全 文 ：征信息成分的吸收峰 ,使得其 NIRS图非常相似 ,从
图 1可以看出 ,各样品特征信息隐藏于光谱中 ,不能
简单以峰位、峰形鉴别法进行分类 ,必须经过数学处
理 ,提取到特征信息进行分类鉴别。
图 2树状聚类图表明 ,一个产地的多棵同种药
材均先自聚一类 ,说明 NIRDRS中带有地域性特
征 ,然后再与距离相近的异种生药聚类。 3个不同产
地的羊蹄最先与巴天酸模归为一类。 其中巴天酸模
较南京羊蹄更为接近另两个产地的羊蹄 ,除说明了
生长环境对植物的 N IRS有一定的影响外 ,也从光
谱分析的方面说明了巴天酸模与羊蹄化学成分相
似、亲缘关系相近 ,民间把二者混用不无道理。 齿果
酸模、红丝酸模、酸模与羊蹄的相似程度依次递减并
自成一类 ,说明了不同种间的差异还是很明显的。但
4种羊蹄类生药具有更大的相似性 ;非线性映射图
上的分布情况与聚类结果一致。
通过聚类与判别分析可以看出 ,聚类分析能够
通过距离的大小 ,准确地把同一产地的样品自聚一
类 ,再与同种生药聚类 ,最后与不同种生药相聚 ;而
判别分析更直观 ,可直接从映射图中看出各不同种
生药经过数学处理后 ,反映在特征向量上的差异。两
种方法所得结果与植物分类学上的分类一致。
综上所述 ,我们采用 N IRDRS技术在酸模属植
物分类中的应用进行了尝试 ,通过非入侵方式获得
植物内在成分信息 ,应用聚类分析法和判别分析法
进行分类 ,结果准确可信。表明本方法适用于酸模属
植物的分类 ,能快速准确地鉴别羊蹄类生药。也显示
了将 NIRS技术应用于植物类中药鉴别分析及产地
判别的良好前景。
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基因测序技术在中药质量研究中的应用 (Ⅱ )
—— 山药基原的 DNA测序鉴别　　　　　
刘玉萍 1 ,何报作 2 ,曹　晖1
⒇
( 1. 中国中医研究院中药研究所 ,北京　 100700;　 2. 广西中医学院药学系 ,广西 南宁　 530001)
摘　要: 目的　分析正品山药 Dioscorea polystachya Turcz. 与地方习用品广山药 D . persimilis Prain et Burkill、土
山药 D . japaonica Th unb.和方山药 D . alata L. 的核基因组 18S rRN A基因序列 ,为山药基原鉴别及品质评价提
供分子依据。方法　采用 PCR直接测序技术测定山药及其地方习用品的 18S rRN A基因核苷酸序列并作序列同源
性分析。结果　山药、广山药和土山药的 18S rRN A序列长度均为 1 810 bp,而方山药为 1 807 bp。根据排序比较 ,
广山药与正品山药的 18S r RN A序列完全相同 ,而与土山药和方山药的序列同源性分别为 99. 89%和 97. 51%。结
论　 DN A测序技术可成为山药基原鉴定准确而有效的分子方法。
关键词: 山药 ; 18S rRNA基因 ; DN A测序 ;基原鉴别
中图分类号: R282. 71　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1026 05
Application of gene technology in quality control of Chinese materia medicaⅡ .
Identification of Chinese Rhizoma D ioscoreae by DNA sequencing
L IU Yu-ping1 , HE Bao-zuo2 , CAO Hui1
　　 ( 1. Institute o f Chinese Mate ria Medica, Chinese Academy of TCM , Beijing 100700, China; 2. Depar tment o f Pharma-
cy, Guangxi Co llege o f TCM , Nanning Guangx i 530001, China )
Abstract: Object　 To distinguish the genuine Dioscorea polystachya Turcz. f rom o ther species of
Dioscorea L. such as D. persimil is Prain et Burkill, D. japonica Thunb. , and D. alata L. , conventionally
·1026· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2001-04-09作者简介:刘玉萍 ( 1963-) ,女 ,山西长治人 ,副研究员 ,药学博士。1983年毕业于北京中医药大学中药系 , 1987～ 1995年先后在日本国立富山医科药科大学获得药学硕士、药学博士及博士后 , 1995年回国在中国中医研究院中药研究所生药室工作 ,从事中药质量分析研究及分子鉴定研究开发。 Tel: 010-64014411转 2952　　 Fax: 010-64013996
used in some locali ties by sequencing their nuclear ribosomal RN A subunit ( 18S rRN A) , to provide mo le-
cula r evidences fo r the quali ty control o f drug s o f Dioscorea L. . Methods　 By direct PCR sequencing to de-
tect the homology o f 18S rRN A sequence of dif ferent species of Dioscorea L. . Results　 The 18S rRN A
gene sequence of g enuine D. polystachya , D. persimil is and D. japonica showed identical leng th of 1810
bp, wherea s that of D. alata was 1807 bp. Multiple sequence alignment o f 18S rRN A gene showed that
the homology w as identical betw een D. persim ilis and the genuine D. polystachya; but a dif ference of
99. 89% with D . japonica and 97. 51% with D . alata. Conclusion　 DNA sequencing can provide an accu-
ra te and reliable mean for the identification of the o rigin and genuineness of Dioscorea L. .
Key words: Rhizoma Dioscoreae; 18S rRN A gene; DN A sequencing; o rigin identi fica tion
　　随着 DNA分析技术的发展 , PCR测序方法已
经应用到了中药品种鉴别领域 [1 ]。早期 rRN A序列
分析用于中药材鉴定的工作主要在小分子方面 ,如
植物核基因组 5S rRN A,基因间隔区 ( ISR) ,一般长
度在 300～ 600碱基 [2～ 5 ] ,动物线粒体基因组 12S
rRN A,基因长度为 300～ 400碱基 [6～ 9]。但是核苷酸
测序技术的不断完善 ,尤其 PCR产物直接测序技术
和全自动测序仪的开发成功 ,对大分子 rRN A包括
小亚基 (如 16S～ 18S,约 1 700～ 1 900碱基 )和大亚
基 (如 25S～ 28S,约 2 000～ 5 000碱基 )的结构测定
取得了突破性进展。由于它们分子量大 ,包含的信息
量较 5S、 12S rRN A多得多 ,另一方面 ,大分子
rRN A还有分区特性 ,即分高度保守区和高变区 ,利
用其保守区的已知保守序列设计 1对通用引物就可
以同时测定不同进化等级各种生物类群的大分子
rRN A序列。 18S rRN A是唯一具有信息分子和功
能分子两种作用的编码核糖体 DNA的基因 ,为高
重复序列 ,约 800～ 10 000拷贝数 ,以连续排列方式
存在细胞内。同时 18S rRN A基因序列结构、功能十
分保守 ,若它们的序列存在变异就能成为一种很好
的 DNA标记 ,用于中药材的分子鉴别。 目前 18S、
25S rRN A基因测序技术已被用于人参、三七、塞隆
骨、杜仲、半夏的基原鉴别 [10～ 14 ]。
《中国药典》 ( 2000年版 )收载山药为薯蓣科植
物薯蓣 Dioscorea polystachya Turcz. (= D. opposi-
ta Thunb. , D. batatas Decais. )的块茎 [15, 16 ]。目前
广西大面积栽种和主要经营的山药是褐苞薯蓣 D.
persimilis prain et Burki ll的块茎 ,药材名 “广山
药” ,在广西栽培和使用已有 200余年 ,现已形成大
宗商品 ,年产量超过 100万千克 ,正式收入《广西中
药材标准》 [17 ]。 此外 ,广西地区还有将日本薯蓣 D.
japonica Thunb. (土山药 )、参薯 D .alata L. (方山
药 )就地取材加工后作“山药”代用品入药 [18 ]。 本文
报道采用 PCR直接测序技术对山药及其 3种地方
习用品广山药、土山药和方山药的 18S rRN A基因
核苷酸序列进行测序分析研究 ,以期通过探讨正品
与这些习用品间的 DNA序列同源关系 ,为山药基
原的准确鉴定及其品质评价提供分子依据。
1　材料与方法
1. 1　样品:本实验所用山药商品为 1999-05购自河
南文县 ,为薯蓣 Dioscorea polystachya的块茎 ;广山
药商品 1998-12购自广西容县杨梅乡 ,为褐苞薯蓣
D . persimilis块茎 ;日本薯蓣 D . japonica和参薯 D.
alata系 1999-08采自广西药用植物园 ,新鲜叶片 ,
学名经作者鉴定。
1. 2　试剂与仪器: 2× CTAB提取缓冲液: 100
mmol /L Tris-HCl ( pH 8. 0) ; 1. 4 mo l /L NaCl; 20
mmol /L ED TA; 2%十六 烷基三 甲基溴化 铵
( C TAB) ; 0. 34% 2-巯基乙醇 ; 1% PV P ( MW
40 000)。
1× CT AB沉淀缓冲液: 50 mmol /L Tris-HCl
( pH 8. 0) ; 10 mmol /L EDT A; 1% CTAB。
10% CTAB溶液: 10% CTAB; 0. 7% mol /L
NaCl。
TE缓冲液: 10 mmol /L Tris-HCl( pH8. 0) ; 1
mmol /L EDTA。
1× TBE电脉缓冲液: 89 mmol /L Tris-硼酸
盐 ; 89 mmo l /L硼酸 ; 2 mmol /L EDT A ( pH8. 0)。
1× Taq缓冲液: 10 mmol /L Tris-HCl ( pH
8. 3) ; 50 mmol /L KCl; 1. 5 mmo l /L MgCl2 ,
0. 001%明胶 ( perkin-Elmer /Cetus公司 )。
dN T Ps: d TAP, dT GP, d TCP, dT TP各 0. 2
mmol /L ( Perkin-Elmer /Cetus公司 )。
HH. S214型电热恒温水浴槽 (江苏医疗器械
厂 ) , 5417R型离心机与 Master Cycler Gradient型
PCR仪 ( Eppendorf公司 ) ,电泳仪 ( Bio-Rad公司 ) ,
ABI 377型 DNA自动测序仪 ( Applied Biosy stems
公司 )。
1. 3　引物设计: 18S rRN A基因 PCR扩增的通用
引物据 Sogin设计的序列 [19 ]合成。
·1027·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
18SF: 5’ -CAACCTGGTTG ATCCTGCCAG
T-3’
18SR: 5’ -CTGA TCCTTCTGCAGGT TCAC
CT AC-3’
由于 18S rRN A基因长度为 1. 8 kb左右 ,利用
单个引物进行一次 PCR测序反应无法测得此区段
全部序列 ,因此我们还据 White等的设计 [ 20]合成了
3对测序引物 18SF1, 18SR1、 18SF2, 18SR2和
18SF3, 18SR3进行双向测序。
1. 4　总 DNA制备: 根据作者摸索的干燥药材
CT AB微量提取方法 [21 ] ,取 100～ 130 mg样本细粉
加入 6倍预热至 56℃的 2× CTAB提取缓冲液 ,于
56℃水浴槽中保温反应 30 min,加入等量氯仿-异
戊醇 ( 24∶ 1)于离心机上以 14 000 g离心 10 min。
取上清液加 0. 1倍 10% CTAB溶液 ,室温下放置
10 min,再用氯仿 -异戊醇提取 1次。取上清液加等
量 1× CTAB沉淀缓冲液于室温下过夜 ,以 13 000 g
离心 30 min。 倾去上清液 ,粗 DNA沉淀用 65%和
85%乙醇各洗两次 ,然后于 60℃烤箱中干燥 30
min。加入 50μL TE缓冲液溶解 DNA,存于 - 20℃
冰箱备用。
1. 5　 PCR扩增反应:取 50～ 100 ng DN A作模板 ,
加入 dN TPs, 0. 25μmol /L引物 , 1. 5 U Taq DN A
聚合酶 ( Perkin-Elmer /Cetus公司 )及 1× Taq缓冲
液使最终反应体积为 50μL,置于 PCR仪 ,按下述
参数进行 1个 PCR循环: 94℃ , 3 min。然后按下述
参数进行 35个 PCR循环: 94℃ , 1 min; 60℃ , 1
min; 72℃ , 2 min。 最后按下述参数进行 1个 PCR
循环: 72℃ , 30 min。取 PCR反应液 5μL于 1. 0%
琼脂糖凝胶上用 0. 5× TBE电泳缓冲液于电泳仪中
电泳 , EB染色 , UV灯光下照相。 DNA长度与 1 kb
DN A ladder分子标记物 ( Pha rmacia公司 )比较。
1. 6　测序反应: PCR扩增产物经 QIAquick Puri fi-
cation试剂盒 ( Qiag en公司 )按其操作手册进行纯
化后直接用于测序循环反应。采用双脱氧末端终止
法按 Thermo Sequenase循环测序试剂盒 ( Amer-
sham Life Science公司 )实验指南进行测序。测序反
应分 4管 ,每管反应体积为 5. 0μL,内含 3. 0μL纯
化的 PCR产物 , 0. 2μL测序引物 ( 0. 2 pmol /L ) ,
1. 8μL d /ddN T P混合试剂 ,循环测序反应条件: 95
℃ , 5 min, 1个循环。 95℃ , 30 s; 50℃ , 30 s; 70℃ ,
1 min, 40个循环。 测序反应结束后加 3μL测序终
止缓冲液 ,离心混匀。 取 1μL测序反应液上样于
4%聚丙酰胺 -7 mmol /L尿素凝胶电泳板于测序仪
进行测序。
1. 7序列数据分析:所测单链序列经计算机阅读并
人工校阅后 ,采用 AutoAssembler程序 ( 1. 3. 0版
本 , Applied Biosy stems公司 )进行 DNA双向排序 ,
并以手工适当调整以减少空位 ( gap)数目。 排好的
序列用 PAU P软件 ( 4. 0版本 , Sinauer Associates
公司 )进行 DNA序列同源性比较 ,并以 UPGMA法
构建系统分支树。
2　结果与讨论
在本研究中 ,采用 CTAB微量提取法分离山药
及其 3种习用品总 DNA,无论新鲜叶片或干燥根茎
药材均能得到 23. 1 kb的 DNA(未发表数据 ) ,利用
18S rRN A基因通用引物进行 PCR扩增 ,获得预期
1. 8 kb的双链产物 (图 1)。经过测序发现 , 4种山药
与习用品 18S rRN A基因核苷酸序列中 ,山药、广山
药与土山药的长度相同 ,均为 1810 bp,而方山药为
1807 bp。 根据排序比较 ,山药与广山药两者序列完
全相同 ,同源性为 100% ,而山药与土山药、方山药
间的同源性分别为 99. 89%和 97. 51% (表 1)。
　表 1　山药与 3种习用品 18S rRNA基因核苷酸序列
同源性 (右上角 )和碱基变异位点数 (左下角 )
%
1 2 3 4 5
1山药 Dioscorea polystachya - 100 99. 89 97. 51 94. 40
2广山药 D. p ersimi lis 0 - 99. 89 97. 51 94. 40
3土山药 D. japonica 2 2 - 97. 51 94. 40
4方山药 D. alata 45 45 45 - 96. 23
5黄独 D. bulbi fera* 101 101 101 68 -
　　注: * 该种植物选作外类群 ,其 18S rRN A基因序列来自国际基
因库 GenBank(登录注册号 AF069203)。 　　
　 　 据 《中 国 植 物 志》记 载 , 薯 蓣 Dioscorea
polystachya、褐苞薯蓣 D. persim ilis、日本薯蓣 D.
japonica 和参薯 D. alata 同属周生翅组 Sect.
Enant iophyl lum Uline
[16 ] ,在广西地区薯蓣与褐苞
薯蓣两者具有相同的分布地域 [16, 18 ]。由于它们的植
物形态变异极大 ,药材加工方法相同 [22, 23 ] ,而且《中
国药典》中关于山药的药材性状及粉末显微鉴定与
《广西中药材标准》中关于广山药的描述几乎一
致 [15, 17 ] ,这使得山药与广山药在形态、组织上难以
区别。长期以来 ,人们一致认为广山药的原植物是薯
蓣 D. polystachya [ 23] ,直到 1996年经广西有关专家
先后数次深入主产地调查、考证和原植物、商品药材
详细鉴定 ,确定其原植物是褐苞薯蓣 D. persimil is,
并正式收入《广西中药材标准》 [17 ]。
然而 ,本实验所得 18S rRN A序列证明薯蓣和
褐苞薯蓣两者不存在核苷酸替代的变异位点 ,而薯
·1028· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
蓣与日本薯蓣、参薯间存在 2个和 45个碱基替代
(表 1,图 2 )。而我们从国际基因库 GenBank检索
1-山药　 2-广山药　 3-土山药　 4-方山药
M: 1 kb ladder分子标记物
图 1　山药及其 3种习用品 18S rRNA基因
PCR扩增图谱
到同属基生翅组 Sect. Opsophyton Uline的黄独 D.
bulbi fera L. 18S rRN A序列长度为 1 724 bp[24 ] ,通
过排序比较发现 ,后者与基生翅组 4种植物间发生
68-101个碱基替代 ,同源性仅 94. 40%～ 96. 23%
(表 1,图 2)。通过以 Kimura双参数法作 U PGMA
分支分析 ,发现薯蓣和褐苞薯蓣两者的遗传距离
( D)为零 ,与日本薯蓣 D= 0. 000 5,先聚为一支。 再
与参薯 D= 0. 010 5,共组成一个基生翅组类群。 而
薯蓣与黄独间遗传距离相对较大 ( D= 0. 025 3) ,后
者形成另一个基生翅组外类群基支 (图 3) ,与形态
学特征吻合。这提示保守的 rDN A片断序列不仅可
以分辨同属不同组植物 ,而且能区分同组不同种近
缘植物。
上方数字为自上游核苷酸位置 ,* 代表与薯蓣 Dioscorea polysta ch ya相同之碱基
图 2　薯蓣及其近缘植物 18S rRNA基因部分片段序列同源性比较
分枝上数字代表遗传距离值 ( D)
图 3　薯蓣及其近缘植物的 UPGMA分支系统树
　　这些结果对广山药的基源究竟是何种植物至少
产生两个疑点 ,一是广山药的原植物是否是真正的
褐苞薯蓣?据考证 ,广山药从清乾隆年间由野生引为
家种的 [22 ] ,经过 200余年的栽培 ,形态发生了变异 ,
很可能当时它的野生种就是薯蓣 ,而现在被订为褐
苞薯蓣。二是广山药是否是正品山药的一个 (栽培 )
变异类型?由于野生薯蓣很少开花结籽 ,人工授粉不
易 ,因此山药栽种主要是依靠珠芽 (零余子 )无性繁
殖 [25 ]。我们观察到广山药的栽培有类似的情况。许
多研究证明 ,在单子叶植物中无融合生殖与细胞多
倍体化 ( polyploidization)呈相关性 [2 6, 27]。虽然无性
繁殖阻碍了基因重组 ,对进化不利 ,但薯蓣是兼性无
融合生殖 ,它能不时地扩大专性无融合生殖群体所
代表的基因库。而植物的多倍体化不仅加强了无性
繁殖的作用 ,并且加强了其生态适应的能力 ,从而扩
大了分布范围。薯蓣在亚热带的广西与褐苞薯蓣存
在相同的自然分布 ,很可能褐苞薯蓣就是薯蓣种内
的一个多倍体变异类型 (栽培品种 )。要进一步解决
以上问题 ,需作深入的细胞学与分子系统学研究 ,如
通过大分子 rRN A高变区的 ITS序列进行网状进
化 ( reticulate evolution)分析。
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药用植物粉花绣线菊的组织培养的建立与快速繁殖研究
胡益明 ,甘烦远* ,彭丽萍 ,郝小江
⒇
(中国科学院昆明植物所 ,云南 昆明　 650204)
摘　要: 目的　建立了粉花绣线菊 Spiraea japonica L. f. 愈伤培养系统和快速繁殖方法。方法　通过用 M S、 6, 7-
V、 B5等 3种不同的培养基对粉花绣线菊植株的茎尖、嫩叶、叶柄等不同部位进行愈伤组织诱导和成苗诱导。 结果
　通过本研究 ,建立了愈伤培养系统 ,实现了快速繁殖。 结论　 M S培养基诱导愈伤效果最好 ,在 M S+ 2, 4-D 2. 0
mg / L+ K T 0. 3 mg /L培养基中 ,幼叶、茎尖、叶柄等外植体均能诱导出愈伤组织 ,其中以茎尖外植体诱导的效果最
好 ;茎尖外植体在 M S+ 2 mg /L BA+ 0. 1 mg /L NAA能长出丛生苗 ,将丛生苗转入培养基 1 /2M S+ 0. 25 mg /L
BA+ 0. 5 mg /L NAA可生根成小苗。
关键词: 粉花绣线菊 ;组织培养 ;快速繁殖
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1030 04
Studies on establishment of calli culture for rapid propagation of Spiraea japonica
HU Yi-ming , GAN Fan-yuan, PENG Li-ping , HAO Xiao-jiang
　　 ( Kunming Institute of Botany , Chinese Academy o f Sciences, Kunming Yunnan 650204, China )
Abstract: Object　 To establish a calli culture system for the rapid propagation of Speiraea japonica
L. f. . Methods　 Callus and shoo t induction w ere ca rried out on M S, 6, 7-V o r B5 media wi th dif ferent
parts of the plant such as stem tip, tender leaves and petiole as explants. Results　 A calli culture system
w as established for the rapid propaga tion of S. japonica. Conclusion　 MS cultural medium was found to
be most sui table fo r calli induction. M S wi th 2. 0 mg /L 2, 4-D+ 0. 3 mg /L KT can induce calli when the
explants w ere used fo r the induction, wi th stem tips being the most sa tisfacto ry explant. Clusters of
seedling s can be induced on M S+ 2 mg /L BA+ 0. 1 mg /L N A A and when these seedling s w ere t ransfer red
to 1 /2 M S+ 0. 25 mg /L BA+ 0. 5 mg /L N AA medium, roo t were developed to giv e young seedling s. -
Key words: Spiraea japonica L. f. ; cullus t issue; rapid propagation
·1030· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
收稿日期: 2001-01-19基金项目:国家自然科学基金 ( 30070087)资助 ;中国科学院资源与生态环境研究重点项目 ( KZ952-31-108)经费资助作者简介:胡益明 ( 1971-) ,男 ,湖北人 ,现为中国科学院昆明植物研究所硕博连读生。研究方向:中药重要成分的生物合成。 E-mai l: Hyiming
@ yahoo. com
* 通讯联系人　 Tel: 0871-5223111