全 文 ：3　讨论
三冬茶对小鼠的小肠推进运动有促进作用 ,也
明显加快小鼠黑便的排出 ,增加排便的次数、重量和
含水量 ,其效果优于阳性对照药便秘通。同时三冬茶
可以增加小鼠和大鼠肠道的含水量 ,特别是增加小
鼠大肠的含水量 ,抑制大肠对水分的吸收 ,可起到软
化大便的作用 ,故临床上可望用于治疗便秘症。
参 考 文 献
1　许振朝 .中草药 , 1997, 29( 1): 29
2　王　静 ,等 .中药材 , 1998, 21( 7): 363
3　陈　奇主编 . 中药药理研究方法学 . 北京:人民卫生出版社 ,
1993: 339
4　冯所安 ,等 .中草药 , 1997, 28( 5): 290
( 1999-03-28收稿 )
灵芝复方诱导 HL-60白血病细胞凋亡的研究△
湖南医科大学血液生理研究室 (长沙 410078)　　钟　理 　蒋德昭　王绮如
摘　要　应用体外集落与液体培养、细胞形态学观察、 DN A片段凝胶电泳及 DNA片段百分率测定等方法观
察灵芝复方对人骨髓 CFU-GM生长及 HL-60细胞增殖和凋亡的作用。发现灵芝复方在一定浓度范围内对人
骨髓 CFU-GM生长有促进作用 ,而对白血病细胞系 HL-60细胞集落生长则表现出剂量依赖性抑制 ;细胞形
态学结果表明 ,灵芝复方对 HL-60细胞凋亡具有剂量和时间依赖性诱导作用。 8和 16 mg /mL灵芝复方作用
48 h ,可使 HL-60细胞 DNA片段百分率明显升高 ; DNA片段凝胶电泳显示有明显的细胞凋亡“梯形”表现。
提示灵芝复方可通过选择性诱导白血病细胞凋亡来发挥抗白血病作用。
关键词　灵芝复方　 CFU-GM　 HL-60细胞　增殖　凋亡
The Induction of Lingzhi (Ganoderma lucidum ) Compound on the Apoptosis of
HL-60 Leukemic Cells
Resea rch Laboratory of Blood Phy siolog y, Hunan M edical Universi ty ( Changsha 410078)　 Zhong Li,
Jiang Dezhao and Wang Qiru
Abstract　　 A series of experiments including semi-solid colony culture and liquid culture in vitro,
DN A fragments in gel elect ropho resis and the percentag e o f DN A fragmentation test w ere undertaken to
investigate the ef fects of Ganoderma lucidum ( Leyss ex Fr ) Karst Compound ( GLC) on the g row th of
CFU-GM deriv ed f rom human bone marrow and on the pro li feration, apopto sis o f HL-60 cells. The resul ts
indica ted that di fferent concentrations o f GLC could promo te human BM CFU-GM prolifera tion, but sup-
pressed the g row th of HL-60 cell colonies. The cell mo rphological observ ation discovered tha t GLC in-
duced HL-60 cells apoptosis in a do se-dependent and time-dependent manner. Treating HL-60 cells wi th 8
mg /mL o r 16 mg /mL GLC for 48 h increased the percentag e of DN A fragmentation of these cells, and pro-
duced typical ladders of DN A fragments in gel elect rophoresis. It is concluded tha t GLC could ki ll the
leukemic cel ls by inducing them to apoptosis. GLC would be a good medicine for leukemia therapy.
Key words　　Ganoderma lucidum ( Leyss ex Fr) Karst Compound ( GLC)　 CFU-GM　 HL-60 cells
　 proli feration　 apoptosis
　　细胞凋亡是一种细胞主动性死亡过程。在肿瘤
发生发展过程中起着重要作用。 常用的许多具有不
同作用机制的抗肿瘤化疗药物都能诱导或强化肿瘤
细胞凋亡 [1 ]。 而诱导癌细胞的凋亡也成为寻找抗肿
瘤药物的新途径。体外实验证明 ,许多抗白血病药物
能抑制白血病细胞增殖 ,并能诱导其凋亡。本室发现
灵芝复方 [Ganoderma lucidum ( Leyss ex Fr) Karst
Compound, GLC ]在一定浓度范围内能促进正常小
鼠骨髓粒 -单系集落形成单位 ( C FU-GM )增殖 ,并对
小鼠白血病细胞系 WEHI-3细胞集落生长呈剂量
·34· 中草药　 Chinese Tradi tional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 1期
Address: Zh ong Li , Depar tment of Blood Physiology, Hunan Univ ersi ty of M edical Sciences , Ch angsha钟　理　男 , 1994年毕业于湖南医科大学 ,获医学学士学位。1997年毕业于湖南医科大学血液生理研究室 ,获医学硕士学位。研究方向:造血调控 (白血病分子生物学及中西医结合治疗机制 ) ,发表科研论文 4篇。 1997年～ 1999年 1月在中山医科大学生理教研室任助教 , 1999年 2月至今在美国华盛顿大学医学院进修学习。△湖南省卫生厅基金资助
依赖性抑制 [2 ]。为进一步了解灵芝复方的骨髓保护
及抗白血病作用 ,为其临床应用提供依据 ,我们从细
胞增殖和诱导凋亡方面观察了其对人正常骨髓细胞
及人急性髓性白血病细胞系 HL-60细胞的影响。
1　材料
1. 1　药物: 灵芝复方由灵芝 Ganoderma lucidum
( Leyss ex Fr. ) Karst、 黄 芪 Astragalus mem-
branaceus var. monghol icus ( Beg. ) Hsiao、 党 参
Codonopsis pilosula ( Franch. ) Nannf.、当归 Angeli-
ca sinensis ( Oliv. ) Diels、甘草 Glycyrrhiza uralensis
Flsch. 等中草药配伍组方而成 ,各组药由湘雅医院
中药房提供。 阿糖胞苷盐酸盐 ( Ara-C Hydrochlo-
ride) (美国 Sigma Co. )。
1. 2　骨髓标本:肋骨来自湖南医科大学附属湘雅医
院、湖南医科大学附属第二医院胸外手术非血液病
患者。
1. 3　细胞系: HL-60细胞系由北京军事医学科学
院引进。
1. 4　试剂: DMEM (美国 Sigma Co. ) , RPM I-1640
(美国 GIBCOBRL)按说明配制。新生牛血清 ( N BS)
(杭州四季青生物工程材料研究所 ) ,马血清 ( HS)
(北京军事医学科学院 ) , rh GM-CSF ( 10 U /μL)
( Genzyme Co. )二苯胺、三氯乙酸 ( TCA) (广州 )。
2　方法
2. 1　灵芝复方的制备:将复方的各组分经水泡、煮
沸过滤提取、醇沉、蒸馏 ,用双蒸水稀释 ,使含生药
0. 8 g /mL,过滤除菌 , 4℃保存。取样作各项检测。
酚类化合物、氰化物、亚硝酸盐等毒物检查符合国家
GB-7718-87标准。
2. 2　人骨髓细胞 CFU-GM体外培养: 按文献方
法 [3 ] ,分离人骨髓单个核细胞 ,以 2× 105 /mL的浓
度加入到体外半固体琼脂培养体系中 ,含 28% HS、
10%人 AB血清、 50 U /mL rhGM-CSF、 0. 3%琼脂 ,
实验组加不同浓度的 GLC( 4～ 20 mg /mL) ,对照组
加等量 DMEM培养液 ,种植 1 mL培养体系于直径
30 mm的培养皿中 ,置 37℃、 5% CO2、饱和湿度培
养 14 d后 ,取出置倒置显微镜下观察 ,以大于 40个
细胞组成的集落计数为 1个 CFU-GM。
2. 3　 HL-60细胞集落培养: 取指数生长期 HL-60
细胞 1× 103 /mL加入到含 25% N BS、 0. 3%琼脂的
培养体系中 ,实验组加不同浓度的 GLC( 4～ 20 mg /
m L) ,对照组加等量培养液 ,同 2. 2条件培养 7 d,计
数集落数 (大于 50个细胞的细胞团为 1个集落 )。
2. 4　 HL-60细胞液体培养及药物处理: 将处于指
数生长期的 HL-60细胞 1× 105 /mL接种于含 10%
NBS的 RPM I-1640培养基中 ,加入不同浓度的药
物 ,置 37℃、 5% CO2、饱和湿度培养 1～ 5 d。
2. 5　细胞形态学观察 ( W right-Giemsa染色 ):离心
收集经药物处理 ,培养 1～ 5 d的 HL-60细胞 , PBS
洗涤 1次 ,涂片 ,干燥后 Wright-Giemsa染色 ,油镜
下观察细胞形态 ,计数 200个细胞 ,参照文献标
准 [4 ] ,计算凋亡细胞百分率并摄影。
2. 6　 DN A片段凝胶电泳:离心 ( 200× g , 5 min)收
集经药物处理 48 h的 HL-60细胞 , PBS洗涤 2次 ,
去上清按文献法 [5 ]提取 DNA,取 20μL DNA样品 ,
1. 5%琼脂糖 , 0. 5× TBE缓冲液 , 50 V电压下电泳
4 h ,溴乙锭 ( 5μg /mL)染色后紫外光透射摄影。
2. 7　 DNA片段百分率测定:按文献方法 [6 ] ,培养细
胞离心 ( 200× g, 5 min)收集后 , PBS洗涤 2次 ,去上
清 ,加细胞裂解缓冲液 , 4℃离心 ( 1 600× g , 5 min)
分离出上清 (片段 DNA)和沉淀 (完整 DNA) ,分别
加等体积 25%三氯乙酸 ( TCA) , 4℃沉淀过夜。4℃
离心 ( 1 300× g , 5 min)弃上清 ,加入 5% TCA溶解
沉淀 , 90℃加热 10 min,冷却 5 min,再加入新配制
的 1. 5%二苯胺溶液 ,混匀后 30℃避光过夜。 取反
应后样品加入 96孔板 ,用酶标仪测定 OD570值 ,计算
DNA片段百分率 [上清 OD值 / (上清 OD值+ 沉淀
OD值 ) ]。
2. 8　统计学处理:实验结果以 ( x-± s )表示 ,各组间
差异采用 F检验 ,若 F> F0. 05 ,则两两比较用 Stu-
dent-Newman-Keuls q检验 ; IC50的计算用概率法。
3　结果
3. 1　 GLC对人骨髓 CFU-GM增殖的影响: 如表 1
所示。 与对照组比较 , GLC为 4 mg /mL时 , CFU-
GM数有非常明显增加 ( P < 0. 01) , 8, 12 mg /mL仍
有明显增加 ( P < 0. 05) ,各浓度间无显著性差异
( P> 0. 05)。 GLC达 20 mg /mL时 ,对 CFU-GM增
殖出现抑制作用 (P < 0. 01)。
3. 2　 GLC对 HL-60细胞集落产率的影响:由表 1
可见 , GLC( 4～ 20 mg /mL)对 HL-60细胞集落生长
均呈剂量依赖性抑制 ( P < 0. 01)。 IC50为 10. 8 mg /
mL。
3. 3　 GLC作用后 HL-60细胞的形态学改变: 对照
组 HL-60细胞以原粒及早幼粒细胞多见 ,经 GLC
处理的 HL-60细胞 ,可见部分细胞呈现典型的凋亡
细胞形态 ,即核固缩、胞膜突起 ,还可见到凋亡小体。
不同浓度 GLC处理 1～ 5 d后 HL-60细胞凋亡细胞
百分率如表 2所示 , 凋亡细胞率呈明显的剂量和时
·35·中草药　 Chinese Tradi tional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 1期
表 1　 GLC对人正常骨髓 GFU-GM及 HL-60
白血病细胞集落生成的影响 ( n= 6,x-± s )
组别 剂量
( mg /m L)
集落生成数 /对照组集落生成数 (% )
C FU-GM CFU-HL-60
对照 - 100. 0± 26. 1 100. 0± 9. 4
GLC 4 140. 6± 21. 8* * 69. 6± 6. 5* *
8 136. 4± 19. 6* 55. 3± 8. 8* *
12 135. 5± 30. 2* 44. 6± 6. 0* *
16 120. 5± 11. 1 30. 8± 3. 5* *
20 44. 5± 15. 6* * 18. 5± 3. 9* *
　　与对照组比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
间依赖性增加 (P < 0. 05)。 20 mg /mL GLC处理 5
d,凋亡细胞百分率达 73. 5% (而对照组只有
5. 7% ) ,表明大部分细胞已发生凋亡。
3. 4　 DNA凝胶电泳图谱: GLC处理 HL-60细胞
48 h,提取 DNA作凝胶电泳 ,结果所示 8, 16 mg /
mL GLC以及阳性对照 1× 10- 5 mol /L Ara-C均出
现典型的凋亡特征性“梯形” DNA带型 ,而未加药对
照组为阴性 (图 1)。
表 2　培养 1～ 5 d不同浓度 GLC对 HL-60凋亡细胞百分率的影响 (n= 3,x-± s)
组别 剂量
( mg /m L)
HL-60凋亡细胞百分率 (% )
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d
对照 - 1. 2± 0. 3 1. 2± 0. 6 2. 0± 0. 5 2. 8± 0. 6 5. 7± 0. 8
GLC 4 3. 7± 0. 8* 8. 3± 0. 8* * 10. 2± 2. 1* * 10. 3± 1. 0* 13. 8± 1. 9*
8 7. 5± 1. 0* * 12. 5± 1. 0* * 18. 7± 3. 0* * 24. 5± 4. 0* * 42. 3± 3. 8* *
16 8. 5± 1. 3* * 17. 8± 3. 9* * 26. 7± 2. 8* * 38. 0± 7. 3* * 56. 0± 3. 6* *
20 9. 8± 1. 3* * 25. 5± 3. 5* * 34. 2± 2. 8* * 50. 8± 2. 6* * 73. 5± 4. 8* *
　　　与对照组比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
A-1× 10- 5 mol /L Ara-C　 B-16 mg /m L GLC
C-8 mg /mL GLC　 D-对照组　 M-ΥX174 /HaeⅢ maker
　　图 1　灵芝复方作用 48 h的 HL-60
细胞 DNA凝胶电泳图谱
3. 5　 DNA片段百分率: DN A片段百分率结果显
示 , 8, 16 mg /mL GLC以及 1× 10- 5 mo l /L Ara-C
处理 48 h, HL-60细胞 DNA片段百分率均比对照
组明显升高 ( P < 0. 01) (表 3)。
表 3　 GLC和 Ara-C对 HL-60细胞 DNA
片段百分率的影响 (n= 3,x-± s)
组　别 HL-60细胞 DN A片段百分率 (% )
对照 13. 1± 0. 9
8 mg /m L GLC 30. 8± 0. 8*
16 mg /m L GLC 37. 4± 1. 7*
1× 10- 5 mol /L Ara-C 55. 3± 2. 4*
　　　与对照组比: * P < 0. 01
4　讨论
现代医学研究证明 ,灵芝复方中的主药灵芝具
有促进细胞免疫和骨髓造血的功能 [ 7] ,同时有研究
表明 ,灵芝中各成分对多种肿瘤有抑制作用 ,如灵芝
菌丝体提取物对 S180实体瘤有明显的抑制作用 [8 ];
从赤芝中分离的三萜类成分灵芝酸对离体培养的肝
肉瘤具细胞毒性。有人认为 ,灵芝的抗瘤活性与其高
含量的碳水化合物有关 [9 ]。
　　本研究的结果显示 , GLC在一定浓度范围内
( 4～ 12 mg /mL)能促进正常骨髓粒系造血 ,而对
HL-60细胞增殖表现出明显的抑制作用 ,且与作用
时间和剂量有关。这说明 GLC对白血病细胞有选择
性杀伤作用。随着 GLC剂量的加大和时间的延长 ,
具凋亡特征的 HL-60细胞比例明显提高。 经 GLC
处理的 HL-60细胞出现典型的“梯形”图谱 , DN A
片段百分率也明显升高 ,表明 GLC可通过触发细胞
凋亡来达到杀灭白血病细胞的作用。这与许多常用
的抗白血病化疗药物作用机制是一致的。 可见 ,
GLC在体外具有选择性抑制白血病细胞增殖和诱
导白血病细胞凋亡的作用 ,为临床运用 GLC治疗白
血病提供了一定的实验依据。
致谢:湖南医科大学生理教研室李俊成教授及
文志斌副教授提供灵芝复方液。
参 考 文 献
1　 Kerr JFR, et al . Cancer, 1994, 73: 2013
2　蒋德昭 ,等 .河南医学研究 , 1995, 4(增刊 ): 22
3　王承龙 .湖南医科大学学报 , 1995, 20( 5): 409
4　 Wyllie A H, et al . Int Rev Cy to, 1980, 68: 251
5　 Herrman M, et al . Nucleic Acids Res, 1994, 22( 24): 5506
6　 Mangan D F, et al . J Immunol, 1991, 146
7　林志彬 .北京医科大学学报 , 1992, ( 4): 271
8　 Sone Y, et al . Ag ric Biol Ch em , 1985, 49( 9): 2841
9　 Maruyama H, et al . J Pharmacobiodyn , 1989, 12: 118
( 1999-03-29收稿 )
·36· 中草药　 Chinese Tradi tional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 1期