全 文 ：·1824· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
·药理与临床·
水仙提取物对人类多发性骨髓瘤细胞系ARH一77增殖和凋亡的作用
刘静1，胡维新”，何莉芳2
(1．中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南长沙410078
2．中南大学湘雅医学院生物学教研室，湖南长沙410078)
摘 要：目的 研究水仙提取物对人类多发性骨髓瘤细胞系ARH一77的增殖及凋亡的影响，方法采用MTT法
检测水仙提取物(1．25、2．5、5、10、20ttg／mL)作用ARH一77细胞3d后细胞存活率的变化}采用荧光染色法观察
水仙提取物(10／tg／mL)作用3d对ARH77细胞凋亡的影响，流式细胞仪分析细胞周期时相变化和检测细胞凋
亡率}核仁组织区(NOR)相关嗜银蛋白(AgNOR)染色法检测细胞NOR的改变l透射电镜观察细胞亚微结构变
化。结果水仙提取物能明显抑制ARH一77细胞增殖，降低细胞存活率(尸细胞凋亡(P融合(P关键词：水仙提取物；人类多发性骨髓瘤f细胞增殖}细胞凋亡
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)121824—04
EffeetsofextractfromⅣ口rcissustazettavar．chinensiso proliferation
andapoptosisfhumanmultiplemy lomacellineARH一77
LIUJin91．HUWei—xin2．HELi—fan92
(1ResearchCenterofMolecularBiology．XiangyaSchoolofMedicine，CenterSou hUniversity，Changsha410078，China；
2．DepartmentofBiology。XiangyaSchoolofMedicine。CenterSou hUniversity．Changsha410078，China)
Abstract：ObjectiveTostudyth ffectsofextractfromNarcissustazettavat．chinensiso prolifera—
tionandapoptosisfhumanmultiplemy lomacelllineARH一77．MethodsT esurvivalrateofcellswere
testedbyMTTassaywhencellswereaffectedbyl_25，2．5，5，10，20tLg／mLoftheextractfor3d．After
beinginducedby10btg／mLofthextractfor3d，apoptoticcellswereobservedwithfluorescencestain；
changesofthecellcyclew reanalyzedbyFlowCytometry；thenumb randshapeofnucleolarrganizer
region(NOR)weretestedbyAgNORassayndsubmicroscopicstructurewe eobservedbytransmission
electronmicroscope．ResultsThextractfromN．tazettavay．chinensiscouldsignificantlyinhibitthe
proliferationandreducethesurvivalrateofARH一77cells(Papoptosismorphologiccellswereseen，therateofapoptosiscellswereincreased(PcyclewasarrestedatG2／Mphase(P<0．01)inthexperimentalgroup；thenxtractfromN．tazetta
var．chinensiscouldmakethenumberofAgNOR(P<0．001)decrease，thee llfusioninAgNOR(尸<
0．01)accelerate．andthesubmicroscopicstructuresofe llchange．ConclusionThextractfromN．
tazettavar．chinensiscouldobviouslyinhibittheproliferationandinducetheapoptosisfARH一77cells．
Keywords：theextractfromNarcissustazettavar．chinensisRoem．；humanmuhiplemy loma；cell
proliferation；eellapoptosis
水仙NarcissustazettaL．var．chinensis
Roem．属石蒜科植物，而石蒜科是20种富含生物
碱的植物之一。到目前为止，已在石蒜科中发现了约
500种结构各异、生物学功能不同的生物碱，其中有
的已经运用到临床治疗01。从水仙中提取的活性化
合物单体包括伪石蒜碱(pseud01yco“ne)、石蒜碱
(1ycorine)、多花水仙碱(tazettlne)、漳州水仙碱等
多种生物碱。研究报道，石蒜碱具有选择性抗白血病
收稿日期：2005—02—20
基金项目；国家自然科学基金资助项目(39880021I30500269)
作者简介：刘静(1971)t女。湖南永州人，副教授．博士，主簧从事多发性骨髓瘤及白血病治疗的细胞及分子机制研究
Tel：(0731)4805449E—mail：llujing@xysmnet
*通讯作者胡维新
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 825·
活性口3；从石蒜科中提取的一种富含谷氨酸盐的抗
真菌肽具有免疫调节和增殖抑制作用[31。
多发性骨髓瘤是～种严重危害中老年人身体健
康的恶性血液肿瘤，目前，化学药物治疗仍是治疗多
发性骨髓瘤的主要手段。而现存的化疗药物多具有
不良反应的缺陷。因此，发现新的抗肿瘤药物是肿瘤
治疗和新药设计的重要目标，而中草药由于富含多
种天然活性化合物，资源丰富，取材简单，几千年来
一直广为民用，是新药的主要来源之一。本研究以人
类多发性骨髓瘤细胞系ARH77细胞为实验材料，
对经水仙提取物作用后的ARH一77细胞进行了细
胞增殖、细胞凋亡、细胞超微结构等方面的实验，旨
在探讨水仙提取物的抗肿瘤作用及其机制。
1材料
1．1药品：水仙购白花卉市场，经鉴定为正品。水仙
茎、叶提取物由中南大学湘雅医学院分子生物学研
究中心制备。即取处于开花期的新鲜水仙茎、叶洗
净，榨汁，离心取上清液。溶液分别经醋酸和氢氧化
铵处理后，再经氯仿、乙醚等有机溶剂抽提并干燥
后，溶解于二甲基亚砜(DMsO)中。制得的生物总
碱混合物质量占茎、叶鲜质量的0．2％。经高效液相
色谱分析，提取物中主要含石蒜碱、多花水仙碱等生
物碱“]。临用前用无血清的RPMI一1640培养基稀
释，培养基中DMSO终体积分数≤0．2％。
1．2细胞系：人类多发性骨髓瘤(multiplemyelo—
ma，MM)细胞系ARH一77(ATCC)，由美国阿肯
色大学医学院田尔明博士赠送。
1．3 主要试剂：RPMI一1640培养基购自Gibco公
司，小牛血清购自华美生物工程公司，吖啶橙
(AO)、溴化乙锭(EB)、噻唑蓝(MTT)、DMSO、碘
化丙啶(PI)购自Sigma公司，RNaseA为生命技
术公司产品，硝酸银(AgNO。)、白明胶及其他试剂
均为国产分析纯。
2方法
2．1 MTT实验：为观察不同质量浓度水仙提取物
对ARH一77细胞的生长抑制作用，将对数生长期的
ARH一77细胞以l×105／mL接种于96孔培养板
中，每孔200pL，每组重复4孔。实验组分别加入不
同质量浓度(1．25、2．5、5、10、20pg／mL)水仙提取
物，对照组加入等体积的RPMI一1640溶液，另设空
白组(不加细胞)作为调零iL，水仙提取物作用细
胞3d后，按文献方法进行MTT实验口]。实验独立
重复3次。根据下列公式计算ARH一77细胞的存活
率，并计算Ics。值。
存活率=实验组Asro值／X十照组AⅢ值×100％
2．2荧光染色观察细胞凋亡：对数生长期的ARH
77细胞以1×105／mL接种，实验组细胞经10．0
／-g／mL(预试验表明此为最佳作用质量浓度)水仙
提取物作用3d，分别取对照组和实验组ARH一77
细胞悬液5pL于载玻片上，加5止荧光染色液
(AO／EB，0．1mg／mL)染色1min，盖上盖玻片。在
荧光显微镜下观察，根据细胞的显色及其核结构辨
认凋亡细胞。每张玻片任选10个视野计数固缩核和
细胞核总数来计算细胞凋亡率。
细胞凋亡率一固缩核数／细胞核总数×100％
2．3流式细胞仪分析细胞周期变化：对数生长期的
ARH一77细胞以1×105／mL接种，然后分别收集对
照组和经10．0}tg／mI，水仙提取物处理3d的实验
组ARH一77细胞各1×106个，PBS洗涤后用4℃
预冷的70％乙醇固定，20pg／mLRNaseA消化后
经50tlg／mLPI染色，流式细胞仪检测，CellQuest
软件分析细胞周期时相分布。
2．4 核仁组织区(nucleolarorg nizerregion，
NOR)相关嗜银蛋白(AgNOR)染色，分别收集对
照组和经10．0／-g／mL水仙提取物处理3d的实验
组ARH一77细胞，PBS洗涤后，制备成细胞悬液进
行滴片；固定液甲醇一冰醋酸(3：1)固定5min；70
℃恒温避光潮湿环境下滴上AgNOR工作液(2％
甲酸明胶液与50％硝酸银按1：2体积比混合)染
色3min，双蒸水反复冲洗；95％～100％系列乙醇
脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张滴片观察
1。0个以上细胞的核内AgNOR颗粒数，按照《关于
AgNOR研究工作的标准化方案》(全国核仁组织区
学术研讨会制订的上海方案)观察其形态并计数“]。
2．5透射电子显微镜观察细胞超微结构：分别收集
对照组和经10．0tzg／mI，水仙提取物处理3d的实
验组ARH77细胞，经固定、漂洗、脱水、包埋、修
块、切片、染色、电镜观察。
2．6统计学分析：实验结果以．27土S表示，采用方差
分析和f检测判定显著性差异。
3结果
3．1水仙提取物使ARH一77细胞的存活率下降：
经不同质量浓度的水仙提取物处理后ARH77细
胞存活率显著下降，与对照组相比，差异显著(P<
0．01、0．001)，见表1，其lc。值为4．8pg／mL。细胞
存活率与水仙提取物的质量浓度呈负相关。
3．2水仙提取物能诱导ARH一77细胞凋亡，阻滞
细胞周期于G。／M期：荧光显微镜下，对照组细胞
万方数据
·1826· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
寰1永仙提取物对ARH一77细胞存活率
的影响(；土j，^一4)
TableI EffectofextractfromN．tazettavar．chinensis
onviabilityofARH一77cells“士s·H=4)
与对照组比较：+。Pdo-0l⋯Pdo001
一，<0，01⋯P的细胞核结构正常，染色均匀，95％以上呈绿色，为
活细胞；实验组中大量细胞体积缩小，核浓缩；核呈
浓集的绿色或桔黄色荧光，为早期凋亡细胞；小部分
细胞具有核碎裂及凋亡小体等现象，为晚期凋亡细
胞。经流式细胞仪检测，实验组凋亡率较对照组明显
增加(P显E调(P<0．01)，见表2。
表2水仙提取物对ARH*77细胞凋亡及细胞周期
分布的影响“土s．月一3)
Table2 EffectofextractfromN．tazettavat．chinensis
onapoptosisandcellcyclesofARH一77cells
(；士s，H=31
组别 摘亡率／％
细胞周期分布／％
G。／G】 S G2
与对照组比较：。P<05 ’’Pd01
。，3．3水仙提取物使ARH一77细胞的核仁类型改
变、数目减少：实验组细胞的AgNOR类型从弥散
型向聚集型转变(P<0．01)，见表3；实验组细胞的
AgNOR颗粒均数明显减少(．P<0．001)，见表4。
衰3 ARH一77细胞核中AgNOR形态分布
Table3 FormsofAgNORinnucleusofARH一77cells
驯自胞m散一—j辈娑竺竺里二一单一型 弥散型 聚集掣 棱仁内型1丽一面r—面丽五百磊焉而万i1再万—i币i石丁
实验 530 202(38．11)107(2019)205(3868)16(302)
3．4水仙提取物使细胞超微结构改变：对照组细胞
亚微结构完好。而实验组大部分细胞胞体缩小，细胞
表面的微绒毛减少或消失；胞质中滑面内质网和粗
面内质网均出现增生和扩张，甚至肿胀和空泡化改
变；线粒体数目增加、嵴增多；大部分细胞内细胞核
移位、边集；染色质凝聚浓缩成团块状、新月形、弧形
边集于核膜下。少数细胞内可见形态大小不一的凋
表4 ARH一77细胞核中各型AgNOR颗粒数
比较(；±j，^一4)
Table4 NumberandshapesofdifferentAgNOR
innueleusofARH一77ceIIs(i士s，n一4)
与对照组比较：一P一P<01 ⋯P亡小体。
5讨论
肿瘤及许多人类疾病都是细胞周期性疾病”]。
细胞周期事件的调和主要发生在G，／S和Gz／M的
转换期，其通过～系列的检测点而执行‘”。已经证
明，肿瘤的发生是由于这些检测点的许多调节因子
丢失或功能停滞[9]，而一些抗肿瘤药物能够修复已
改变的检测点。植物类抗肿瘤药物的筛选和有效成
分的分离是当前新药研发的重要策略之一。实践证
明多种植物生物碱具有良好的抗肿瘤作用。临床使
用的主要有：长春新碱、长春碱，喜树碱及其衍生物，
三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱，苦参碱、氧化苦参碱等。
石蒜治疗肿瘤的报道最早在公元前4世纪，右蒜碱
具有抗白血病活性⋯，氧化石蒜碱对艾氏腹水癌和
肝癌腹水型小鼠的寿命延长率为12l％～
192％”“¨]。伪石蒜碱能延长Rauscher白血病脾肿
大小鼠的寿命“⋯。而石蒜科植物水仙中同样富含多
种具有抗肿瘤作用的生物碱，本实验结果显示水仙
提取物能显著抑制肿瘤细胞增殖，降低肿瘤细胞的
存活率，阻滞细胞周期于G。／M期；细胞形态学观
察表明水仙提取物能诱导肿瘤细胞凋亡的发生。这
预示着水仙提取物参与了细胞内凋亡、周期相关的
信号传导通路的调控。核仁组织区相关嗜银蛋白
(AgNOR)是一组与核糖体RNA(rRNA)转录有
关的酸性蛋白，可能是RNA聚合酶I的亚单位或
rDNA转录的调节蛋白，也可能是一种酸性的磷酸
化蛋白C。。(核仁素)和B。。蛋白。只有当rRNA基
因转录活性达到一定阈值，NOR才能被银染色，否
则不能被银染色l”]。实验发现经水仙提取物作用后
AgNOR颗粒均数明显减少，类型从弥散型向聚集
型转变，这说明水仙提取物作用后，有效地抑制了细
胞内rRNA基因转录活性，从而影响细胞的增殖
能力。
水仙提取物能显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤
细胞凋亡。本研究将为深入揭示水仙提取物抗肿瘤机
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 827·
制提供理论和实验基础；为进一步开展方剂研究提供
策略；为临床治疗多发性骨髓瘤及其他恶性肿瘤开辟
新的道路，具有重要的理论意义和应用前景。
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泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响
米其武1，曹正国2，刘继红1，吴继洲3，尹眷萍3，周四维1，叶章群1
(1华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北武汉430030{2．安徽省立医院泌尿外科
安徽合肥230001；3．华中科技大学J司济医学院药学院，湖北武汉430030)
摘要：目的研究泽泻有效部位对大鼠肾草酸钙结石形成和肾组织骨桥蛋白(OPN)表达的影响，探讨泽泻抑制
尿结石形成的机制。方法采用现代植化和生物活性导向分离的方法分离、提取泽泻的有效部位=将30只大鼠随
机分成3组：对照组、模型组、泽泻组。以乙二醇和1a羟基维生素D。-g制备大鼠肾革酸钙结石模型。检测各组大鼠
血及尿生化、肾ca抖水平、24h尿草酸分泌量和肾组织病理学改变，并采用免疫印迹(Westernblotting)和半定量
逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)分别观察各组大鼠肾组织OPN蛋白及其mRNA的表达水平。结果19泽泻有
效部位(主要以四环三萜类化台物为主)大鼠的血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、肾caH水平、24h尿cah分秘
量、肾组织草酸钙晶体的分布、OPN蛋白及其mRNA的表达水平均显著低于模型组(尸部位能抑制大鼠肾组织OPN的表达，减少肾组织草酸钙结晶的沉积，从而能有效抑制大鼠肾草酸钙结石的形成。
关键词：泽泻；尿石；骨桥蛋白；草酸钙
中圈分类号：R285，5 文献标识码：A 文章编号：02532670(2005)12182705
EffectsofactivefractionofAlismaorientaleonosteopontinexpressioninrenaltissue
ofurolithiasismodelratwithcalciumoxalates one
MIQi—wul，CAOZheng—gu02，LIUJi—hon91，WUJizhou3，YINChun—ping3，
ZHOUSiweil，YEZhang—qun。
(1．DepartmentofUrology，AffiliatedTongjiHospitalofTongiiMedicalCo lege，HuazhongUniversityofScience
andTechnology，Wuhan430030．China；2．DepartmentofUrology，AnhuiProvincialHospital，
Hefei230001，China；3．SchoolofPharmacy，TongjiMedicalCo lege，Huazhong
UniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China)
警鎏品眢；瞀蒙召蒙毳学基金资助项目(39970891)
作者简介。意薏鼍舅器学丢；；嚣裹嘉}嚯!；爿：专慧、景师75@’在1读63博．co士rn研究生，主要从事泌尿外科尿石症和膀胱肿瘤的研究
L
[
[
[
啪
旧
嗍
_三_
Ⅲ
切
啪
万方数据
水仙提取物对人类多发性骨髓瘤细胞系ARH-77增殖和凋亡的
作用
作者： 刘静， 胡维新， 何莉芳， LIU Jing， HU Wei-xin， HE Li-fang
作者单位： 刘静,胡维新,LIU Jing,HU Wei-xin(中南大学湘雅医学院,分子生物学研究中心,湖南,长沙
,410078)， 何莉芳,HE Li-fang(中南大学湘雅医学院,生物学教研室,湖南,长沙,410078)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 1次

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8. 侯健.尚佩沛 多发性骨髓瘤的整体治疗策略[会议论文]-2010
9. 郭瑰玉 多发性骨髓瘤肾虚血瘀本质探讨[学位论文]2007
10. 刘静.胡维新.韦超凡.刘艳平.何莉芳 白色念珠菌分泌物对人类多发性骨髓瘤细胞作用机制的初步研究[期刊论
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