全 文 ：草栽与段木栽培的灵芝活性成分的分离与鉴定
Ⅰ . 多糖肽成分的提取、纯化及性质
林树钱 1 ,王赛贞 1 ,林志彬 2 ,林跃鑫 3
( 1. 福州绿谷生物药业技术研究所 ,福建 福州　 350003;　 2. 北京大学医学部 药理系 ,北京　 100083;　 3. 福建师范大学 ,福
建 福州　 350007)
摘　要: 目的　研究草栽和段木栽培灵芝的多糖性质和含量 ;考察以草代木栽培灵芝的可行性的研究。 方法　提
取、分离、逆相透析方法研究二者子实体多糖。应用气相色谱、凝胶渗透色谱法测定多糖的组成、摩尔比和相对分子
质量。 IR, 1 H-NM R和 13C-NM R等光谱确定多糖肽化合物结构。 结果　草栽灵芝多糖肽 ( GLPG )和段木多糖肽
( GLPW)的重均相对分子质量 ( Mw )分别为 5. 13× 105和 5. 85× 105 ;黏均相对分子质量 (Mη)分别为 6. 21× 105和
6. 96× 105 ,二者具有相同的相对分子质量分布及光谱数据。从光谱分析中看出各单糖间的苷键构型相似 ,均以 β -苷
键为主 ;糖肽部分均含有相同的 16种氨基酸 ,糖的组份为鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖等 , GLPW还含有微
量甘露糖。结论　草栽灵芝与段木灵芝多糖肽的主要理化特性相似 ,其提取率比段木灵芝约高 2. 8倍 ,为草栽灵芝
的综合开发与药用提供了科学依据。
关键词: 草栽灵芝多糖肽 ;段木灵芝多糖肽 ;提取 ;纯化 ;光谱鉴定
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 10 0872 03
Isolation and identification of active components ofGanoderma lucidum cultivated with grass
and wood log I. Extraction, purification and characterization of glycopeptide
LIN Shu-qian1 , WANG Sai-zhen1 , L IN Zhi-bin2 , L IN Yue-xin3
( 1. Fuzh ou G reen Va lley Institute of Bio-pha rmaceutical Techno lo g y, Fuzhou 350003, China; 2. Depar tment
of Pharmaco lo gy , Schoo l o f Ba sic Medical Science, Peking Univ ersity, Beijing 100083, China;
3. Fujian No rmal Unive rsity , Fuzhou 350007, China )
Abstract: Object　 To study the amount and properties o f g lycopeptide o f Ganoderma lucidum
( Leyss. ex Fr. ) Kaist. cultiv ated wi th g rass ( GLPG) and wood lo g ( GLPW ) ; to investigate the feasibili ty
o f substi tution of g rass for w ood log to cul tiva te G. lucidum . Methods　 Glycopeptides w ere ex tracted and
isolated f rom the f ruit body of G. lucidum follow ed by dialysis; the monosaccharid consti tuent and relativ e
molecular w eigh t of polysaccharides w ere examined by GC and gel fi lt ration; st ructure o f g lycopeptide w as
determined by IR, 1 H-NMR and 13 C-NM R. Results　 Relativ e molecular w eights of GLPW and GLPG gly-
copeptides w ere (Mw ) 5. 13× 105 and 5. 85× 105 , (Mη) 6. 21× 105 and 6. 96× 105 , respectiv ely; the gluco-
sidic bonds o f bo th glycopeptides w ereβ -type; bo th gly copeptides consist 16 amino acids and Rha, Xyl,
Fru, Gal and Glc ( there w as t race amount of Man in GLPW ) . Conclusion　 There are less physica l and
chemical di fference between GLPG and GLPW. The puri fica tion ra te of GLPG is 2. 8 times to GLPW.
Key words: g lycopeptide of Ganoderma lucidum ( Ley ss. ex Fr. ) Karst. wi th g rass ( GLPG) ; gly-
copeptide of G. lucidum w ith w ood log ( GLPW ); ex t raction; puri fica tion; spect rum identification
　　我国是世界上生产食 (药 )用菌的大国。每年栽
培食 (药 )用菌消耗大量的木材 ,影响生态环境。目
前 ,市场上应用的段木灵芝 Ganoderma lucidum
( Leyss. ex Fr. ) Ka rst. ,每年要消耗十几万立方米
木材。为此 ,笔者对福建农林大学菌草研究生产的草
栽灵芝 [1 ]与段木灵芝中的多糖成分的提取、纯化与
特性进行了比较研究 ,为进一步研究草栽灵芝多糖
与活性的关系 ,用草栽灵芝代替段木灵芝应用奠定
·872· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
收稿日期: 2002-09-29基金项目:上海绿谷 (集团 )有限公司专项科研资金全额资助项目作者简介:林树钱 ( 1935- ) ,男 ,福建人 ,副研究员 , 1959年毕业于福建师范学院生物系 (现福建师范大学 ) ,现任福州绿谷生物药业技术研究所常务副所长 ,主要从事灵芝等药用真菌药物的研究与开发。 　 Tel: ( 0591) 3799944　　 E-mail: lsq2020@ sohu. com
了基础。
1　材料与仪器
1. 1　材料:草栽灵芝子实体来自福建农林大学菌草
研究所 ;段木灵芝子实体来自福建省泰宁县段木灵
芝生产基地。 子实体经中国科学院微生物研究所卯
晓岚研究员鉴定。
1. 2　仪器与设备: Perkin- Elmer 980红外光谱仪
( KBr压片 ) ; UN RTY - 500核磁共振仪 ; 日立
835-50氨基酸自动分析仪 ;岛津 Lc- 6A高压液相
色谱仪 ; RID- 5A示差折射检测器 ;岛津 GC- 16A
型气相色谱仪。
2　实验方法与结果
2. 1　多糖肽提取、分离和纯化
2. 1. 1　粗多糖提取与分离 [2 ]: 将灵芝子实体用粗颗
粒粉碎机破成 10目左右 ,称取 300 g用 10倍量的
95%乙醇 ,加热回流 3 h,醇提残渣经风干后 ,分别用
15倍水加热回流提取 3次 ( 2. 5, 2, 1 h) ,滤过后的水
提取液合并 ,经减压浓缩至原体积的 1 /10, 3 000
r /min离心 15 min,上清液再浓缩相当于每毫升含灵
芝生药量 1 g ,然后加浓缩液体积的 3倍量 95%乙醇
作多糖沉淀剂 ,置于 5℃冰箱内静置过夜 ,沉淀物离
心 ( 3 000 r /min, 15 min) ,再溶于蒸馏水 300 mL中 ,
用 95%乙醇 2～ 3倍量沉淀多糖 ,依此反复提纯 2
次 ,最后将沉淀的多糖分别用 95%乙醇、丙酮和乙醚
各洗涤 3次后 ,置低温 ( 5℃ )干燥至恒重 ,即得黄灰
色的粗多糖。 草栽灵芝粗多糖的平均提取率为
6. 48% ,段木灵芝粗多糖的提取率为 2. 34%。
2. 1. 2　多糖肽的分离、纯化 [3, 4 ]: 将上述粗多糖肽溶
于蒸馏水中 ,置透析袋内 (截留相对分子质量 5 000
以上 ) ,逆流透析 48 h,取出透析液在 80℃下减压浓
缩 ,加入多糖浓缩液体积的 3倍量 95%乙醇 ,搅拌、
静置 ,然后离心 ( 3 000 r /min, 15 min) ,沉淀物为透
析后截留的大分子部位多糖 ,分别用 95%乙醇、丙
酮和乙醚各洗 3次 ,离心 ,沉淀物置低温干燥至恒
重 ,分别得草栽灵芝多糖肽 ( GLPG)和段木灵芝糖
肽 ( GLPW ) ,并求大分子部位多糖肽各占粗多糖含
量比。结果表明 , GLPG, GLPW约占粗多糖 35%～
36%。 而低聚糖和色素等低分子杂质约占 64%。
2. 1. 3　糖肽分离—— 除去蛋白 [5 ]: 称取 10 g草栽
灵芝粗多糖溶于蒸馏水中 ,采用 Sevag法除去蛋白 ,
即加入多糖溶液体积 0. 2倍氯仿和 0. 04倍正丁醇
混合摇振 30 min,离心分离 ,除去沉淀部分 ,依此反
复处理至氯仿和水的界面无沉淀为止。 通过 Sevag
法对草栽灵芝多糖肽分离以除去蛋白 ,经 55次的反
复处理纯化后的样品 ,其氨基酸总量为 4. 37% ,比
处理前 5. 16%仅减少 15. 31% ;肽部分仍有 15种氨
基酸组成 ,比处理前仅减少 1种异亮氨基酸 (表 1) ,
说明灵芝多糖肽中蛋白质与多糖键结合相当牢固 ,
故本试验样品称为多糖肽。
2. 1. 4　多糖肽的氨基酸分析: 取一定量 GLPG和
GLPW以及 Sevag 法处理后的 GLPG,加 1∶ 1
HCl,封管 , 110℃水解 24 h,浓缩 ,调 pH值为中性 ,
用 0. 02 mL /L HCl定量 ,经氨基酸自动分析仪测
定 ,结果见表 1。 从表 1可见 GLPG和 GLPW具有
相同的氨基酸组成 ,其氨基酸总量基本一致。
表 1　 GLPG和 GLPW的氨基酸组成 mg /g
Table 1　 Composition of amino acids
in GLPG and GLPW mg /g
氨基酸名称 GLPG GL PW GLPG-Sev ag处理
天门冬氨酸 　　 8. 49 　　 9. 49 　　　　 4. 49
苏氨酸 3. 58 5. 32 4. 08
丝氨酸 3. 93 4. 88 4. 43
谷氨酸 5. 81 8. 10 4. 20
甘氨酸 3. 50 4. 71 3. 04
丙氨酸 3. 84 4. 63 2. 96
胱氨酸 1. 06 1. 82 1. 01
缬氨酸 2. 68 3. 70 2. 17
蛋氨酸 5. 33 7. 44 9. 61
异亮氨 0. 25 0. 54 　　　　 —
亮氨酸 1. 50 2. 56 1. 04
酪氨酸 　　 — 　　 — 　　　　 —
苯丙氨酸 1. 99 3. 05 1. 32
赖氨酸 3. 30 2. 22 1. 24
组氨酸 1. 21 1. 23 0. 82
精氨酸 3. 94 3. 47 1. 92
脯氨酸 1. 22 1. 76 1. 43
总　量 51. 63 64. 92 43. 68
2. 2　相对分子质量测定与相对分子质量分布 [6 ]: 采
用凝胶渗透色谱法 ( GPC)测定 ,利用示差折射检测
器和 HW色谱工作站 ,色谱柱为 Shimpack DIO L-
300,流动相为 H2O,流速 1 mL /min,进样量为 50
μL。根据已知标准葡聚糖相对分子质量和其相对应
的出峰时间绘出标准曲线 , GLPG和 GLPW的相对
分子质量分布由色谱工作站根据所绘出标准曲线计
算 ,分别得出 GLPG和 GLPW相对分子质量与分
布 ,其相对应的相对分子质量分布数据见表 2。
表 2　 GLPG和 GLPW的相对分子质量分布数据
Table 2　 Relat ive molecular weight distribution
of glycopept ide in GLPG and GLPW
组　份 重均 (M w ) 相对分子质量 (M n) 黏均 (Mη)
分布宽度指数
(n= Mw /Mn)
GL PG 512 583 262 301 620 558 1. 95
GLPW 584 931 366 268 695 755 1. 60
　　由图 1和表 2可见 ,两者具有非常相似的相对
·873·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
分子质量分布。 GLPG的 Mw为 5. 13× 105 ,Mη为
6. 21× 105 ; GLPW 的 Mw 为 5. 85× 105 , Mη为
6. 96× 105。
Ⅰ -GLPW　Ⅱ -GLPG
图 1　 GLPG和 GLPW相对分子质量分布
Fig. 1　 GPC spectra of glycopeptides
f rom GLPW and GLPG
2. 3　多糖肽组份及摩尔比 [7, 8 ]: 取单糖标准样品 5
mg和样品水解后冷冻干燥 ,称重 ,分别制备成单糖
三甲基硅烷样品 ,注入气相色谱 ,确定各出峰时间及
峰面积。色谱条件:岛津 GC- 16A, OV-17, 2. 1 m、
直径 3. 3 mm填充柱 ,柱温 130℃ ,进样器温度度
230℃ ,检测器温度 230℃ ,载气 N2= 40 mL /min,
H2= 40 mL /min, AIR= 400 mL /min。进样量为 0. 4
μL。根据单糖质量 /峰面积之比 ,求出水解多糖中各
单糖质量 ,转化为物质的量除以各自的相对分子质
量为摩尔比。 气相色谱分析表明 , GLPG和 GLPW
均 由 D-葡萄糖 ( Glc )、 D-半乳 糖 ( Gal )、果糖
( Fruct )、 D-木糖 ( Xyl )、 D-鼠李糖 ( Rha )组成。
GLPW尚含有微量甘露糖 ( M an) ,说明二者组份中
单糖构成基本一致。 GLPG摩尔比为 Rha∶ Xyl∶
Fruct∶ Gal∶ Glc = 0. 549∶ 3. 614∶ 3. 167∶
0. 556∶ 6. 89; GLPW 的摩尔比为 Rha∶ Xyl∶
Fruct∶ Gal∶ Man∶ Glc= 0. 793∶ 0. 964∶ 2. 944∶
0. 167∶ 0. 387∶ 7. 94。
2. 4　波谱分析鉴定: GLPG和 GLPW 的 IR,
1 H-NMR, 13 C-NMR光谱基本一致 ,说明两者具有相
同的结构 [2, 3, 8～ 10 ]。
3　讨论
草栽灵芝多糖肽提取率是段木灵芝子实体的
2. 8倍左右。经透析截留大分子部位多糖肽分别为
GLPG和 GLPW两者均占粗多糖的 35% ～ 36% ,
均由葡萄糖 ( Glc)、半乳糖 ( Gal)、果糖 ( Fruct )、木糖
( Xyl )、鼠李糖 ( Rha )组成 ,凝胶色谱和高效液相色
谱证明均为一样的生物高分子化合物。 从光谱数据
可看出两者化学构型相似 ,均以 β -型糖苷键为主外 ,
尚有α-型糖苷键。
草栽灵芝多糖得率受灵芝栽培季节和子实体收
成期影响较大 ,其规范化栽培技术显得十分重要。由
于灵芝多糖种类多而复杂 ,同时受到分离条件与分
析方法的限制 ,草栽灵芝多糖肽的肽键与糖的连接
方式尚未最终确定 ,以及该结构和其药理作用关系
尚待进一步研究。
致谢:光谱由中国科学院福建物质结构研究所
测定 ,相对分子质量和多糖组成由福建师范大学实
验中心和生物工程学院测定 ,氨基酸由国家医药管
理局福建省微生物研究所测定。
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