全 文 ：抗青篙醋钠伯氏疟原虫膜的流动性△
山东省中医药研究所 ( 济南 52 0 14 ) 刘爱如 . 赵东坡 吕丽莉 隋在云
摘要 用荧光探针 D P H 标记伯氏疟原虫膜脂 , 在荧光显微分光光度计下测其荧光 偏 振 度 P值 。
结果表明抗青篙醋钠伯氏疟原虫膜的 P值大于正常伯氏疟原虫膜的 P值 。 提示抗青高酷钠伯氏疟原
虫膜的流动性低于正常伯氏疟原虫膜的流动性。
关键词 伯氏疟原虫抗青篙醋钠株 伯氏疟原虫正常株 荧光显微分光光度计 荧光偏振 度 1 , 6 一
二苯基一 1 , 3 , 5一己三烯
疟原虫寄生于活细胞内 , 其营养物质的供给 、 代谢产物的排出 以及抗疟药物的作用必须
经过膜 ( 经细胞膜和疟原虫膜 ) 才能顺利完成。 大量研究表明 : 红细胞感染疟原虫后 , 出现
生化代谢 。 , 2 〕 , 形态结构 〔3’ 4〕和功能〔 5 〕的异常变化 , 也有青篙素〔“ 〕和青篙醋钠 〔7 〕对疟 原 虫
超微结构影响的报道 。 我们研究发现感染抗青篙醋钠伯氏疟原虫红细胞脂膜的流动性 已发生
了变化〔 6〕。 现进一步对抗青篙醋钠伯氏疟原虫膜的荧光偏振度进行测定 , 拟从原虫本身的变
化为抗青篙醋钠机理寻找依据 。
1 实验材料
1
.
1 试剂及其配制 : 1 , 6一二苯基一 1 , 3 , 5一己三烯 ( 1 , 6一 d i p h e n y l一 z , 3 , 5一h e x a t r i e r e , D P -
H ) 美国 s ig m a 公司出品 , 用四氢吠喃配成浓度为 2 x 1 0一 m ol / L 的原液 ,临用时 以 p H 7 . 2
P B S稀释成 2 x 1 0一 “ m o l / L 的工作液 。 P e r c o l l为 S i g m a 公司产品 , 用 p H 7 . 4 P B S 配成 6 0%
P e r e e l l分离液〔 9 〕应用 。
1
.
2 伯氏疟原虫正常株 ( P l a s m o d i u m b e r g h e i N s t r a i n , K z 7 3 ) , 以 下 称N 原 虫 ,
由军事医学科学院微生物流行病研究所引进 , 用体重 20 士 lg 的雄性 S w i s s小鼠 , 每鼠腹腔注
射感染红细胞 2 x 1 0 7个 , 每 6一 7 d传代一次 , 保种 。
2
.
3 伯氏疟原虫抗青篙醋钠株 ( P l a s m o d i u m b e r g h e i S A 一 R : t r a i n ) 以下称 R原虫 , 由
本所药理室培养〔 1“ 〕 。
3 实验方法
2
.
1 感染伯氏疟原虫红细胞 的分离 : 选择寄生率在 3 0% 以上 , 分别感染富含 N 或 R 成热滋养
体原虫小鼠 , 心脏取血于离心管内 , 3 . 8% 拘椽酸钠溶液防凝 。 然后 , 沿离心管壁徐徐 加 入
己备好的 6 0% P e r e o l l分离液面上 , 其容积比为 3 : 5 , 2 5 0 0 o r / m i n离心 1 5 m i n , 使 血液分
出 。 取界面棕色层 , 用 p H 7 . 2 1 l/ 5 m ol / L P B S洗 2次 , 即得感染率高达 95 %左 右 的 红 细
胞 , 其中绝大部分为成熟滋养体 。 用 P B S调整红细胞悬液浓度为 4 x 1 01 “ / L 。
2
.
2 游离疟原虫的制备 : 溶血 : 用 0 . 83 % N H 4 c 卜 T ir s缓冲液 , p H 7 . 4 0 . 02 m o l/ L 与 上
述调整后的红细胞悬液 , 按体积 9 : 1混合 , 置 37 ℃温育 10 m in ,不时轻轻振摇 , Z 0 0 0 r / m in 离
心 10 m i n , 除去表层 白色絮状物 , 如此反复 3 次 , 最后用 P B S洗 2次 , 再调整恢复其原体积 。
此 为一个样品 。
2
.
3 疟原虫膜的D P H标记 : 将 上述样品与 D P H工作液 1 : 1混匀 , 于 27 ℃染色 3 0 m in , 1 5 0 0
r/ m in 离 心 10 m in , 弃去剩余的标记液 。 其沉淀物用 P B S洗 2次 , 最后用 P B s稀释一倍 , 灌
*
A d d
r e s s : L i u A i r u
,
S h a n d o n g I n s t i r u t e o f T r
a
d i t i o n
a l C h i n e s e M e d i e i n e a n d
M a t e r i a M e d i e a
,
J i n a n
《 中草药 》 1 9 9 5羊第 26 卷第 8期 4 19
注血球计数板 , 立即测 身。
2
.
4 疟原虫膜的荧光偏振度 P值的测量 : 所用仪器为西德荧光显微分光光度计 ( SM P 一 0 5 ) ,
有 1 R S垂直照明器及偏振光装置 。 光源为 20 o w 的高压汞灯 , 激发滤片为 3 6 5 n m , 光束分离
镜为 3 9 5 n m , 阻断滤片为 3 9 5n m , 视野光栏的有效直径为 2 0n m , 测量光栏的有效直 径 秘大
于视野光栏 , 起偏器固定在垂直位 ,物镜为N e of u ar l o o x N O 1 . 3 ,用红 色透射光照明聚焦
和观察原虫形态和分布情况 ,选择虫体分布均匀的视 野进行测量 ,测试温度控制在 27 士 0 . 5℃ 。
每样品测 2 0个视野 。 先测其 _ L清在检偏器垂直位和水平位的荧光强度 , 为术底的荧光强
度。 再测原虫在检偏器垂直位和水平位的荧光强度 , 最后分别减去本底的荧光强度 。 所需的
荧光偏振度 P值 , 用下列公 式〔幻计算 。
, I v v 一 G v H ~ 、 , _ ~ 一 、 , , 一 I、 一 _ _ 二 、 , , , 。 。 _ _ _ _ _ ~ . _ ` .
P = 针介下谁带罗G 为校正因子 , G = 奋望l 一 。 本实验测得的G = 0 . 68 。 P值越大 , 微粘I v v + G L 、 一 / ` 认 ` 一 ~ ” 一 IH 。 ’ 入~ ` · ` U 曰 一 ` ·一 “ 二 .” · ,二 / 、 夕 ,姚 泪度越大 ,则流动性越小 ;其值越小 , 微粒度越小 , 则流动性越大 。
3 结果与讨论
本文结果 , R原虫膜的荧光偏振度 P值明显大于 N 原虫 ( 尸 < 。 . 05 ) , 见表 。 提示 R 原虫
膜的流动性低于N 原虫膜的流动性 。
青篙素类抗疟药的抗疟机理是由该类药
的化学结构待点含有过氧桥所决定。 基于其
在代谢过程中产生 自由基 〔 1均或使红细 胞 中
O
: 和 H ZO : 等活性氧的浓度升高〔 1 2〕 , 一方面
可能 直 接杀伤疟原 虫 , 另一方面可氧 化 红
细胞不饱和脂肪酸产主M D A 等产物 , 这些
产物有很高的 反应活性 , 可交联脂 质 和 蛋
表 伯氏疟原虫正常株和抗育篱醋钠
株原虫膜的荧光偏振度值 ( 觉士 50 )
原虫 样品 数 荧光偏振 度尸值 `
0
`
2 78 1士 0 . 0 1 5只
。
3 0 1 0 士 0 。 0 1 8 0争
N
.
P < 0
.
0 5
白 , 它们既可直接作用于疟原虫 , 也可使红细胞损伤 、 破溶 , 而 导致疟原虫死亡 。 药物作用
于细胞必须通过细胞膜 , 而许多药物又能改变细胞膜的性 质〔 13 〕 。 显然 , R 原虫及其所 寄生
红细胞膜的流动性降低〔 8〕 , 是 长期施加药压所形成的一种适应 。 此膜的改变可影响药物掺入
( 待发表文章 ) , 致使药效降低 。 如能通过细胞代谢或其他因素对生物膜迸行调控 , 使其恢
复原来膜的流动性 , 达列恢复或提高疗效的话 , 则对原虫膜的流动性降低也是生产抗药性机
理 ( 之一 ) 的有力佐证 。
S e h w a r t z R S
,
( 2 )
: 4 0 1
万0 s h i P , e t a l ,
( 1 )
:
1 0 3
B o d a m m
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2 8 t 7 0 3
W
e i d e k a m E
,
参 考 文 献
e t a 1
.
B l o o d
, 1 9 8 7 , 6 9 8
B i o e h e m J
, 1 9 87
, e t a l
.
I a b I n v e s t
,
2 4 6
1 9 7 3
:{
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。
B i o c h e m B i o P h a
A c t a
一 1 9 7 3 , 3 2 3* 5 3 9
T a n a b e K
。
P a r a s i t o l T o d a y
。
1 9 9口 -
( 7 ) : 2 1 5
叶祖光 , 等 . 中国寄生虫学与寄生虫病杂念 ,
19 8 6
, 4 ( 4 ) : 2 6 0
李 锐 , 等 . 中草药 , 2 9 8 2 , x Z ( ` ) : 3 1
刘 爱如 , 等 . 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ,
1 9 9 4 , 12 ( 3 )
: 7 0
B i v a d e n e i r a E M
, e t a l
.
J P r o t o z o o l
,
19 8 3 , 3 0
: 3 3 7
刘受如 , 等 . 中国药理学报 , 19 57 , 8 ( 2 ) : 1理9
靳永刚 , 等 . 中国药理学与毒理学杂志 , 1 9 8 9 , 8
( 2 ) : 1 3 8
蔺福宝 , 等 . 中国医学科学院学报 , 1 9 89 , 1 1 ( 3 ) .
1 8 0
杨福偷 , 等 . 生理化学与生物物理进展 , 1 9 8 5 ,
6 , 1 1
( 19 9 4一 0 5一 2 7收稿 )
, 浮戈O