全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
假阳性或假阴性结果的产生。尤其在量效关系中应
该选取呈现线性关系剂量范围内敏感度最大的剂量
(即减少或增加给药都会使效应指标有统计学改
变)。本实验为下一步研究HED配伍应选用的给药
时间和给药剂量提供了参考。
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抗癫痫肽重组腺伴病毒载体的构建及鉴定
王宗仁1，邵中军2“，李晶华1，行利1，马静1，龙锢1，张磊2，赵艳玲1
(1．第四军医大学附属西京医院中医科，陕西西安710032；2．第四军医大学流行病学教研室
陕西西安7]0032；3．复旦大学公共卫生学院流行病教研室，上海200023)
摘要：目的为了研究蝎毒癫痈肽对癫痈模型的治疗作用，构建并产生重组腺伴病毒(AAV)载体。方法将
AEP外源性核酸片段插人AAV—shufer质粒pSSHG—Neo的KpnI—BamHI位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒
pFGl40、包装质粒pAAV／Ad及构建的pSSHG—AEP三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎293细胞系中同源重组包
装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果成功构建了重组病毒质粒pSSHG／AEP，经
蔗糖梯度离心法获得rAAV组分。梯度稀释测得滴度为1．46×10”PFU／mL。结论成功地制备了AEP重组腺伴
随病毒(rAAV／AEP)载体，为癫痈基因治疗实验奠定了基础。
关键词：抗癫痫肽；腺伴病毒载体；构建
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12—1844—03
Constructionandide tificationofrecombinantadeno—associatedvirus
transducingantiepi|epsypeptidegene
WANGZong—renl，SHAOZhong—jun2，LIJing—hual，HANGLil，MAJin91，
LONGYinl．ZHANGLei2．ZHAOYan—lin91
(1．DepartmentofTraditionalChineseMedicine，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032
China；2．DepartmentofEpidemiology，theFourMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，Chinal3．Department
ofEpidemiology，SchoolofPublicHea th，FudanUniversity，Shanghai200023，China)
Keywords：antiepilepsypeptide；adeno—associatedvirus(AAV)；construction
中医采用全蝎治疗脑病已有近千年的历史E“。
本草记载全蝎具有镇痉、熄风的作用。抗癫痈肽
(antiepilepsypeptide，AEP)是从东亚钳蝎Buthus
martensilKarsch中分离出的一种多肽，由61个氨
基酸残基组成，相对分子质量为8300，属于蝎毒长
链神经毒素。近年研究显示其能降低实验动物癫痫
的发生率、延长癫痫发作的潜伏期、缩短癫痫发作的
持续时间‘“⋯，而且能抑制癫痫的反复发作‘“⋯。本研
究拟利用其生物学作用，为进一步尝试癫痫的基因
治疗奠定基础。
收稿日期：20050322
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30671764)
作者简介：王宗仁(1954)，男，河南灵宝人，主任医师，教授，博士生导师，发表文章60余篇．获陕西省科技进步二等奖和军队科技进步
二等奖各一项，主要研究方向为分子中药学和心血管疾病的中药防治。
Tel{(029)82376992Email：zoagren@fmmu．edu．ca
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 845·
1材料
2型腺伴病毒载体pSSHG—Neo、293细胞系、
腺伴病毒包装辅助质粒pAAV／Ad、腺病毒质粒
pFGl40和大肠杆菌EcoliDH5a由西安华广生物
工程公司提供。限制性内切酶(EeoRI，KpnI和
BamHI)、T4DNA连接酶、胰蛋白酶、蛋白酶K购
自西安华美生物工程公司。
2方法
2．1 AEP目的基因的获取：异硫氰酸胍～步法提
取AEPRNA。取全竭(东亚钳蝎B．martensil
Karsch，笔者亲自鉴定)2只，75％乙醇浸泡消毒处
理，剪取尾钳，放入研钵中，制备组织匀浆；加入2
mol／I．乙酸钠100止和等体积的水饱和酚、200“L
氯仿一异戊醇，12000r／rain离心10min，取水相，异
丙醇沉淀。12000r／rain离心10min，收集沉淀，乙
醇洗涤，干燥处理，二乙基焦磷酰胺(DEPc)处理
的水溶液溶解，备用。
2．2 RT—PCR扩增AEP基因：取胚总RNA3 p-g，
按AMV第1链cDNA合成试剂盒中说明合成cD
NA第1链。反应体系为5×反应缓冲液4,uL；10
mraol／LdNTP4gL；20U／}tL核糖核酸酶抑制剂
l“L；200U／gLAMV逆转录酶l止；加无核酸酶
去离子水至总体积25pL。37℃、5rain，42℃、1h，
70℃灭活10min，以所获cDNA为模板，用Taq
DNA聚合酶扩增AEP基因全序列，长度为287bp。
PCR引物设计为：正向引物：5r_GCGAATTCAT—
GAAAcTATTTcTTTTAcTAG；负向引物：5’一
GCGGATCCTTACTTTTTTCCACCG—CATG。
PCR扩增反应体系为：AEPcDNA模板2p．L；10×
反应缓冲液2．5pL；20vmol／I，上下游引物各0．5
pLI10mmo|／LdNTP0．5pL；25mmol／LMgCl2
1．5”L；TaqDNA聚合酶0．51pL，加去离子水至总
体积25“L。PCR反应条件：94℃、1rain，94℃、
40s，55℃、40s，72℃、lmin，30次循环后，72℃
延伸5min，1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
2．3 PCR产物克隆：PCR产物18ng与pGMT
easyvector载体50“g混合，于10pL体系16℃
连接过夜，得连接产物pGMT／AEP。取适量上述连
接反应液转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布于含氨苄
青霉素、IPTG及X—gal的LB平板进行蓝自筛选。
2．4阳性重组克隆的筛选：挑取白色菌落3个，转
入含适量氮苄青霉素的LB培养液中，37℃过夜培
养。用碱裂解法少量制备质粒pGEM—T／AEP，重组
质粒用HindⅢ和BamHI双酶切鉴定。同时用蓝色
菌落质粒酶切作阴性对照，测序鉴定。
2．5包装病毒：大量制备的pSSHG／AEP、辅助质
和腺病毒质粒pFGl40应用磷酸钙共沉淀法介导
3质粒共转染80％融合的293细胞。加入10％胎
牛血清的RPMI一1640培养基，37℃培养72h。
2．6重组病毒颗粒的回收、纯化与滴度测定：培养
液中加入细胞悬液，反复冻融，裂解液56℃灭活腺
病毒，蔗糖密度梯度离心纯化病毒颗粒。标记探针，
采用斑点杂交法观察实验结果，确定滴度。
3结果
3．1目的基因的获取及
鉴定：PCR扩增产物经
1％琼脂糖凝胶电泳鉴
定，PCR产物长度在280
bp左右。与基因bank中
AEP片断长度一致，初
步证实为AEP(图1)。
3．2 PCR产物的克隆
及酶切鉴定：PCR产物
在连接酶的作用下直接
克隆到pGEM—T载体
中，转化后挑选阳性菌
落，经HindⅢ和BamH
I双酶切鉴定，获得684
凰1 AEPCR产物的
电泳分析
Fig．1Electrophoretic
analysisofAEP
PCRproduction
bp左右条带，证实扩增片断已插入载体中(图2)。
A—MarkerBlamdaDNAHindI消化的核酸标尺，相对分子
质量分别为23．13、9．41、6．55、436、2．32和202KbC
pGEMTAEP质粒Ecoi1单酶消化D—pGEMT—AEP质粒
BamHI单酶消化EpGEMT—AEP质粒对照
ADNAladderB—lamdaDNAcleavedbyHindmforindicator．
23．13，9．41，6．55，4．36，2．32，and2．02KbC—pGEMT
AEPcleavedbyEcolI D—pGEMT—AEPcleavedbyBarnHI
EpGEMT—AEP
圈2构建质粒的酶切鉴定
Fig．2Identificationofplasmidconstruction
万方数据
·1846· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
3．3重组质粒鉴定：经过HindⅢ和BamHI双
酶切及PCR鉴定，电泳显示重组质粒可以切出相
应的AEPDNA条带，PCR产物电泳亦显示相应片
断的条带(图3)。
A—pSSHCCMV—AEP质粒对照BpSSHCCMV—AEPBamHI
单酶消化C—pSSHCCMV—AEP质料EcolI单酶消化Dlain—
daDNAHind_消化的核酸标尺，相对分子质量分别为83．13、
9．41、655、4．36、2．32和2．02Kb|E—Maker
ApSSHCCMV—AEpB pSSHCCMV—AEPcleavedbyBamHI
CupSSHCCMVAEPcleavedbyEcoiI D-lamdaDNAcleaved
byHindⅢforindicator：23．13，941，655，436．232，and
2．02KbE—Maker
田3 pssHccMv·AEP酶切鉴定
Fig3 IdentificationofplasmidpSSHCCMV—AEP
3．4 AEP目的基因片断序列测定：表达载体测序
结果分析显示，与基因bank中的AEPmRNA序
列完全一致，证实AEP基因已经定向克隆到表达
载体中(图4)。
3．5 rAAV—AEP鉴定：地高辛标记的斑点杂交结
果显示，稀释64倍的病毒毒液与稀释10倍的毒液腺
伴病毒穿梭质粒载体的杂交信号一致。计算病毒滴
度，约在1．46X10”PFU。计算方法：质粒pSSHG／
AEP相对分子质量=(7060bp+287bp)×635—
4665345。未稀释时质粒定量为I／19／ttL，每微克质
粒中的分子个数=摩尔数／相对分子质量一6．02×
1024×2／4665345—2．47×1012PFU／mL。
4讨论
腺伴病毒(adeon—associatedvirus，AAV)近
年来因其独特的优势越来越受到重视，其无潜在致
病威胁，同时能稳定地表达外源基因，宿主范围广，
可转染分裂期及非分裂期细胞，且转染效率高，是基
因治疗的良好载体。抗癫痫肽是从东亚钳蝎中分离
出的一种多肽，能降低实验动物癫痫的发生率、延长
癫痫发作的潜伏期、缩短癫痫发作的持续时问。但由
于受到稳定性差、体内半活期短、化学合成的成本
圈4 AEP目的基因片断序列分析
Fig．4SequenceanalysisofAEPgenefragment
高、很难获得工业化的产量等多肽类药物所固有的 serrulatusscorpionve oroinducedspontaneousrec rrent
局限，癫痫肽用于治疗类风湿性关节炎的临床实践 3e—izur：⋯4“3y““”prouting⋯印“epsla，2”2·43
也必将遇到严峻挑战。以重组病毒为基础的基因治 [2]w。：：cG，H。xL，sh。。F．4“Mole。。l⋯har。。。。。。
疗技术为蜂毒肽的临床应用开辟了新方法。基因治tionotanantiepilepsyeptldefromthescorpionButhus
疗最初应用于一些遗传性疾病，同时也为需要长期 篡““‰““[’]’““7“““”’2”1’268”’2248“
给药的慢性病等病患提供了机会卧]。 D]SandovnlMR，DorceVA Behavi⋯ralnde]ectroen一
本研究利用癫痫肽抗癫痫作用，采用现代生物 ：；竺酱‘芝=：嚣?蒜f岽三：；．”“””⋯⋯“
工程研究中的重组病毒技术，将合成编码蜂毒肽的 [4]Bo。ilh。L，Cend。。F，GhizoniEⅢ。1．Epil。psyd。。t。d一
基因克隆到AAV载体中，实现基于中药组分的基 ”uc“vebrainlesion。”edbyascwpionsting_J]·Arch
因治疗。本实验为生物活性肽的临床使用寻找可行 [。]麓2；翟：，：：麓J1．甜294-。12916。．hIb。。。，，。ffe。。。fre⋯bi一
性方法，也为以肽类为主要活性物质且资源有限的 flanteurotoxinBmKlMonseizuresinducedbypentylenete
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万方数据
抗癫痫肽重组腺伴病毒载体的构建及鉴定
作者： 王宗仁， 邵中军， 李晶华， 行利， 马静， 龙铟， 张磊， 赵艳玲， WANG Zong-ren，
SHAO Zhong-jun， LI Jing-hua， HANG Li， MA Jing， LONG Yin， ZHANG Lei， ZHAO
Yan-ling
作者单位： 王宗仁,李晶华,行利,马静,龙铟,赵艳玲,WANG Zong-ren,LI Jing-hua,HANG Li,MA
Jing,LONG Yin,ZHAO Yan-ling(第四军医大学附属西京医院,中医科,陕西,西安,710032)，
邵中军,SHAO Zhong-jun(第四军医大学,流行病学教研室,陕西,西安,710032;复旦大学公共
卫生学院,流行病教研室,上海,200023)， 张磊,ZHANG Lei(第四军医大学,流行病学教研室
,陕西,西安,710032)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 3次

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