全 文 ：微生物发酵炮制对红花抗氧化活性的影响
冯志华1, 孙启玲13 , 米　坤1, 罗　强2Ξ
(11 四川大学生命科学学院, 四川 成都　610064; 21 乐山师范学院 环境与生命科学系, 四川 乐山　614004)
摘　要: 目的　研究地衣芽孢杆菌C2213 发酵炮制对红花抗氧化活性的影响。方法　邻二氮菲2Fe2+ 氧化法测定羟
自由基清除率, 比色法测定红细胞的溶血作用、肝脂质过氧化物含量, H PL C 法分析发酵产物。结果　红花经C2213
的发酵炮制其抗氧化功效显著提高。H PL C 分析还观察到红花中一些成分发生了改变。结论　红花中一些有效成
分可能是经C2213 的生物转化提高了其抗氧化功效。
关键词: 红花; 地衣芽孢杆菌; 发酵; 炮制; 抗氧化
中图分类号: R 286102; R 286175　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 06 0630 04
Effect on an tiox ida tive activ it ies of dr ied f lower of Ca r tham us tinctor ius
processed by m icrobes ferm en ta tion
FEN G Zh i2hua1, SUN Q i2ling1, M I Kun1, LUO Q iang2
(1. Co llege of L ife Science, Sichuan U niversity, Chengdu 610064, Ch ina; 2. D epartm ent of Environm ent
and L ife Science, L eshan N o rm al Co llege, L eshan 614004, Ch ina)
Abstract: Object　Effects of B acillus lichen if orm is (W eigm ann) Chester C2213 on an t iox idat ive act iv2
it ies of dried flow er of Ca rtham us tinctorius L. (D FCT ) w ere studied. M ethods　C learance of hydroxyl
rad ica l w as determ ined by 1, 102phenan th ro line2Fe2+ ox idat ive assay. T he hemo lysis of red b lood cells,
M DA p roduct ion in hem atocyto lysis liver homogenate w ere m easu red by co lo rim etric assay. P roducts of
ferm en ta t ion w ere analyzed by H PL C. Results　C2213 can increase great ly an t iox idat ive act ivit ies of
D FCT. U sing H PL C assay, it is ob served that the ferm en ta t ion and p rocessing by the st ra in can imp rove
the effect ive componen ts of D FCT. Conclusion 　Som e effect ive componen ts of D FCT m ay be b io tran s2
fo rm ed by C2213, so that the an t iox idat ive act ivit ies are p romo ted.
Key words: the dried flow er of Ca rtham us tinctorius L. (D FCT ) ; B acillus lichen if orm is (W eigm ann)
Chester; ferm en ta t ion; p rocessing; an t iox idat ion
　　微生物由于自身存在丰富的酶系而有着在温和
条件下分解转化物质的能力。通过微生物与中药共
发酵来进行中药炮制可以比一般的物理化学手段更
大幅度地改变药性, 提高药效, 降低毒副作用, 扩大
适应症。近年利用微生物发酵这一途径来炮制中药
已经成为中药研究的新领域[1 ]。
　　红花系菊科植物红花 Ca rtham us tinctorius L.
的干燥花, 在我国已有 2 100 多年的栽培与用药历
史, 为传统常用中药, 是活血通络、祛瘀止痛之良药。
近年来广泛用于多种瘀血阻滞, 血行不畅之症。药理
研究表明红花具有降血脂和抗血栓等作用, 有报道
红花水溶性成分还具有较强的抗氧化作用[2 ]。随着
自由基研究的发展, 发现自由基反应在许多血液循
环障碍中起了重要的损伤作用。本实验利用一株具
有较丰富酶系尤其是糖苷水解酶系的地衣芽孢杆菌
与红花共发酵, 研究了微生物发酵炮制对红花抗氧
化活性的影响, 并对其机制进行了探讨。
1　材料和方法
111　材料: H P1100 高效液相色谱仪 (惠普) , T u—
1800 紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限
责任公司)。
菌种为本实验室从自然界分离得到, 经鉴定是
一 株 地 衣 芽 孢 杆 菌 B acillus lichen if orm is
(W eigm ann) Chester, 编号为C2213。昆明种雌性小
鼠, 购于四川大学华西实验动物中心。
红花购于成都同仁堂药店, 经四川大学生命科
学学院许介眉教授鉴定系菊科植物红花Ca rtham us
tinctorius L. 的干燥花, 四乙氧基丙烷 (Sigm a)、硫代
·036· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
Ξ 收稿日期: 2003209219
基金项目: 四川省中医药管理局基金资助项目 (200214)
作者简介: 冯志华 (1977—) , 男, 河南三门峡人, 四川大学生命科学学院 2001 级硕士研究生, 主要从事微生物转化中药的研究。
T el: (028) 85410165　E2m ail: riset8848@ho tm ail. com3 通讯作者
巴比妥酸 (上海化学试剂公司) , 其他试剂均为市售
分析纯。
种子培养基为LB 培养基; 发酵培养基以蔗糖
和玉米粉为主要碳源, 以酵母膏为主要氮源, 还包括
K 2H PO 4 等无机盐类。
112　方法
11211　共发酵方法: 将红花全花 40 ℃下干燥, 粉碎
过 120 目筛, 根据需要按比例加入到发酵培养基中,
121 ℃灭菌 20 m in, 将 C2213 种子液按接种量
315% 的比例接种到发酵培养基, 44 ℃, 180～ 200
röm in振荡摇瓶培养 48 h。根据研究, 培养基中红花
在 0～ 30 göL 时, 对这一株地衣芽孢杆菌有促进其
生长的作用, 大于 30 göL 时对其生长有抑制作用,
因此在研究中红花的比例均控制在 0～ 30 göL。
11212　羟自由基清除率测定: 邻二氮菲2Fe2+ 氧化
法[3 ]。终体积为 50 mL 的反应液中含邻二氮菲 0175
mmo löL , FeSO 4 ·7H 2O 0175 mmo löL , pH 714 的
PBS 0115 mo löL 和不同浓度的待测样品, 最后加入
011% H 2O 2, 37 ℃水中振荡孵育 1 h 后, 立即在 536
nm 下测吸光度 (A ) 值。利用比色测定法, 通过A 536
变化反映羟自由基的氧化作用。按下式计算样品中
羟自由基的清除率, 其中药未损管为不加H 2O 2 加
有相应药品的样品, 药损管为加药和H 2O 2 的样品,
未损管为不加药、也不加H 2O 2 的样品, 损管为不加
药但加H 2O 2 的样品。
羟自由基清除率= (1- A 药未损- A 药损A 未损- A 损 )×100%
11213　H 2O 2 诱导的红细胞溶血作用的测定[4 ]: 小
鼠眼眶取血, 以肝素抗凝, 用 0101 mo löL pH 714 的
PBS 配成 5% 红细胞悬液。取此悬液 1 mL , 加入 100ΛL 样品或生理盐水, 混匀后 37 ℃温育 5 m in, 加入
终浓度为 100 mmo löL H 2O 2 启动反应, 37 ℃温育 1
h 后 3 000 röm in 离心 7 m in, 取上清液用 0101 mo lö
L pH 714 的 PBS 稀释 5 倍, 测定 540 nm 的A 值。
以不加样品和H 2O 2 为比色空白样, 以不加样品、加
H 2O 2 为对照样, 按下式计算样品的溶血抑制率。
溶血抑制率= A 对照- A 样品A 对照 ×100%
11214　小鼠肝自发性脂质过氧化作用的测定[4 ]: 小
鼠禁食 16 h, 眼眶放血后迅速取出肝脏, 用 4 ℃下预
冷的 0101 mo löL pH 714 的 PBS 洗涤并配成 5% 的
匀浆。取该匀浆 1 mL , 加入 30 ΛL 样品或生理盐水,
于 37 ℃温育 2 h, 加入 20% 三氯乙酸 1 mL 终止反
应, 3 500 röm in 离心 10 m in, 取上清液 118 mL 加
入 0167% 硫代巴比妥酸 (TBA ) 1 mL , 95 ℃水浴 15
m in, 取出后流水冷却, 于 532 nm 下测定A 值。以不
加肝匀浆和样品为比色空白样, 以加有肝匀浆、不加
样品为对照样, 以四乙氧基丙烷 (T EP) 为标准品绘
制标准曲线, 计算脂质过氧化产物丙二醛 (M DA ) 的
含量, 并按下式计算脂质过氧化物 (L PO )的清除率。
L PO 清除率= A 对照- A 样品A 对照 ×100%
11215　H 2O 2 诱导的小鼠肝脂质过氧化作用的测
定[2 ]: 按 11214 项下方法制备 5% 的肝匀浆, 取该匀
浆 1 mL , 加入 30 ΛL 样品或生理盐水, 37 ℃温育 5
m in 后加入 0125% H 2O 2 10 ΛL , 37 ℃温育 1 h, 以三
氯乙酸沉淀蛋白。按 11214 项下方法计算M DA 的
含量及L PO 抑制率。
11216　CC l4 诱导的的小鼠肝脂质过氧化作用的测
定: 各管中加入 5% 肝匀浆 1 mL 及样品或生理盐水
30 ΛL , 混匀后 37 ℃温育 10 m in, 再向各管中加入
CC l4 15 ΛL , 继续温育 50 m in。按 11214 项下方法计
算M DA 含量及L PO 抑制率。
11217　H PL C 法分析发酵产物: 色谱柱: C 18 (250
mm ×416 mm , 5 Λm ) ; 柱温: 25 ℃; 流动相: 乙醇2水
(1124∶8176) ; 流速: 013 mL öm in; 检测波长: 340
nm ; 进样量: 1 ΛL。
11218　统计学方法: 结果以x ±s 表示, 组间用 t 检验。
2　结果
211　C2213 发酵炮制对红花抗羟自由基氧化作用
的影响: 选取不同浓度红花与C2213 共发酵, 同时以
相应浓度的红花水浸液作为对照 (下同) , 比较发酵
液和水浸液的抗羟自由基氧化活性, 见表 1。当羟自
由基清除率 Cn—C0 > H n 时, 就认为 C2213 提高了
红花的抗氧化活性。其中C 0 为没有加红花但经过
C2213 发酵的样品; C 1, C 2, C 3 为加有相应质量浓
度 ( 1 0 , 2 0 , 3 0g öL ) 红花且经过C 2 21 3发酵的样
表 1　发酵炮制对红花抗羟自由基氧
化活性的影响 (x±s, n= 3)
Table 1　Effect of D FCT processed by fermen tation
on an tiox idative activ ities of hydroxyl
rad ica l (x±s, n= 3)
组别 羟自由基清除率ö% 组别 羟自由基清除率ö%
C0 42. 3±0. 7
C1 56. 6±0. 93 3 H 1 11. 5±0. 3
C2 72. 6±0. 33 3 3 H 2 21. 3±0. 3
C3 98. 7±0. 63 3 3 H 3 32. 1±0. 4
　　与 C0 组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101　3 3 3 P < 01001
(下同)
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101　3 3 3 P < 01001 vs C0 group
(Fo llow ing T ab les are sam e)
品; H 1, H 2, H 3 为相应浓度的红花水浸液 (下同)。
·136·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
红花在 0～ 30 göL , 经发酵炮制的红花比发酵前清
除羟自由基能力有较大幅度提高, 且有明显的量效
关系。在 30 göL 时, 羟自由基清除率达 7515%。
212　C2213 发酵炮制对红花抑制H 2O 2 诱导的红细
胞溶血作用的影响: 见表 2。发酵后红花对H 2O 2 诱
导的红细胞溶血的抑制作用得到显著提高且有明显
的量效关系。在 30 göL 时, 发酵后红花的红细胞溶
血抑制率达到 89160% , 较发酵前提高 43175%。
213　C2213 发酵炮制对红花抑制小鼠肝脂质过氧
化作用的影响: 见表 3。不同浓度红花水浸液在体外
能非常显著的抑制小鼠肝脂质过氧化物的产生, 经
C2213 发酵炮制后的红花抑制小鼠自发性肝脂质过 氧化、H 2O 2 诱导的肝脂质过氧化、CC l4 诱导的肝脂质过氧化作用得到进一步提高, 且作用强度在 0～30 göL 具有剂量依赖性。表 2　发酵炮制红花对 H2O 2 诱导的红细胞溶血作用的抑制作用 (x±s, n= 8)Table 2　Inh ibition of D FCT processed by fermen -ta tion on hemolysis of erythrocytesinduced by H2O 2 (x±s, n= 8)组别 溶血抑制率ö% 组别 溶血抑制率ö%C0 4. 82±0. 72C1 66. 86±6. 613 H 1 36. 47±6. 37C2 77. 11±5. 793 3 3 H 2 49. 26±7. 05C3 89. 60±9. 913 H 3 60. 33±8. 53
表 3　C2-13 发酵炮制对红花抑制小鼠肝脂质过氧化的抑制作用 (x±s, n= 8)
Table 3　Inh ibitory effects of D FCT processed by fermen tation on l iver MDA levels (x±s, n= 8)
组别
自发性
M DA ö(nmo l·g- 1) 抑制率ö% H 2O 2 诱导M DA ö(nmo l·g- 1) 抑制率ö% CC l4 诱导M DA ö(nmo l·g- 1) 抑制率ö%
C0 119. 03±9. 74 3. 42±0. 33 153. 68±10. 05 5. 78±0. 45 87. 79±8. 32 2. 14±0. 28
C1 87. 21±7. 10 29. 24±3. 723 3 3 123. 17± 9. 85 24. 49±2. 063 3 69. 87±7. 09 22. 12±1. 603 3 3
C2 69. 25±6. 37 43. 38±5. 873 3 95. 91± 7. 90 41. 20±3. 823 3 3 50. 65±6. 49 43. 54±4. 813 3 3
C3 54. 11±4. 23 56. 09±4. 383 3 64. 87± 6. 18 60. 23±4. 113 3 32. 27±4. 71 64. 88±6. 413 3
对照 123. 25±7. 01 0　　 163. 11±11. 28 0　　 89. 71±6. 41 0　　
H 1 105. 17±6. 03 14. 67±1. 68 139. 19± 9. 40 14. 66±1. 48 78. 15±5. 54 12. 88±1. 40
H 2 89. 51±6. 85 27. 38±3. 32 117. 33± 9. 09 27. 07±2. 09 63. 09±5. 43 29. 67±3. 02
H 3 70. 47±6. 29 42. 82±3. 82 93. 83± 8. 59 42. 47±4. 98 50. 87±4. 83 43. 29±4. 16
214　发酵产物的 H PL C 分析结果: 共对 5 种样品
进行了 H PL C 检测, 分别是未经 C2213 发酵、未加
红花的发酵液 (É ) ; 经过C2213 的发酵、未加红花的
发酵液 (Ê ) ; 未经C2213 发酵、加 30 göL 红花的发
酵液 (Ë ) ; 经C2213 发酵、加 30 göL 红花的发酵液
(Ì ) ; 30 göL 红花水浸液 (Í )。连续 3 次发酵, 每次
设置 3 个平行对照。É , Ê 样品在340 nm 下经H PL C
检测后并没有明显的特征吸收峰, 而Í 样品在此波
长下则有明显的吸收峰, 因此培养基中成分对分析
红花中有效成分发酵前后的变化并无影响。对比Ë ,Ì 色谱图 (图 1) 可以看出发酵后, 红花中有一个保
留时间为 71642 m in 的吸收峰消失, 还有一些新的
吸收峰出现, 这证明了C2213 对红花有效成分的发
酵炮制作用。
3　讨论
　　利用微生物发酵炮制中药古已有之, 且是一种
相当重要的炮制加工方法之一。从某种意义上讲, 虫
草是蝙蝠蛾幼虫经虫草菌、僵蚕是家蚕经白僵菌感
染发酵而成。其他如淡豆豉、半夏曲、红曲、麦芽也都
是通过发酵而形成的药物。现代发酵工程证实微生
物具有酯化, 氧化, 乙酰化, 还原化, 甲基化, 羟基化
和羰基化等多种能力, 此外微生物还具有催化立体
图 1　发酵前 (A)后 (B)红花的 HPLC 图
F ig. 1　HPLC of D FCT processed by fermen -
ta tion before (A) and af ter (B)
专一反应和区域专一反应的能力。因此利用微生物
发酵炮制中药实际上是一种生物转化反应。
　　红花作为一味活血通络、祛瘀止痛的传统中药
在近来的研究中发现具有较强的抗氧化活性。红花
中抗氧化的有效成分是具有酚羟基的黄酮类化合
物, 如红花黄色素、红花素、槲皮素等。本研究通过体
·236· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
外实验得到了C2213 发酵炮制红花提高了其抗羟自
由基氧化活性, 提高了其对小鼠肝脂质过氧化的抑
制作用的结果。由红花中各有效成分结构可以看出,
发酵后红花抗氧化活性的提高可能与C2213 所产生
的各种糖苷水解酶有关。红花中有许多糖苷类化合
物, 其中很多糖苷是酚羟基与葡萄糖缩合而成。如新
红花苷、62羟基山柰酚232O 2葡萄糖苷、62羟基山柰
酚272O 2葡萄糖苷、槲皮苷等。当糖苷水解酶将这些
糖苷键上的葡萄糖水解掉后, 就会使酚羟基的数目
大幅度提高, 可进一步提高红花的抗氧化性, 此外水
解后产生的苷元比相应的糖苷容易吸收, 生物利用
率更高, 更有利于发挥其药理作用。
　　通过 H PL C 法检测了 C2213 发酵红花对其有
效成分的炮制, 发现了一些特征吸收峰的消失和一
些新的吸收峰的出现, 这可能与发酵后红花降血清
总胆固醇和抗羟自由基氧化能力提高这一现象有
关。为了从机制上解释这一现象, 还需要利用核磁共
振、液质联用等进行深入的研究。
References:
[ 1 ]　W eng X H , L i Q , Cao Q L. N ew field fo r study of TCM
th rough ferm en tation by m icrobe [J ]1 Ch in T rad it H erb
D rug s (中草药) , 2001, 32 (3) : 26722681
[ 2 ]　J ing M , L i J R , Cai Y X, et a l. A n tiox idative effect of aque2
ous componen ts of flow er Cartham us tinctorius L. [J ]1 J Car2
d iovasc P u lm D is (心肺血管病杂志) , 1998, 17 (4) : 27722791
[ 3 ]　J in M , Cai Y X, L i J R. 1, 102Phenan th ro line2Fe2+ ox idative
assay of hydroxyl radical p roduced by H 2O 2öFe2+ [J ]1 P rog
B iochem B iop hy s (生物化学与生物物理学进展) , 1996, 23
(5) : 55325551
[ 4 ]　H uang X Q , J iang H D , Xu Q , et a l. Studies on the effect of
Ch inese beau ty berry (Callica rp a ca thay ana) on an tilip id per2
ox idation [J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 1998, 29
(4) : 24622491
血竭的超临界CO 2 流体萃取工艺研究
俞　蔚, 雍克岚Ξ
(上海大学生命科学学院, 上海　200436)
摘　要: 目的　研究超临界CO 2 流体萃取 (SFE2CO 2)血竭中抑制 Α2葡萄糖苷酶有效成分的工艺条件。方法　采用
单因素法, 探讨了压力、温度、时间和CO 2 流量对血竭萃余率和抑制 Α2葡萄糖苷酶活力提高率的影响。结果　最佳
工艺条件为萃取压力 15M Pa, 温度 45 ℃, CO 2 流量为 30 kgöh, 时间 2 h。优于传统的索氏抽提。结论　SFE2CO 2 工
艺用于血竭中有效成分提取, 萃余率和抑制 Α2葡萄糖苷酶活力提高率均有较大程度提高。
关键词: 血竭; Α2葡萄糖苷酶; 超临界 CO 2 萃取
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 06 0633 03
Technology of supercr it ica l CO 2 extraction process of D ragon’s Blood
YU W ei, YON G Ke2lan
(Schoo l of L ife Science, ShanghaiU niversity, Shanghai 200436, Ch ina)
Abstract: Object　To study the techno logy of supercrit ica l CO 2 ex tract ion of effect ive componen ts
from D ragon’s B lood w h ich has the inh ib it ing funct ion on Α2gluco sidase. M ethods　T he influence of the
ex tract ion p ressu re, tempera tu re, t im e and flu id velocity on su rp lu s ex tract ion ra te and the imp rovem en t
of inh ib it ion w as m ain ly discu ssed. Results　T he op t im al experim en ta l param eters w ere 15M Pa ex tract ion
p ressu re, 45 ℃ ex tract ion temperatu re, 30 kgöh flu id velocity and 2 h ex tract ion t im e. Conclusion 　T he
resu lts show that SFE2CO 2 can eno rmou sly increase the su rp lu s ex tract ion ra te and the inh ib ito ry act ivit ies
on Α2gluco sidase.
Key words: D ragon’s B lood; Α2gluco sidase; SFE2CO 2
　　血竭 (D ragon’s B lood) 被誉为“活血之圣药”,
主要来源于百合科龙血树属藤本植物龙血树D ra2
caena d raco L. 的树脂及同属植物果实中溶出或分
泌的红色树脂。性甘、温、咸、平, 具活血化瘀、消肿止
痛、止血补血之功效。现代医学研究表明, 血竭具有
改善机体微循环, 调整新陈代谢, 改善免疫功能等作
·336·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
Ξ 收稿日期: 2003207211
基金项目: 上海市科技发展基金资助项目 (02D Z9118)
作者简介: 俞　蔚 (1978—) , 女, 上海人, 硕士, 主要从事天然活性物质的分离与分析。T el: (021) 66134078　Fax: (021) 66132177
E2m ail: joy518@ sina. com3 通讯作者