Key words: the sapon in s of P anax notog inseng leaves (SPNL ) ; g in seno side compound K; enzym atic
t ran sla t ion techn ics; o rthogonal test
　　三七叶皂苷是从五加科植物三七 P anax
notog inseng (Bu rk1) F1 H 1 Chen 茎叶中提取的总
皂苷, 即三七茎叶总皂苷, 简称三七叶皂苷 ( the
leaves sapon in s of P anax notog inseng , L SPN )。近
年研究表明, L SPN 与三七根皂苷具有相同的药理
作用, 而且其毒性较低, 安全范围大[1 ]。目前已从三
七叶中分离鉴定出人参皂苷 R b1, R b2, R b3, R c,
R g3,M c, 三七皂苷 Fa, Fc, Fe 和绞股蓝皂苷Ñ 等,
主要以二醇组皂苷为主[2 ]。国内外学者对人参皂苷
单体与抗肿瘤活性的构效关系研究表明; 低糖链的
皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用, 其规律: 原人参
二醇型> 原人参三醇型; 苷元> 单糖苷> 二糖苷>
三糖苷> 四糖苷; 20 (R ) 2人参皂苷> 20 (S ) 2人参皂
苷[3 ]。低糖链的皂苷及苷元在植物中含量甚少, 如人
参皂苷R h2 在人参中含量甚微, 在红参中仅为十万
分之一; 而人参皂苷 C2K (gin seno side compound
K ) 则一直被认为是二醇组人参皂苷在动物体内的
代谢产物[4 ]。因此, 从人参属植物中制备低糖链皂苷
如人参皂苷R h1、R h2、C2K 等成分的工作倍受关注。
目前, 主要的制备方法有酸、碱水解及生物转
化[5～ 7 ]。由于酸、碱水解方法产生大量的废酸和废
碱, 对环境造成较大的危害, 因此寻找一条无污染的
生产途径势在必行。
　　以往国内外学者对人参皂苷C2K 的制备主要
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Ξ 收稿日期: 2004205218
基 金项目: 留学归国博士科研启动基金资助项目 (教外司留 [ 2001 ] 498) ;“辽宁省中药现代化工程技术中心”建设基金资助项目
(2002403004)
作者简介: 姜彬慧 (1962—) , 女, 副教授, 在读博士, 研究方向为资源与微生物技术。3 通讯作者　T el: (024) 86224725　E2m ai: Zhaoyuqingtcm @ 1631com
通过单体人参皂苷的体内肠道菌代谢与体外的微生
物转化来完成, 转化过程复杂, 反应副产物多。利用
商品酶制剂, 操作简便, 但价格昂贵, 应用具有一定
的局限性[8～ 11 ]。工业酶制剂价格低廉, 操作过程简
单、方便, 便于工业放大, 已被广泛地应用在各个领
域, 因此探讨工业酶制剂对中药活性成分的转化具
有重大意义。本实验利用 4 种工业酶制剂对L SPN
进行转化, 制备人参皂苷C2K。
1　材料与仪器
三七叶皂苷 (L SPN ) 购于云南永昌 (含总皂苷
大于 80% ) , Β2葡聚糖苷酶 (Β2glucanase)、纤维二糖
酶 (cellob iase)、糖化酶 (g lucoam ylase) 均由北京诺
唯信公司提供, 纤维素酶 (cellu lase) 由上海丽珠东
风生物技术有限公司提供。人参皂苷C2K 对照品
(纯度均大于 95% ) 由辽宁中医学院新药研制中心
提供; 乙腈、甲醇为色谱纯, 硅胶 G (青岛海洋化工
厂) , 其他试剂均为分析纯。
　　日立L —7100 高效液相色谱仪, N 2000 双通道
色谱工作站 (浙江大学) ; T G332A 微量分析天平;
R E—52A 型旋转蒸发仪; A S—3120A 超声仪。
2　方法与结果
211　L SPN 供试品溶液的制备: 精密称取L SPN
200 m g, 置 10 mL 量瓶中, 加 HA c2N aA c 缓冲液
(pH 518) 溶解并加至刻度, 制成 20 m gömL 溶液,
置冰箱待用。
212　酶溶液的制备: 分别精密量取 Β2葡聚糖苷酶、
纤维二糖酶、糖化酶原液各 1 mL , 置 10 mL 量瓶
中, 加蒸馏水至刻度, 即得 10% 酶反应液。精密称取
纤维素酶 200 m g, 置 10 mL 量瓶中, 加蒸馏水溶解
并加至刻度, 即得 20 m gömL 纤维素酶反应液。
213　最佳转化酶的筛选: 4 种酶反应液各取 1 mL ,
分别加入 1 mL 供试品溶液于试管中, 在 50 ℃ (糖
化酶的反应液在 25 ℃)恒温 48 h, 终止反应。分别加
入 015 mL 水饱和正丁醇进行萃取, 静置。另取 1
mL 蒸馏水作为对照组, 同法操作。用定量毛细管各
吸取 5 ΛL 上述水饱和正丁醇萃取液, 点板, 以
CHC l32M eOH 2H 2O (40∶10∶1)为展开剂展开至同
样距离, 取出, 挥干溶剂, 喷 10% H 2SO 4 乙醇溶液后
105 ℃加热 10 m in 显色。根据显色斑点的颜色深浅
和大小来确定酶转化作用的强弱。结果显示: 酶对
L SPN 的转化作用大小依次为 Β2葡聚糖苷酶> 纤维
素酶> 糖化酶> 纤维二糖酶。因此确定L SPN 的最
佳转化酶为 Β2葡聚糖苷酶。
214　H PL C 法测定酶转化产物中人参皂苷C2K
21411　色谱条件: 色谱柱: K rom asil OD S 柱 (150
mm ×416 mm , 5 Λm ) ; 柱温: 室温; 检测波长: 203
nm ; 体积流量: 1 mL öm in; 流动相: 乙腈2水 (60∶
40)。
21412　标准曲线及线性范围: 准确称取人参皂苷
C2K 对照品 1157 m g, 置 10 mL 量瓶中, 用甲醇溶解
并加至刻度。吸取该溶液 2、4、6、8、10、12 ΛL 进样,
按上述色谱条件测定。以进样量为横坐标, 峰面积为
纵坐标作标准曲线, 得回归方程: Y = 41 413149
X - 1 908193, r= 01999 7。结果表明, 人参皂苷C2
K 在 01314～ 11884 Λg 时峰面积与进样量线性关系
良好。
21413　酶转化产物中人参皂苷 C2K 的测定: 取酶
转化液经 0145 Λm 微孔滤膜, 进样 5 ΛL , 测定峰面
积, 由回归方程计算人参皂苷C2K 含量。
215　Β2葡聚糖苷酶转化L SPN 最佳条件的确定: 筛
选了 Β2葡聚糖苷酶作为L SPN 的转化酶后, 选定反
应时间、反应温度、酶体积分数及反应缓冲液的 pH
值作为考察的 4 个因素, 每个因素各取 3 个水平, 见
表 1。取 9 份 1 mL L SPN 供试品溶液, 80 ℃加热 30
m in 后 (去除其他酶的影响) , 冷却至室温, 分别加入
1 mL 不同体积分数的 Β2葡聚糖苷酶溶液, 在一定温
度、pH 条件下反应一定时间后, 终止反应。分别用
水饱和正丁醇萃取 3 次, 合并萃取液, 挥干, 置 1 mL
量瓶中, 加色谱纯甲醇至刻度, 测定人参皂苷C2K
含量, 结果见表 2, 方差分析见表 3。
表 1　因素水平表
Table 1　Factors and levels
水　平
因　素
A 酶体积分数ö% B 时间öh C 温度ö℃ D pH 值
1 20 12 45 510
2 10 24 50 514
3 5 48 55 518
　　可见各因素对酶转化作用的影响程度依次为
B > A > C > D , 即反应时间对酶转化作用的影响最
大, 其次是酶的体积分数。同时, 可以确定该试验的
最佳因素选择应该是A 1B 3C 3D 2, 即反应条件为 20%
酶溶液、在pH 为 514 的缓冲液中, 55 ℃恒温水浴反
应 48 h 为最佳试验条件。在上述条件下利用 Β2葡聚
糖苷酶对L SPN 转化 3 批样品, 结果人参皂苷C2K
的质量浓度为 01883 m gömL , R SD 为 413%。
3　讨论
311　利用生物体系包括微生物和动物、植物细胞或
酶对天然产物 (外源性底物)进行生物转化或结构修
饰, 是当今研究的热点[12 ]。本研究结果表明, 利用合
·789·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
　　　　　表 2　L 9 (34)正交试验设计及结果
Table 2　D esign and result of L 9 (34) orthogonal test
试验号 A B C D
人参皂苷C2Kö(m g·mL - 1)
1 1 1 1 1 01405 5
2 1 2 2 2 01649 8
3 1 3 3 3 01864 3
4 2 1 2 3 01332 8
5 2 2 3 1 01619 0
6 2 3 1 2 01750 0
7 3 1 3 2 01376 3
8 3 2 1 3 01324 8
9 3 3 2 1 01654 8
k1 01639 9 01371 5 01493 4 01559 8
k2 01567 3 01531 2 01545 8 01592 0
k3 01451 9 01756 4 01619 9 01507 3
R 01188 0 01384 9 01126 5 01084 7
表 3　方差分析
Table 3　Var iance analysis
方差来源 方差平方和 自由度 均方 F 值 P 值
　A 01054 2 01027 4191
　B 01224 2 01112 20144 P < 0105
　C 01024 2 01012 2121
　D (误差) 01011 2 01005
　　F 0105 (2, 2) = 1910　F 0101 (2, 2) = 9910
适的酶制剂可以实现将含量较高的天然皂苷转化为
具有特殊活性的、价值更大的次级皂苷, 并使其含量
提高数百倍, 为新药 (原料)的开发奠定了基础。
312　工业酶制剂代替生物转化既可以减少许多繁
琐的制备工艺, 又可以消除多种副产物的生成, 便于
转化产物的分离与纯化, 这是由酶的专一性所决定
的。本实验利用工业酶制剂 Β2葡聚糖苷酶转化三七
叶皂苷可制备 01883 m gömL 的抗肿瘤活性产物人
参皂苷C2K, 为进一步研究其药理活性创造了条件。
References:
[ 1 ]　H uang G K, H u X L , Q in Q , et a l1M icro scale experim en t of
iso lation and purification of to tal sapon ins from the stalk and
leaves of P anax g inseng [J ]1 J Guang x i N orm U niv (广西师
范大学学报) , 2000, 18 (2) : 10621071
[ 2 ]　Chen Y G, Zhan E Y, Chen H F, et a l1 Sapon ins w ith low
sugar chain from the leaves of P anax notog inseng (Burk) F1
H 1 Chen [J ]1 J Ch in M ed M ater (中药材) , 2002, 25 (3) :
17621781
[ 3 ]　Dou D Q , J in L , Chen Y J1 A dvances and p ro spects of the
study on chem ical constituen ts and pharm aco logical activit ies
of P anax g inseng [J ]1 J S heny ang P harm U niv (沈阳药科大
学学报) , 1999, 16 (2) : 15121561
[ 4 ]　L iu K1 P reparation and an titumo r activit ies of rare
ginseno side [J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2003,
43 (Supp l) : 572591
[ 5 ]　A kao T , Kanaoka M , Kobash i K1 A ppearance of compound
K, a m ajo r m etabo lite of ginseno side Rb1 by in testinal
bacteria, in rat p lasm a after o ral adm in istration —
m easurem en t of compound K by enzym e imm unoassay [J ]1
B iol P harm B u ll, 1998, 21 (3) : 24522491
[ 6 ]　Kim D S, Cue Y S, Yu H S, et a l1 Ginseno side Rh2 p repared
from enzym e reaction [J ]1 J D a lian Inst L ig h t Ind (大连轻
工学院学报) , 2001, 20 (2) : 9921041
[ 7 ]　Chen Y G, LüY P, Gui S H , et a l1 P reparation of
p ro topanaxadio l and its ep im er 20 (R ) 2p ro topanaxadio l from
leaf sapon ins of P anax notog inseng [J ]1 F ine Chem (精细化
工) , 2003, 20 (7) : 42524261
[ 8 ]　W ang L P1 In v itro m etabo lism of ginseng sapon ins [J ]1 J
S tra it P harm (海峡药学) , 2000, 12 (4) : 4261
[ 9 ]　M a J S, Zhou Q L , Fei X F, et a l1 M etabo lism of
ginseno side Rb1 and panaxadio l sapon ins by fungi [J ]1 A cta
P harm S in (药学学报) , 2001, 36 (8) : 60326051
[ 10 ]　Ko izum i H , Sanada S, Ida Y, et a l1 Studies on the ginseng1
1) O n the structu re and enzym atic hydro lysis of ginseno side2
Ra1 [J ]1 Chem P harm B u ll, 1982, 30 (7) : 2393223981
[ 11 ]　H asegaw a H , Sung J H , M atsum iya S, et a l1 M ain ginseng
sapon in m etabo lites fo rm ed by in testinal bacteria [J ]1 P lan t
M ed , 1996, 62: 45324571
[ 12 ]　W u S J , Yang Z J , Zhu L H , et a l1 Study on
b io transfo rm ation of glycyrrh izin [J ]1 Ch in T rad it H erb
D rug s (中草药) , 2003, 34 (6) : 51625181
柱前衍生 HPLC 法测定鸦胆子油中的脂肪酸含量
丁　怡, 唐　星Ξ
(沈阳药科大学 药剂教研室, 辽宁 沈阳　110016)
摘　要: 目的　建立H PL C 法测定鸦胆子油中的脂肪酸的方法。方法　以 2, 4′2二溴苯乙酮为衍生化试剂, 182冠26
醚为相转移催化剂, 采用 K rom asil C8 (250 mm ×4 mm , 5 Λm )反相柱, 波长 254 nm , 以乙腈2水 (80∶20)为流动相等
度洗脱, 柱温室温, 体积流量为 113 mL öm in, 正十七烷酸为内标, 一次基线分离 5 种脂肪酸。结果　亚油酸的线性
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Ξ 收稿日期: 2003211222
基金项目: 辽宁省重大课题项目 (2002226005)
作者简介: 丁　怡 (1978—) , 女, 河北人, 沈阳药科大学 2001 级在读研究生, 主要从事静脉注射用微乳剂和缓控释制剂的研究。
T el: (024) 2384371123923　E2m ail: d ingyisue@ 21cn1com