全 文 ：2 8 8
,
2 7 5 ( 1 0 0写 ) , 2 5 7 , 2 3 1 。
晶 l : 无色针 晶 ( M e O H ) , m p 2 1 4 C ~
2 1 6 C
, 〔a 工 一 3 9 . I C ( ` , 0 . 4 7 , M e O H ) 。 分子
式为 C Z o H 3; 0 3 ( H R E I一M S m / z : 3 2 2 . 2 5 1 4 , 计
算值 : 3 2 2 . 2 5 1 2 ) 。 I R礁乳e m 一 ’ : 3 4 0 0 ( O H ) 。
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晶 VI : 无 色针 晶 ( E t O A e ) , m p 1 6 3 C -
1 6 4 C
, 〔a 工 一 1 1 2 . 5 0 ( 。 , 0 . 4 9 , C H C 13 ) 。 分子
式 为 C 2 2 H 3。O ; ( H R E IM S m / z : 3 6 4 . 2 6 1 3 , 计
算 值 : 3 6 4 . 2 6 1 3 , 计算 值 : 3 6 4 . 2 6 1 2 ) , I R v黑
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[ 3 3 3
一
C H
3
C O O H 〕十 。
参 考 文 献
1 吴继洲 ,等 . 药学学报 1 9 8 9 , 2 4 ( 8 ) : 6 0 0
2 吴继洲 , 等 . 同济 医科大学学报 1 9 91 , 2 0( 2 ) : 8 93
3 吴继洲 , 等 . 高等学校化学学报 1 9 9 2 , 1 3 ( 5 ) : 6 58
4 W u j i z h o u
, 尸t a l
.
C h e m P h a r m B u l l
, 1 9 9 5
, 4 3 ( 9 )
: 1 4 4 8
5 阮汉利 . 等 . 中草 药 19 9 9 , 3 0 ( 6 ) : 4 0 4
( 1 9 9 8
一
1 2
一
2 7 收稿 )
天花粉蛋 白质与苦瓜子蛋 白质改变 D N A 构型的活性△
L D N A 解旋与链结
中国医学 科学院基 础医学研究所
中国协 和 医科大学
香港 中文大学中药研究 中心
医学 生物学国家重点实验室 (北京 1 0 0 0 0 5) 琦祖和 ’
杨显荣
蒋效松 ’
{李慧云 {
摘 要 为研究 中药有效成分 天 花粉蛋 白质 ( T C S )与苦 瓜子 蛋 白质 ( M M C ) 的生物 学活性 , 以
细胞遗传物质 D N A 为底物 , 经分 子生物学技术分析 , 发现超盘旋双链 D N A 发生解旋和链结 ,单链
D N A 发生断链 , 在合适 条件下 , 已 解旋 和断链的分子还 可重新盘绕 , 再成超盘旋 , 极微量 的蛋 白质
即表现出很强的作 用 。 这一活性与 1 型 D N A 拓扑 异构酶相同 。
关健词 天花粉蛋 白质 苦瓜子蛋 白质 D N A 解旋 链 结
T h e A c t i o n o f T r i e h o s a n t h i n a n d M o m m o r c h a r i n o n D N A C o n f i g u r a t i o n
1
.
D e s P i r a l i z a t i o n a n d C a t e n a t i o n o f D N A
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J ia n g X i a o s o n g
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,
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,
C A M S 乙 P U M C , eB iji n g 2 0 0 0 0 5 )
A bs t r a e t T
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( T C S )
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K u g u a z i r e s p e e t iv e l y o f C h in e s e t r a d it io n a l m e d ie i n a l m a t e r ia ls
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t e n t ia l o f C h i n e s e m e d ie i n a l m a t e r ia ls t o b l o e k H IV in f e e t io n b o t h i n H IV e a r r ie r s a n d A ID S P a t ie n t s
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o s o m e i n a e t iv a t i n g P r o t e in s ( R I P ) a n d
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s i e M e d i e a l cS i
e n e e s , C A M S & P U M C
,
N a t i o n a l
L a b o r a t o r y o f M e d ie a l M o l e e u l a r B i o l o g y
,
Be iji
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琦 祖和 , 女 , 1 9 5 7 年毕业于北京医学院药学系 . 在 中国 医学科 学院基础医学研究 所生物化学与分子生物学室 , 医学分 子
生物学 国家重点实验室工作 , 研究员 。 近年来 以基 因表达调控异常 与疾病的发生 为线索 , 探讨载脂蛋 白 E 异常与心脑 血管病
的关 系 , 建立 了人突变载脂蛋 白 aP o E 7 与 aP o E 4 转基因小鼠模型 , 证明 叩 。 E 基因突变使整体发生多系统方面的病理变化 。
二 首钢总 医 院△国家 自然科学基金资助项 目 附 3 9 4 7 0 2 1 8
《中草 药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 1 1 期 . 8 0 7 .
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e a t e n a t e d b y T C S a n d M M C
.
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.
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n g t r e a t m e n t o f D N A w i th T C S o r M M C i
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.
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e t im e s a ll t h e D N A m o le e u le s b e e a m e d e s p i r a li z e d a n d e a t e n a t e d e v e n w i t h o n l y Z
~ 5 n g o f T C S o r M M C
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w a s b e n e f ie i a l t o t h e r e e o n s t r u e t io n o f s u p e r e o il e d e o n f ig u r a t io n o f t h e d e s p i r a li z e d D N A
. 浅 s e d o n t h e a e t i o n
o f a lt e r a t io n o f D N A e o n f ig u r a t io n i t w a s e o n s id e r e d th a t t h e s e a e t iv it i e s a r e s im il a r t o t y p e 1 D N A t o p o i s o
-
1l l e r a s e
.
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o s a n t h i
n m o m m o r e h a r i n d e s p i r a l i z a t io n e a t e n a t i o n t o p o is o m e r a s e l
天 花粉蛋 白质 ( T C S )与苦 瓜子蛋 白质
( M M C )分别是 中药天花粉与苦瓜子 的有效
成分 。 天 花粉是括楼的块根 ,属葫芦科 , 括楼
属 T r i c h o s a n t h e : k i r i l o w i ; M a x a m 。 早在秦汉
时代医书就记载有通月水等功用 ,七十年代 ,
发现 单 味 天 花 粉 即 可 发 挥 良好 的 引 产作
用 〔 , 〕 。 天 花粉中含有多种蛋白质 ,用丙酮分级
沉淀 法 得 到 的 精 制 蛋 白 质 ( t r ie h o s a n t h i n
T C S )是引产的有效成分 , 已制成结晶 , 其分
子量 2 5 . 68 2 K D , 由 2 3 4 个氨基 酸残基组成
单一肤链 ,蛋 白质一级结构 已经测定 ,高级结
构也基本排出 〔 2〕 。 近年来又发现除催产外 ,
T C S 还有抗肿瘤与抗病毒的功能 , 曾用 H IV
急性或慢性感染体外培养的细胞 , 证明 T C S
可选择性抑制 H I V R N A 的复制 ` 3〕 。 因此试
用于 爱滋病 的治 疗 , 是有希 望的抗 H IV 药
物 。 苦瓜 材 dm m o dr i c a 。 h a ar n t i a I J . 与天花粉
统属葫芦科 , 用丙酮分级 沉淀法分离和柱层
析 纯 化 , 自其 种 子 中得 到 的 结 晶 蛋 白质
( m o m m o r e l
l a r i n M M C )是与 T e s 具有相同
性质的药用有效成分 , 也已试用于治疗爱滋
病 。 T C S , M M C 与蓖麻毒蛋白均属于核糖体
失 活蛋 白质类 ( R I P ) 〔` 〕 , 它们 的生物学 功能
是医学研究 中的重要课题 ,受到广泛关注 , 自
从发现蓖麻毒蛋 白具有糖昔酶活性后 〔 5〕 ,相
继证 明 T C S , M M C 也具有相 同性质 〔` ·的 , 还
有报道 T C S , M M C 有胰蛋 白酶 抑制剂的活
性 〔, , 8 〕 。 自 1 9 8 8 年我们发现 T C S , M M C 可使
D N A 解旋 后 , 对 这一新 的现象作 了继续 验
证 〔” · ` “ 〕 , 并对其作用机制作 了进一步探讨 。
.
8 0 8
.
1 材料与方法
T C S 自天花 粉用常规方法分离 , 纯 化 ,
M M C 自苦瓜 子 中提取 , 分 离纯 化 方 法 与
T C S 相 同 , 按 洗 脱 峰 的 微 小 差 异 , 分 为
a M M C
,
pM M C
。
M ;
3
m p
。 单 , 双链 D N A 按常
规方法分离 〔’ 3〕 。 电泳用琼脂糖凝胶 ( a g a r o s e )
为进 口 分装 , 化学 试剂均 为分析 纯 。 T C S ,
M M C 与 D N A 在反应条件下保温 ,产物用常
规 1 % a g ar o se 电泳分离 , 根据 D N A 条带的
变化判断结 果 , 电泳液 含 4 0 m m ol / L T ir s .
C I
,
2 0 m m o l / L C H
3
C O O N a
,
1 m m o l / L
E D T A N a
: p H S
.
3
, 当测试到最适反应条件
后 ,一律用最佳条件保温与电泳 。
2 结果与讨论
.2 1 T C S 与 M M C 使 D N A 解旋与链结的
作用
2
.
1
.
1 解旋 双链 D N A : 纯化 的质粒 D N A
按照分 子体积的大小 ,在琼脂糖凝胶 电泳图
见图 1 上可分离出三条带 , 即超盘旋 s( u p e r -
c io le d ) 带 , 分子结构 紧密 , 体积最小 , 泳动速
度最快 。 线性 il( en ar )分子带 , D N A 双链断裂
成线性 , 与缺 口 (n ic k e d ) 分子带 , 即链上不 同
部位有缺 口 ,但双链未完全断开 , 缺 口使大分
子高级结构松驰 , 因而体积最大 , 泳动速度最
慢 , 如图 一a 中 I , I , l 。 将 0 . 5一 l 拼9 D N A
与 T C S , a M M C , b M M C 在非最适条件下保
温 1 0 m i n 后 , 经 1 % a g a r o s e 电泳分 离 , 发
现 D N A 超盘旋区 带 1 明显减少并上移 , 如
图 l a l 一 W ,有时 I 带完全消失 , 说明分
子体积增大 ,这是结构松驰的结果 ,实验证明
这一改变 D N A 结构的作用与限制性 内切酶
与非特异性 降解的 D N a s el , 以 及外切酶的活
性明显不同 , 当单一 H i n C l l 切点的 M , 3m p s
、双链 D N A 被降解时 ,在反应过程中 ,也可见
到超盘旋 D N A 量逐渐减少 , 线性 D N A 分子
与缺 口分子增多 , 但随保温时间的延长 ,或酶
量增加 ,超盘旋与缺 口分子最终消失 , 电泳图
上 为一条线性带 , 而 T C S 与 M M C 作用后 ,
超盘旋带减少到一定程度后 , 即使再延长保
温时 间或 增大用 量 , 线 性带并 不增 加 , 说 明
T C S 与 M M C 对 D N A 的作 用 与 内切 酶不
同 , 不是切断双链 。
b 1 2 3 4 a 1 2 3 4
v川“VI.
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. . .
- - - 一
I 一超螺旋分子 一线性 分子 l 一缺 口 分 子
w 一解 旋 分 子 v 一链 结 分 子 1一对 照 2 -
D N A /
a M M C 3
一
D N A / b M M C 4
一
)I N A / T C S
圈 1 D N A 的降解与链结电泳圈
为 除外 其 非 特异 性 内切 酶 活性 , 又 将
D N A 用微量的 D N a s e l ( s p g ) 在非最适溶液
中短时间作用 , 也可见 D N A 分子解旋 , 但当
反应物 10 O C 煮沸 3 m in 立即放入冰水 中使
D N A 解 链 后 , 在 l % a g a r o s e 电 泳 图 上 ,
D N a s el 的反应管中 , D N A 分子变成小分子 ,
而成为弥散带 ,而 T C S 的反应管与对照相比
无明显变化 , 说明解旋非由断链所致 。
为除 外 外 切 酶 的 活性 , 又将 D N A 用
aB m H I
,
P s t l
,
H i n C l l 降解 , 造成 5 ` 末端突
出 , 3’ 末端突出与平齐末端的 D N A 片段 ,再
经 T C S 作用后 , 电泳图上 , D N A 片段的泳动
速度反而变慢 , 说明片段并未减短反而 长度
增大 , 这 是解 旋 作 用造 成 的 。 另外 也 曾将
D N A 先与 T C S 作用 , 再用内切酶降解 , 发现
D N A 分子更容易被切断 ,这也可用分子松驰
后更易于发生作用来解释 。
又为除外蛋白质非特异结合对 D N A 结
构的影响 , 以大 于 T C S 十倍量的 ( 牛血清 白
蛋白 ) B S A 与 D N A 反应 , 并未出现 D N A 分
《中草 药 》 19 9 9 年第 3 0 卷第 1 期
子的解旋 。 上述各 图从略`
2
.
1
,
2 链 结 作 用 : 当 T C S . M M C 与 D N A
的反应物经最适温度处理 s m in 后 , 电泳图
上除分离 出 D N A 松驰分子 的条带外 , 同时
在靠近加样 孔处可见到泳动度极慢 的 D N A
分子聚集的大分子又称链结 (。 a et an it o n) 。 见
图 1一 a v 。 已发生链结的分子中 , 在进行电泳
分离之前加人 S D S 至 1 % , 则可去除链结 ,
而恢复分子的超盘旋状 态 , 图 1一 b 说 明链结
属分子的暂时聚集 。实验表明 ,在非最适条件
时 以解旋为主 , 在最适条件时 , 链结明显 , 由
于 T C S 与 M M C 有 相同 的表现 , 且 bM M C
作用更强 , 选 T C S 为靶 , 与 D N A 反应 , 电泳
分离后 , 测定了反应的最适条件 。
2
.
2 解旋 D N A 的条件
2
.
2
.
1 p H 与缓 冲液 : 比较磷 酸缓 冲液 ( 1)
与 t ir s 一 C l 缓 冲液 (2 ) , 在不同 p H 与浓度 下
保温 , 可见在 ( 2) 溶液中 , D N A 分子解旋与链
结比 ( 1) 明显 , 在最适条件时几乎全部分子均
链结成大分子 , 见图 ZA 。
2
.
2
.
2 温度 : 在 2 2 C 至 7 O C间 , 取一定 间
隔反应 , 可见在低温 时解旋 明显 , 随温度增
高 , 链结逐渐增强 , 表现为 I 带逐渐减少 , v
带逐渐增多 ,在最适温度时 , D N A 可全部呈
链结状 , 超盘旋分子消失 ,全部解旋变大 , 见
图 ZB 。
le 一上蔽扁讥
-
. . . . . . .
- - -
曰 .
. . . . . . . 口 . . . . . . . . . .
逃 ` -
址 _ =
L
1一一日
. . 面面
一 二= 二一v
二 二 一 l . t
- — .
A
一最 适 p H B一最适 温度 C 一最适时间 D 一最适浓度
l 一对照 I ~ V 见图 1
圈 2 T C S , M M C 使 D N A 分子发 生解旋与链结
的最适条件
2
.
2
.
3 保温时间 : 保温 1 5 m i n 即出现明显
反应 , 随时间延长解旋过程的梯形带也出现 ,
见 图 ZC , 加人保护剂 ( p ) 的明显优于 无保护
剂的反应管 。
.
8 0 9
-
2
.
2
.
4 蛋 白质用量 : 在适宜条件 下 , 少至 2
~ s n g 即可发生解旋与链结作用 ,见图 ZD 。
2
.
3 T C S 与 MM C 使 已解旋 的 D N A 分子
重新 形成超盘 旋 : 为探讨 各 种离子 与 A T P
对这一解旋与链结作用的影 响 , 曾经选低浓
度的一价 , 二价及多价金属 以及 D T T (二硫
苏糖 醇 ) , E D T A , A T P 等 分别 加 到 反应 液
中 ,结果表明 , A T P 不影响反应 , 高价离子对
解 旋反应不利 , E D T A N a Z , 与 D T T ( l ~ 5
m m ol / L ) 为 D N A 反 应中常用试 剂 , 有利于
D N A 结 构 的 稳 定 , 当 微 量 D T T 与 E D -
T A N a
: 加到 反应 液后 , 一保存 时 间较 长的
D N A 样品 , 超盘旋 1 带 已消失并略有降解 ,
但经过 T C S , a M M C , bM M C 处理后 , 超盘旋
1 带重新 出现 , 自图 3 可见 , 超盘 旋重形 成
时 , 线性 D N A 带显著减少 ,说 明 T C S , M M C
还具有可使断开的分子重新连接的性质 。
T 3 人 T O
1 3 4 6 7 9 1 0 1 2 1 3 1 5
行检测 发现 , T C S , M M C 可切断 s s D N A 与
R N A
, 在 a g ar os e 电泳时 , 可见 R N A 量明显
减少 , s s D N A 成为弥散的带 , 见图 4 。 而在 8
%聚丙烯酞胺凝胶 电泳 ( P A G E ) 时 , 降解 的
片段呈靠近加样孔处的弥散条带 ,说明被降
解但未成碎片仍保留了一定长度 ( 图略 ) 。
上 述结 果说 明 , T C S , M M C 可作 用于
D N A
, 使 单链 D N A 发生断裂 , 超盘 旋双链
D N A 分子发生解旋和链结 , 在合适条件下 ,
已解旋的分子还可再重新连接并成超盘旋 ,
极小量的蛋白质 , 即可表现出很强的活性 。
这 一 改 变 D N A 构 型 的 活性 与 1 型
D N A 拓扑异构酶一致 , 为进一步说明分子构
型的变化 , 又进行了电镜观察 ,另文发表 。
致谢 : 在验证上述条件的过程 中 , 朱席琳
同志参加部分测定 。
““I.皿.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
二{曹{{誉〔{ ):…{{: )二
I , I , . 与图 l 同 O 一D N A a 一 a M M C
B
一
bM M C T
一
T C S I
, 4
,
7 , 10
,
1 3
一加 E l ) T A
图 3 T C S , M M C 使解旋的 D N A 重新 形
成螺旋
D NA TC S b M M C a M M C
1 2 3 4
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l 一 5 5 D N A Z
一
5 5 D N A / T C S 3
一 5 5 D N A /
bM M C 4
一 5 5 D N A /
a M M C
图 4 T C S , M M C 降解单链 D N A 电泳图
2
.
4 T C S 与 M M C 降解单链 s s D N A 的作
用 : 以 M 1 3m p : 单链 D N A 与 R N A 为底物进
参. 考 文 献
玉 亚辉 , 等 . 动物学报 , 19 7 6 , 2 : 1 37
中国科学 院有机 所等 . 天花粉蛋 白研究讨论会资料
( 7 )
, 1 9 8 1
G r a t h M S
, f t a l
.
P r o e N a t l A e a d
.
cS i U S A
,
1 9 8 9
,
8 6 : 2 8 4 4
张劲松 , 等 . 生物化与生物物理进展 , 1 9 94 , 21 : 2 3
E d o Y ` t a l . J B i o l C he m , 19 8 7 , 2 6 2 : 8 1 2 8
R e n J
, 。 r a l
.
S t r u e t u r e
, 19 9 4 , 2
: 7
钱岳伟 , 等 . 中国科学 , 19 8 9 , 9 : 9 3 4
谭 复隆 , 等 . 生物化学与生物物理学报 , 19 85 , 17 : 5 3 0
琦 祖和 , 等 . 中国医学科学院学报 , 19 8 8 , 10 : 3 67
Q 1 Z u h e
,
e t a l
.
P r o e oS
e E x p B io l M e d
,
19 8 9
,
1 9 1
:
4 30
Q i Z
u h e
, e t a l
.
C h in e s e P e P t id e yS m P
o s iu m
,
19 92
,
P D 0 5
琦祖和 等 . 中华流行病学 杂志 , 1 9 92 , 13 , 特刊 2 号 :
4 13
S a m b r o o k J
, e t a l
.
M o le e u la r C lo n in g
,
A L a bo
r a t o yt
M a n u a l
.
C o ld S P r i n g H a r b o r L a b
.
P r e s s
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