全 文 ：la t h el lu ng ia a nW
o l f f
.
O n t h eba si so f sp e亡 ta r la na ly si sU ( V, I R , M S , ’ H N M R , `H 一` H C O S Y , ` 3 C N M R , ’ H -
, 3
C CO S Y
,
D E P T )
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e r e id e n t if i
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r e o 一 5 一 n 一 p e n t y l
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4
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u r a n 一 2 一o n e ( I ) a n d
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r e o 一 5一 n 一 p e n t y l
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4
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r o x y t e t r a h y d r o f u r a n
一
2
一 o n e ( l )
.
K e y w o r d s P i刀 ZP i n d l l a t h e l u n g ia n a W
o l f f
.
e r y t h r e o
一
5
一 n 一 p e n t y l
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4
一
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r o x y t e t r a h y d
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u r a n 一 2 一。 n e
甜菊糖普的结构修饰研究
.
a 一葡萄糖基一甜菊糖普的酶促合成研究
南 开大学微生物 学系 (天津 3 0 0 0 7 1)
南 开大学甜菊糖厂
体树敏 ’
蒋谷人 刘 东
摘 要 以玉米淀粉 为材 料 ,利 用酶促修饰方法有效地将淀粉水解下来 的葡萄 糖基接枝到 甜菊糖
昔分子上 , 获得高甜度 、无 异味 的 a 一葡萄糖基 一甜 菊糖昔 。 甜度达到蔗 糖的 150 倍 。 与 日本 同类产品
比较 , a 一葡萄糖基 一甜 菊糖昔的转 化率是其 1 . 8 倍 。 该项研究对于甜 菊糖昔 的深人研究具有理论和
应用价值 。
关键词 甜 菊糖昔 酶促修饰 a 一葡萄糖基一甜 菊糖昔 a 一糊精转 移酶
甜味剂是人类生活所必需的 。 以往习惯
食用的蔗糖 、 葡萄糖 、 果糖 、 麦芽糖等甜味剂 ,
人体吸收后能产生大量的热能 ,使热量过剩 ,
从而导致肥胖病 、 高血压 、 冠心病 、 脑血栓 、 糖
尿病等病症 。 因此 ,世界各国人 民越来越倾向
于使用高甜度 、低热值的天然甜味剂 。
甜 菊糖 昔是 从 菊科 植 物甜 叶菊 tS ve ia
er b
a u d ia n a B er ot ln 叶 中提 取 出来 的高甜度
混 合物 , 其 甜度 一般 为蔗糖 的 2 0 0 倍 , 溶解
性 、 热稳定性 、 化学稳定性 、 非褐变性均佳 ,且
高甜度 、 低热值 、 安 全无毒 , 可在食 品 、 饮料 、
医 药 、 化妆 品等行业 中与其 他甜味剂 、 有机
酸 、 有机碱等混合使用 。 但美 中不足的是当其
单 独使用时 ,有苦 味 、 涩味 , 因 而在使用 中受
到了影响 。 现 已发现 。 当甜菊糖昔配基以 鼠
李糖基作为配糖体时 , 其甜菊糖昔 即具有特
殊的苦 味 、 涩味 , 如何改 良甜菊糖 昔的品质 ,
是 众多学者 的研究热点 ,改造甜菊糖昔 的分
子通 常有化学修饰法和酶促修饰法两类 , 酶
促修饰法不 引入任何化学试剂 ,省去 了繁杂
的纯化精制过程 ,食用安全可靠 , 我们采用酶
促修饰法 , 合成新 的 a 一葡萄糖基 一甜菊糖昔 ,
是 去除了 异味的高甜度 、 低 热值 的天然甜味
剂 。
1 仪器与材料
1
.
1 仪器 : 7 21 光电 比色计 : 上海分析仪器
厂 ; T H Z 8 一 I 型多用途台式恒温震 荡器 ; 低
温高速离 心机 : 日立 ; 高压 液相色谱仪 : 美国
W
a t e r s 5 1 0
。
1
.
2 材料 : p一环 糊精葡萄糖基转移酶 甲一 c y -
e l o d e x t r i n g l y e o s y l t r a n s f e r a s e ) 自制产品 ; a -
淀 粉酶 ( a 一 a m y las e) : 酶 制剂 厂产 品 ; p一淀粉
酶 ( p一 a m y la s e ) : 酶制剂厂产品 ; 玉米淀粉 : 红
旗淀粉厂产品 ; 甜菊糖昔 : 南开大学甜菊糖厂
产 品 ; S 一 8 吸 附树 脂 : 南开 大学 高分 子所 产
口口口 。
2 方法
2
.
1 俘一环糊精萄萄糖基转移酶 ( CG T as e) 活
性测定
2
.
1
.
1 原理 : C G T as e 是一种多 功能酶 , 同
A d d r e s s
:
T o n g S h u m in
,
D e p a r t m e n t o f M i e r o b i o l o g y
,
N a n k a i U n i v e r s i t y
,
T i a n j i n
。
5 8 2
·
时具有水解淀粉为糊精 、 使小分子糊精环化 、
使葡萄糖基转移的能力 。 根据它所催化产生
的 p一环糊精因失去 了还原性末端而不能被 各
a m y la s e水解 为葡萄 糖 , 因而 当与 同等重 量
的淀粉对照组对 比 时 , 经 C G T as e 催化 生成
部分 各环糊精 ( p一 C D ) 后的溶液用 各a m y l a s e
水解 , 所生成的葡萄糖一定 比对照组减少 , 此
减少 的量 即为生成 件C D 的量 , 每 毫升酶 液
在 4 0 ℃时与淀粉溶液保温 Z h , 所生成 的 p-
C D 的 m g 数即为该酶的活性单位 ,通 常比它
的环化酶活性小 10 倍 , 但此方法更直接地显
示 了它的环化能力 。
2
.
1
.
2 试剂配制 :
a) o
.
2 %马铃薯淀粉溶液 (现配现用 ) ; b )
p
一 a m y l a s e 稀释至 2 万单位 /m I J ; e ) 0 . 0 2 m o l /
L p H 6
.
5 磷酸缓冲液 ; d ) o . o Z m o l / I J p H 6 . 5
磷酸缓冲液 ; e ) 3 , 5一二硝基水杨酸溶液配制 :
甲液 : 称取 6 . 9 9 结晶酚 , 溶于 1 5 . 2 m L
10 %的 N a O H 溶 液 中 , 并 用水稀 至 69 m L ,
再加人 6 . 9 9 亚硫酸氢钠 。
乙 液 : 称 取 2 25 9 酒石 酸钾钠 溶于 3 0
m L 1 0% 的 N a O H 溶液 中 , 再加 人 8 8 0 m L
1% 3
.
5
一二硝基水杨酸溶液 。
将 甲 、 乙二液混合 ,在 室温下放至 7 d ~
I O d 后使用 。
2
.
1
.
3 C G T a s e 酶活测定方法 : 根据 3 , 5一二
硝基水杨酸法绘制葡萄糖标准 曲线 , 取 5 支
大试管分别加入 1 0 0 拜g /m L 标准葡萄糖液
及蒸馏水 ,得到从 1 0 拜g /m L 至 80 0 拌g /m L
标准管 。 分别吸取上述不同浓度的葡萄糖溶
液 0 . 5 m l _ (空 白用 0 . 5 m L 水 ) , 3 , 5一二硝基
水杨酸试剂 0 . 5 m L , 混合均匀 , 在沸水浴上
加热 s m in , 取出后用水冷却 , 加人 s m l团 蒸
馏水 , 摇匀 , 用 7 21 分光光 度计于 5 4 0 n m 处
比色测定 , 以吸光度 O D 值为纵坐标 , 以葡萄
糖毫克数为横坐标 ,作 出标准曲线 ( 比色杯厚
度 1 e m ) 。
a) 配制 O , 1% 的马铃薯淀粉溶液 ; b ) C G -
T a s e 活性稀释 2 0 0 倍 ; c) 接表 1 顺序加样操
作 。
《中草 药 》 1 9 9 8 年第 29 卷第 9 期
表 1 C G T as e 酶活性测定操作 程序
试 剂 调 0用 对照 测定 1 测定2
0
.
1%马铃薯淀粉 水。 . 5 m L 水0 . 5 m L 水 。. 5 m L 水0 . 5 m L
稀释 200倍 CGT a s e 水 0 . 1 m L 水0 . 1 m L 水 0 . 1 m L 水0 . 1 m L
pH 6
.
5磷酸缓冲液 。. 5 m L 0 . 5 m L 0 . 5 m L 0 . 5 m L
40 ℃保温 2 h 100℃煮佛 10 m in 冷却至室温
pH 7
.
5磷酸缓冲液 1 m L 1 m L 1 m l 1 m L
件a m y la s e (200 倍) 1 m L 1 m L 1 m L 1 m L
50 ℃ ,反应 30 m ln 后
3 , 5
一二硝基水杨酸试剂 0 . 5 m L 0 . 5 m L 0 . 5 m L 0 . 5 m L
沸水浴 中加 热 s m in , 取出后用水冷却 ,
加入 2 . 4 m L 水 摇匀 , 用 7 21 分光光 度计于
5 4 0 n m 比色测定 ,测得 O D 值在葡萄糖标准
曲线 中查到葡萄糖的毫克数 ,乘稀释倍数 , 再
乘 5 即得 C G T as e 的活性单位 。
2
.
2 C G T as e 对 淀粉水解下来 的葡萄糖 基
向甜菊糖分子接枝实验 〔` 〕
a) 称取玉米 淀粉 30 9 用 30 m L 冷水调
匀 , 缓慢倒人 80 m L 沸水中成糊状物 。
b ) 加 人 0 . 0 0 5 m -l a 一 a m y l a s e ( 1 s o o U /
m L )
, 在 7 0 ` C 水浴中液化 3 0 m l n 。
c )糊状物中加人溶解好 的 2 9 甜菊糖同
时加人活性为 32 0 U /m L 以上的 C G T as e 4
m L
, 于 50 〔C 恒温摇 床上反应 4 8 h , 速 度为
1 8 0 次 /m i n 。
d )反应后于沸水浴 中 10 m in , 灭活 。 用
高速 冷冻 离心 机 , 4 ℃ , 1 0 OO0 r /m i n , 离 心
10 m in
,弃上清液 。 沉淀分别用 87 % 、 95 % 乙
醇各洗一遍 ,合并两次洗 出液 , 离心弃沉淀 。
e) 离心 得到 的上清液 上 S 一 8 吸附树 脂
柱 , 水洗 , 再 用 70 % 乙 醇洗 , 洗 脱 液蒸 去乙
醇 , 真空浓缩 即得 a 一葡萄糖基 一甜菊糖 昔 , 简
称转化糖即 。
f )洗沉淀的乙醇溶液 ,加热除乙醇 ,加水
稀释 , 上 S 一 8 吸附树脂柱 ,洗 出液真空浓缩 ,
获得高纯度的转化糖 。
2
.
3 高压液相色谱仪对转化糖的测定
a ) 称取转化糖 60 m g 溶于 Z m L 水中作
为测定样品 ; b )称取甜菊糖 4 0 m g 溶于 2 m L
水中作为对照样品 ; C )称取 日本山 阳国策产转
化糖 60 m g 溶于 2 m L 水中作为参照样品 。
3 结果
3
.
1 各C G T as e 的环化酶活性测定 : 酶液稀
·
5 8 3
·
释 2 0 0倍 ,
据见表 2 。
表 2
比色前反应液再稀释 5 倍 ,实验数
p
一
C G T as
e 环化酶活性测定数据
匕刁二JC亡八曰乃J4Qé八」O乙八JdQ夕ú」0 2 7
0
.
1 3 5
0
.
1 3 7
0
.
2 3 0
0
.
1 5 5
0
.
2 3 5
0
.
3 4 5
0
.
3 4 0
0
.
2 9 5
0
.
3 3 0
3
.
2 C G T as e 对甜菊糖昔的转化
玉米淀粉旦旦工些竺糊 精+ 葡寡聚糖 + 葡萄糖
甜菊糖昔 + 葡萄糖 + 葡寡聚糖旦旦工些竺
a 一葡寡聚糖 一甜菊糖昔
剩余 的玉米淀粉 、 糊精 、 葡寡 聚糖 、 灭活
的酶蛋白等由高速冷冻离心机除去 , 如有色素
和小分子物质 , 可通过上 S 一 8 吸附树脂柱除
去 , 转化糖昔用 7 0% 乙醇洗脱 、 浓缩 、 干燥后
称重 , 并 配成 2 0 m g /m L ~ 3 0 m g / m L 的溶
液 ,进行高压液相色谱仪测定 , 其结果见表 3 。
表 3 H P L C 各成分含 , 的百分 比 (根据各峰面积 )
` 。 司卜 ` 双糖 ~ , 。 . 。 。 。 , ` 、 , _ ~样 品 非糖 s蕊恐bi D u lc S` e v i R e b a u C R e ba u A 转化糖
35
.
5
34
.
5
24
.
5
g7n,212乐.344 .5
9
.
9 5
.
8
7 1
.
9
1 7
.
2 5
.
4
595.4 1120乐1汉.51.4乐即6八05互」
:
,.1.
Q乙J认月自浦卜Un凸乙八j甜菊糖普
样品 1
样品 2
日本样品
转化糖昔和 R e b a u d i o s id e A 无苦涩 味 ,
比较甜美柔润 。 由上表可见 :
对照样品甜菊糖昔中转化糖贰 + A : S -
( O + 1 2
.
7 )
: 4 4 = 0
.
2 9 : 1 ;
样 品 l 中转化糖昔 + A : S 一 (3 5 . 5 + 5 . 9) ,
9
.
9 = 4
.
1 8 : 1 ;
样 品 2 中转化糖昔 + A : S一 ( 3 4 . 5 + 3 . 9) ,
7 = 5
.
4 9 : 1 ;
日本样品转化糖昔 + A : S 一 ( 24 . 5 + 5 . 2) ,
1 7
.
2 = 1
.
7 3 : 1
。
从上列数据表明 , 经转化后好糖 的含量
分别是 日本样品的 2 . 4 倍 、 3 . 2 倍 , 根据液相
色谱 图谱可见各 吸收峰值的位置与我们转化
糖的位置一致 , 图形相似 , 各成分基本相同 。
4 讨论
4
.
1 反应底物是粗提甜菊糖昔 , 是多种成分
的混合物 ,无需精制 ;所使用的玉米淀粉 ,价廉
易购 。 反应经 C G T sa e 催化 , 在常压 50 ℃下
一次反应完成 。 与化学转化相 比 ,不加人任何
化学试剂 , 在分离精制时 , 无需繁杂的过程和
设备 , 操作 比较简便 。 转化产品是安全无毒的
天然食品 , 进一步放大实验后 , 本转化法可望
用于工业生产 。 C G T as e 国内已有生产 ,易购 。
4
.
2 甜菊糖昔经 C G T as e 催 化生产 a 一葡萄
糖 基 一甜 菊 糖 昔 , 原 甜 菊 糖 A 昔 : S 昔 -
0
.
2 8 : 1
。 在转化糖中 , ( A 昔+ 转化糖昔 ) :
S 昔一 4 . 1 8一 5 . 4 9 : 1 。 即在转化糖 中 ,甜美
柔润 的好糖 比转化前增加了 n 倍 ~ 14 倍 。
4
,
3 将本实验产 品与 日本 山 阳国策精糖株
式会 社生产的 a 一葡 萄糖基 一甜 菊糖昔进行 比
较 , 二者液相色谱图各峰图形相似 。 但在 日本
的转 化糖 昔 中 ( A 昔 + 转化 糖 ) : S 昔 -
1
.
7 3 : 1
。 本实验 的转化糖 中 , ( A 昔 + 转化
糖 ) : S 昔 = 4 . 1 8一 5 . 4 9 : 1 , 分别 比 日本产
品高 2 . 4 倍一 3 . 2 倍 。
4
.
4 转化糖经 a 一 a m y l a s e (即 a 一葡萄糖 淀粉
酶 ) 水解得 a 一葡 萄糖基和甜 菊糖 昔 , 该酶 只
专一水解 a 一葡萄糖 昔键 , 由此证明转化糖昔
即为 a 一葡萄糖基 一甜菊糖昔 。
参 考 文 献
1 朱 俭 , 等 . 生 物 化学 实 验 . 上 海 : 上 海科 技 出版 社 ,
1 9 8 1
:
1
2 J P 昭 5 7一 5 6 6 3 ( 1 9 8 2 )
3 J P 昭 5 7一 8 6 2 64 ( 1 9 8 2 )
4 淡 家林 , 等 . 微生物学报 , 1 9 8 4 ; 2 4 ( 1 ) : 8 0
( 1 9 9 8
一
0 3
一
2 3 收稿 )
S t r u e t u r a l M o d i f i c a t i o n o f S t e v i o s i d e
1
.
S t u d i e s o n t h e E n z y m i c s y n t h e s i s o f a
一
G l u e o s y l
一
S t e v i o s i d e
T o n g S h
u m i n ( D e p a r t m e n t o f M i
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b i
o l o g y
,
N
a n k
a i U n i v e r s i t y
,
T i a n ji n 3 0 0 0 7 1 )
J ia n g G u r e n a n d L i u D o n g ( S t e v i o s id e P la n t
,
N
a n k
a i U n iv e r s i t y
,
T i
a n 一i n 3 0 0 0 7 1 )
A b s t r a e t T h e v e r y s w e e t a
一
g lu e o s y l
一 s t e v io s i d e w it h o u t p e e u li a r s m e l l e a n b e s y n t h e s iz e d b y e n z y m e
.
5 8 4
.
p r o m ot e dm o di fie at i on o fst v e i o s i de
,
w h
e n t h
e g l u e o s y l g r o u p h y d r o l y z e d f r o m e o r n s t a r e h e a n b e i n e o r p o r a t e d
i n t
o th e s t e v i o s i d e m o l e e u le
.
T h e s w e e t n e s s o f t h e a
一
g l u e o s y l
一 s t e v i o s i d e f o r m e d 15 a b o u t 1 5 0 t im e s t h a t o f s u
-
e r o s e
.
T h
e r a t e o f t r a n s f o r m a t i o n 15 1
.
8 t im e s a s e o m P a r e d w it h s im il a r P r o d u c t r e P o r t e d e ls e w h e r e a b r o a d
.
T h
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r o v i d
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d
a b a s i s f o r t h e f u r th e r s t u d y o f s t e v io s i d e b o t h i n t h e o r y a n d p r a e t ie e
.
K e y w o
r d s s t e v i o s id
e e n z y m i e m o d if i e a t io n a
一
g l u e o s y l s t e v io s i d e a
一
d
e x t r in t r a n s f e r a s e
紫芝与赤芝挥发性成分的研究△
J一州 中医药大学 中药 资源研究室 ( 5 1 0 4 0 7) 丁 平 徐鸿华 徐新春
灵 芝 为 多 孔 菌科真 菌 灵 芝 (赤 芝 ) G a n o d er m a
l u c i d u m ( W
.
C u r t
.
F r ) K a r s t
. 及紫 芝 G . 声p o n i c u m
( F r
.
) L fo y d 的干燥子 实体 〔门 , 是一种珍贵的 中药材 ,
临床 主要治疗肝病 、 胃溃疡 、 高血压 、 神经衰弱等 。 在
过去 的 20 年里 , 灵芝的研究 在药理作 用 、 化学成分 、
临床应 用等方 面取得 了很大进 展 , 其中所含化学成
分较为复杂 , 目前较 明确地认为灵芝多糖是灵芝 扶
正 固本 的主要成分之一 〔 2〕 。 此外 , 尚含有 1 50 多种三
菇类化合物 〔 3“ , 生 物碱类 、 多种 酶类 、 多肤 、 当类 、 树
脂 、 氨基酸等 〔 4 · 5 , “ 〕 、 非极性部分 〔 7〕 。 另外 , 还有一些文
献 〔 5 , “ 〕报道灵芝含有挥 发油 , 尚未见具体报道灵 芝所
含挥发油 的内容 。 为此 , 我们在进行根木栽培灵 芝及
其 产 品开发 过程中 , 对 此 内容进行 了研究 , 并对 不 同
产地根 木栽培 的赤芝 进 行 了对 比 , 现将研究结果 报
道 如下 。
1 样品
紫芝 G a n o d e r m a jaP o n i e u m ( F r . ) L l o y d l 个样
品 , 为 市 售 ; 赤芝 G . l u e i d u m (W . C u r t . F r ) K a r s t . 3
个 样 品 , 分别 为 广 州 (广 州 中 医药大学实验地 ) 、 浙
江 、 广东 揭阳 以根木栽培 的灵芝 子实体 ,共计 4 个样
品 , 以上 样品经徐鸿华教授鉴定 。
药材粗粉经水蒸气 蒸馏 、 乙 醚提取 、 无水硫 酸钠
脱水后得到 挥发性成分 , 为 白色 至浅黄色 固体物 。
2 G C
一
M S 实验条件
仪 器 : I n e o e 一 5 0 G C 一M S 一 D S (美 国 F i n i g a n 公
司 ) , D B一 5 石英 毛细管柱 (3 O m X O . s m m ) 50 ℃ 恒温
2 m in 后 , 以 5 ℃ / m in 速率程 序升温至 2 20 ℃ , 再恒
温 2 0 m in , 载气 : H e , 柱前压 9 8 k P a , 线速 度 3 0 e m /
m in
, 分流 比 4 0 : 1 。 电离方 式 E l , 电子能 量 7 0 e V ,
离 子源 温度 1 70 ℃ , 加 速 电压 4 0 kV , 扫描速度 1 . 5
s
/ d
e c , 扫描范 围 3 0一 5 0 0 质量 单位 。
3 结果与讨论
3
.
1 4 个样 品 , 按 样品来 源不 同得到 4 类 不 同气 相
色谱图 , 共得到 45 个峰 , 鉴 定了 31 个成分 。 用归一
化法计算出有关组 分的含量 , 结果见表 1 。
表 1 紫芝及不 同产地赤芝挥发性
成分含 t 测定结果 ( % )
故 口 , , 人 ` 、 , 此 , 赤芝 赤芝 赤芝峰号 化合物名称 紫芝 , r岁几六 , 之泥J众余 , 君涂呼 7 比 口 钊们 竹 、 尔 心 ( J一州 ) (浙江 ) (揭阳 )
a 一庚烯醛`Z )
辛醛
已酸
a 一辛烯醛 ( E )
庚酸
壬醛
2一壬烯醛
辛酸
2一癸酮
癸醛
2一癸烯醛 ( E )
壬酸
2
一十一烯酮
2
一十一烯醛
癸酸
8一轻基辛酸
2
,
6
一 二叔丁基对甲酚
十一碳酸
十二碳酸
反异榄香素
柏木烯醇
壬二 酸
Z
一 3一革本内醋
十四碳酸异构体
十四碳酸
菲
十五 碳酸异构体
十五 碳酸
十五 碳酸乙醋
十八碳醛
十六酸异构体
9一十六碳烯酸
十六碳酸
十六酸乙醋
十七碳酸
十八碳烯酸
9 , 12
一十八碳二 烯酸 ( 2 , 2)
9一十八 碳烯酸
十八碳酸
0
.
0 8
0
.
3 2
1
.
5 3
0
.
1 4
0
.
2 5
0
.
6 0
0 0 5
0
.
7 7
0
.
0 9
0
.
1 5
0
.
2 8
1
.
2 4
0 2 3
0
.
24
0
.
38
0
.
4 7
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0
.
6 4
1
.
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2 9
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.
13
2
.
4 4
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《 中草药 》 1 9 9 8 年第 2 9 卷第 9 期 5 8 5