全 文 ：· 药剂与工艺
植物细胞膜固定化培养及产物释放行为研究△
天津大学化工系 ( 3。。。 72) 哀其朋 令 元英进 胡宗定
摘 要 研究了植物细胞膜固定化培养中各种参数对反应器性能的影响 ,结果表明 :细胞层厚度
为 7 ~ s m m 时生产能力可达到较高的水平 ;孔径为 80 ” m 的不锈钢丝网是合适的固定化长春花细
胞膜材料 ;压力脉冲是促进胞内生物碱释放的有效手段 ;并在理论上建立计算反应器允许细胞层
厚度的方法 ,计算结果与实验吻合较好 。
关镇词 膜反应器 长春花细胞 释放
传统植物细胞膜固定化方法如凝胶包
埋 .1t “ 〕 、 自然固定化方法以及多孔载体固定过
程 〔3飞 , 常受到植物细胞对化学物质敏感性的
限制 。尽管凝胶包埋价格便宜 ,气相传质阻力
也较小 ,但凝胶颗粒通常可以压缩 , 在工业化
规模的填充床内由于压降大 ,流动形式不均
一而操作困难 。在流化床内进行 ,颗粒磨损又
是另一大问题 , 这些问题不可克服而又特别
重要川 。 膜固定化植物细胞显示 了独特的优
点 : 〔幻 a) 膜设备中流体流动 、 压降与放大关系
不大 ,从而减化 了放大过程 ; b) 膜设备可重
复使用 , 降低了造价 ; 。 )利用膜的分离功能 ,
选择性地分离产品 , 降低了产品抑制 , 同时又
降低了下游处理费用 ; d) 易于连续化生产 ,有
巨大的工业化潜力 ; e ) 实验室可作为研究细
胞生理的工具 。
这里强调指出 ,对膜反应器培养植物细
胞的研究尚不完善 ,研究的重点往往是合适
膜材料的选择 、膜固定化合植物细胞的活性
及对增加次生代谢产物的作用 , 但有关传质
阻力对反应器性能影响的研究 尚不多见 ,还
未见有关细胞层厚度对细胞次生代谢产物合
成能力影响的研究报道 ,也没有人从反应扩
散方程入手 , 在理论上建立确定合适细胞层
厚度的方法 。
气相传质是限制膜反应器操作的主要因
素 。为此 ,在操作过程中让气体直接与细胞接
触 。细胞表面较干 , 因而保证了充足的氧气供
应 , 同时 , 液体中溶解气体减少 , 也大大减小
了液相传质阻力 。
1 材料与方法
细胞株系 : 长春花细胞株系由本实验室
从长春花叶子诱导而来 。
培 养基 : M S 培养基附加 6 B A , l m g / L ;
I A A
,
0
.
Zm g / L ; 蔗糖 , 5 0 9 / L ; 起始 p H 值为
5
.
8
。
反 应 器 实验 : 将 反 应 器 和 培养基 在
120 ℃下进行灭菌 ,在无菌条件下将细胞接种
在反应器中 。观察细胞的生长情况 ,一定时间
后 ,取出测细胞与液相生物碱含量 。
反应器细胞测定方法 : 将细胞从反应器
中取出 ,在离心管底部加上能吸潮的物质 ,离
心 ( 4 0 0 o r / m i n ) l o m i n , 称鲜 重 , 放入烘 箱
( 90 C )中烘 2 h4 , 称其干重 , 同时得到干 、 鲜
比 。
生物碱测定 : 液相与细胞 中生物碱的分
析方法见参考文献 〔6 , 。
2 实验部分
2
.
1 实验流程 : 实验采用两种流程 A 和 B 。
流程 A 如图 1一 A 所示 。 气体经管式活性
炭空气过滤器 ,再经孔径小于 .0 2拜m 膜空气
过滤器进入培养基储瓶 , 气体出 口 由 N a O H
`
A dd
l e s s : Y u a n Q i p e n g
,
eD p
a r t m
e n t o f C h
o n 飞i e a l E n g i n e e r in g , T ia n ji
n
U
n i v e r s i t y
,
T i a n j i
n
△ 本项 目为博士点基金资助项目
《中草药 》 1 9 96 年第 27 卷第 5 期 · 2 7 1 ·
碱溶液液封 。培养基由储瓶进入反应器 ,再循
环返回培养基储瓶 ,培养中营 养成分通过膜
扩散进入细胞层 。
A 图 1 实验流程 A 和 B B
1
一膜反应器 2一膜空气过滤器 3一培养基储瓶 4一液封瓶 5一场动泵
6一活性炭空气过祥器 7一空气流量计 8一空气压缩机 9一接种口
流程 B 如图 1一 B 所示 。 与流程 A 的差别 养基在膜下流动 ,提供营养成分 。
在于细胞生长所需的氧由扫过细胞表面的气 2 . 3 操作条件 : 操作温度为 25 士 1℃ , 培 养
体提供 。 基 循 环 量 为 10 0 m lh/ , 通气量流 程 A 为
2
.
2 反应器结构 : 反应器 由玻璃制成 , 可在 0 . 巧m丫h ,流程 B 为 0 . 05 m 3h/ 。
过程中随时观察细胞的生长状况 , _上面带有 2 . 4 膜反应器培养长春花细胞生产生物碱
接种 口 。 膜材料有两种 ,一种是孔径为 3拜m 的结果 : 由于操作要求在严格无菌条件下进
的硝酸纤维素膜 , 另一种为孔径 80 拌m ( 2 5 0 行 , 整 个流程保持密闭 , 培养过程不取样分
目 ) 的不绣钢丝网 。 膜支承物为大孔钢丝网 。 析 , 只在培养结束后进行分析 。 结果见表 l 。
膜下部体积为 7 o m l , 上部体积为 1 30 ml 。 培
表 1 膜反应器生产生物碱结果
实骏流程 流程 八
实验次数
膜材料
膜孔径 (拜m )
接种量 ( g )
培养时间 ( d)
细胞层厚度 ( m m )
培养后鲜重 ( g )
干重 ( g )
干基生物碱含量%
液相生物碱含量 ( 拼g / m l)
培养后培养基体积 ( L )
反应器生物碱总量 ( m g )
生产率 ( m g I/ , , d)
1
硝酸纤维素
3
8O
8
5
.
6
1 10
3
.
5
2
.
0 5
8 9
.
8 8
0
.
9 0
15 2
.
6 4
9 5
.
4 0
2 3
硝酸纤维 素 硝酸纤维素
3 3
1 0 0 】s e
8 8
7
.
5 1 1
.
4
14 3 1万5
4
.
3 5
.
3
1
.
9 5 1 6心
11 6 0 0 1 1匕 . 仁) 0
0
.
8 6 0
.
8 2
18 3
.
6 1 17 6
.
6 4
1 14
.
7 6 1 10
.
4 1
流程 B
4 1 2
不锈钢理网 不锈钢丝网 不锈钢丝网
80 8 0 8 0
一 00 15 0 12 0
8 8 8
7
.
5 1 1
.
4 9
.
C
1 50 18 2 15 1
4
.
4 5
.
4 0 4
.
3 鱿
2
.
0 0 1
.
4 2 1 5 5
1 18
.
( 10 14 5 13 7
0 8 5 0
.
7 8 1 0
.
8 2 5
] 8 8
.
3 0 19 0
.
J 3 18 0 4 5
1 1 7
.
7 4 1 19
.
3 5 1 12
.
8 0
表 2 摇瓶悬浮培养 8 天的结果
接种量 (% ) 培养时间 ( d) 干重 ( g I/ ) 生产率 ( m g / I · d)
70 8 1 7
.
9 2 8
.
0
2
.
5
2
.
5
培养基为含 50 9 糖的生产培养基
结果讨论
的结果 知 , 膜反应器培养植物细胞其生产率
与细胞层厚度有很大关系 。 第一组实验细胞
接种量较少 , 因而其生产能力也相对较低 ,而
第三组实验尽管细胞层厚度 远大于其它各
组 ,但其生产率却与第二组相当 ,说明第二组
1 细 胞层厚度 的影响 : 由表 1 流程 A
.
2 7 2
·
的接种量较为合适 , 再增大接种量 已没有益
处 。 从观察也可看出 ,第三组实验在培养过程
中上层细胞生长并不好 , 说明营养组分所能
穿透的最大细胞层厚度为 7 . sm m 左右 。
2
.
5
.
2 膜材料的影响 : 比较流程 A 第二 、 第
四组的实验结果 ,说明金属丝 网的性能略优
于硝酸纤维素膜 。从整体上考虑 ,金属丝网价
格便宜 , 水力流通性好 , 强度高可反复应用 ,
从而降低了膜反应器的造价 。 因而金属丝网
是较硝酸纤维素更为合适的膜材料 。
2
.
5
.
3 生产能力与摇瓶培养的比较 : 从流程
A 第二组与第四组的实验结果 ,可以看出膜
反应培养长春花细胞 ,生产生物碱的能力远
高于摇瓶培养 ,约为摇瓶培养的 4 . 2倍 。 究其
原因 ,是由于膜反应器中营养成分在细胞层
中有一定的浓度梯度 ,有利于细胞的分化 ,促
进了生物碱的合成 。
2
.
5
.
4 流程 B 液相生物碱含量较高的原因
分析 : 从表 1 可以看出 , 流程 B 在培养结束
后 ,液相生物碱含量明显高于流程 A 。分析其
原因 ,可能是由于压缩泵打出的脉冲气体没
有经过缓冲瓶而直接吹扫细胞 ,压力脉冲促
进 了生物碱的释放而致 。为此 ,我们进行了压
力对生物碱释放影响的研究 。
2
.
6 压力对促进生物碱释放行为的研究 :
5 0 9 细胞置于 l o o m l 液体中 ,表压 4 k P a 处理
l o m in
,每隔一定时间取样分析 , 结果如 图 2
所示 。 由图可以看出 ,经加压处理的样品 ,在
处理 h4 之后 , 液相生物碱含量明显升高 ,未
经加压处理的细胞则无此现象 , 从而证明了
压力是促进生物碱释放的一种有效手段 。
ǎ一日\.气ó0、连à州如娜雄
, O心 . 0
`产、
,
. . 叫日 3知 . 0、盆 3〕 j . o盯一
一 一~ 一 乞
{
。
「一!!针彻囚期lO0,ó。迎灿公卿如雄季划 舒~ 朴~ 十一字一货~ 分~ 妇州时归J r ( h ) 时间 z ( h )
3
3
.
1
图 2
A
一未处理
膜反应器中细胞层厚度的确定
胞内外生物碱的变化
B
一加压处理
膜反应器存在的主要问题 : 膜反应器培
养植物细胞 ,最 突出的问题是传质问题—营养物质的传入及抑制性产物的传出 。 膜所
能支持的细胞的量取决于膜的性质 、 细胞层
厚度 、细胞的浓度以及细胞的活性 。 用于固定
化植物细胞的膜孔径通常较大 (本实验证明
孔径为 8 0拌m 的不锈钢丝 网是较好 的材料 ) ,
因而膜的传质阻力可忽略不计 , 这里仅讨论
细胞层内部的传质阻力 ,从而确定膜所能支
持的细胞层厚度 。
3
.
2 允许细胞层厚度的确定方 法 : 众所周
知 ,糖是植物细胞生长的主要营养成分 ,糖通
常占培养基成分的 3 % ~ 7% ( w t八 ) 。 因而我
们以葡萄糖在细胞层内的消耗与传递性质 ,
探讨葡萄糖所能穿透的细胞层厚度 。 而实验
上 ,此方法具有通用性 , 当其它组分如氧等为
限制性成分时 ,可用类似的方法进行计算 。
8 8一巍巍海一“ 一黛歉羲璐豁 ; }, “肠~ 呼卿甲鲜严:一8 8
图 3 双膜式平板膜反应器
3
.
3 模型建立 : 考虑双膜式平板膜反应器 ,
如图 3所示 , 细胞层可以看作是无限大平板 ,
《中草药 》 19 96 年第 27 卷第 5 期 . 2 7 3 ·
培养基营 养成分从细胞层 的两端 面扩散进
入 , 作如下假定 : a) 系统处于稳态 ; b) 系统恒
温 ; 。 )扩散可用 iF ck 定律描述 ; d) 细胞层 内
部细胞均匀分布 ; e) 细胞活性取决于细胞层
内的葡萄糖浓度 ; f) 与膜平行方 向的扩散可
忽略 ,如图 3 。 进行物料衡算 , 可得反应扩散
方程 :
3
, 由于假定为稳态 , 生物量浓度为 C 二 也变为
常数 , 由实验值确定 。
表 3 参数一览表
参数名 数值
0
.
6 5 4
单位
V R
s
D
e ( 1 )
R
: 为细胞消耗葡萄糖的速率 , D 。 是葡萄
糖在细胞层内的扩散系数 , V 为细胞的活性 。
其边界条件为 :
z = L C
,
= C
, ,
0
.
0 0 8 3 3
0
.
2 1 2
0
.
0 0 0 8
0
.
0 1 9 5
5 X 1 0一 5
1
.
2
〔C 一 m o l · ( C ) m o l一 1〕
( C
一
m o l
·
C
一
m o l一 1 · h 一 1 )
( C
一
m o l
·
L 一 l )
( C
一
m o l
·
C
一
m o l
·
h 一 l )
h 一 l
e m Z
·
s 一 l
C
一
m o l
·
L 一 l
sxY叭玫、腼玖cx
了气一Zf一d
O一
飞夕一Z妇一d
O一Z
从而可得非一级反应的内扩散有效因子
为 〔7〕 :
、一夔〔二v R · d c s 〕` ( 2 )
3
.
6 结果与讨论 :培养基中葡萄糖浓度取实
验值 1 . 4 c 一 m ol · L 一 `进行计算 , 求解式按文
献 〔9〕 ,结果如图 4 所示 。对单膜式反应器 ,当
细胞层厚度小于 7m m 时 , 有效 因子变化不
大 , 而当细胞层厚度大于 s m m 时 ,有效因子
迅速降低 。 因而细胞层厚度为 7 ~ s m m 时 ,
反应器能维持较高的生产能力 。 结果与实验
值吻合 。
仍8肠oaO乃7
10丹U0
小胶岌体
其中 sC 。为细胞层中心处葡萄糖的浓度 ,
可由 ( l) 式通过打靶法求解而得 , 代入 ( 2) 式
即可得到有效因子 刀、 有效扩散系数 D 。 、 细胞
层厚度 L 之间的关系 。
3
.
4 葡萄糖消耗速率 R 。 的确定 : 关 于植物
细胞的动力学模型 , 已大量见于报道 。本文采
用文献 〔8 〕中的非结构动力学模型 , 在稳态情
况下 ,葡萄糖的消耗速率 :
O凡犷~ 言犷~ 树才~ 杖犷愉份~ 掀。细胞 层厚度 (m m )
R
,
= C
x C
,
K
,
+ C
,
, 拌m a 二 + q 。 . 、 , 。 、
气- 一又下一一一一 寸 n l , 夕 又j 少
I , x
细胞的活性与细胞层葡萄糖浓度之间的
关系由实验可近似为 :
v 一 (旦) 。 · 2七 ” ( 4 )
3
.
5 参数估算 : 葡萄糖在固定化植物细胞内
的扩散系数至今尚未 见报道 。 B a il ey 和 0 1-
h s 〔的根据温度和膜的形成方式给出了葡萄糖
在微生物膜内的扩散系数的值为 s x 1o 一 7至
5
.
7 x 10 一
6 。 由于植物细胞远大于微生物细
胞 ,葡萄糖在其中的扩散系数要大一些 ,计算
中取 玖 为 5 x 1 0一 s e m , / s 。
在葡萄糖消耗速率表达式 中 , 需要确定
的参数有 K . 、际二 、 Y : 二 、 q p 、 m , 。 其参数值见表
·
2 7 4 一
图 4 有效因子与细胞层厚度之间的关系
4 结论
膜反应器培养长春花细胞 ,适合于细胞
的生存 , 所提供的微环境有利于生物碱的积
累 ,具有较高的生产能力 。 反应器中 ,细胞层
厚度及膜材料是影响反应器性能的重要 因
素 。同时发现 , 压力脉冲是促进胞内生物碱释
放的有效手段 。
符号说明
C
, 组分 i的浓度 ( C 一m ol · I 一 ` )
D 。 葡萄糖有效扩散 系数 (c m “ · s 一 ` )
K
, 饱和常数 ( C 一m o l , I 一 ` )
m
, 与组分 i 相关的维持 系数 ( c 一m ol · c 一m 。 卜 , .
h 一 l )
I 细胞层厚度 ( m m )
q : 组分 i的比转化速率 〔 ( C ) m o l · C一 m o l一 ` · h一 ,〕
R
, 组分 i 的消耗速率〔C 一m (,l · I 一 ’ · h 一 ’ 〕
V 细胞活性
Y
I , 组分 i转化为组分 J 的收率 〔C 一 m o l · ( C ) m o l一 ’〕
希腊字母 拌 比生长速率 h( 一 ` )
角标 S 葡萄搪 ; X 生物 量
参 考 文 献
B r o d
e
li u s P
, e t a l
.
F E B S I e t t
, 19 7 9
,
1 0 3 : 9 3
R o s e v e a r A
, e t a l
.
A d y B i o
e
h
e
m E n g B i o t e e h n o l
, 1 9 5 6
,
3 1
: 3 7
L in d s e y K
, e t a l
.
F E I巧 I _ e t t , 19 8 3 , 1 5 5 : 14 3
A n o n y m o u
s .
B i o t e e h n o l N e w s w a t e h
, 1 9 8 2
,
2
:
l
M
e G r e g o r W C
, e t a l
.
In M e m b r a n e eS p
a r a t i o n s i n
B i o t
e e
h n o l
.
I n e N e w Y o r k
, 19 8 6
.
3 0 3
元英进 〔博士论文 〕 . 夭津大学研究生毕业论文 . 天津 . 夭
津大学 , 1 9 9 1
李绍芬 . 化学与催化反应工 程 . 北京 : 化学出版社 , 19 8 6
V a n G u l i k W M
, e t a l
.
B i o t e
e
h n o l B i o e n g
, 19 9 2 , 4 0 : 8 6 3
aB i l
e y J E
, e t a l
.
B i o e h e m i e a l E n g in e e r i叩 F u n d a m e n -
t a l s
,
M e G r a w
一
H i l l
,
N e w Y o r k
, 1 9 7 7
.
3 9 6
( 1 9 9 5
一
0 7一 1 2 收稿 )
S t u d y o n I m m o b i l i z a t i o n P l a n t C e l l C u l t u r e a n d R e l e a s e o f I n t r a e e l l u l a r M e t a bo l i t
e s
Y u a n Q ip
e n g
,
Y u a n Y i n g ii
n ,
H
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Z
o n g d in g
M
e m b r a n e im m o b ili z a t io n o f C a t h a ar t h
u s r o s e u s ( L
.
) G
.
I k , n e e l l
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l t
u r e
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a s s t u u d i
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R e s u l t
s s
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u e t io n e a p a e i t y e a n a t t a in a h ig h
e r
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l w h
e n t h
e e e
ll l
a y e r w
a s 7一 s m m t h ie k . S t a in le s s 一 s t e e l
s e r e e n ( 8 0拌m ) w a s s u i t a b le f o r i m m o b l l iz a t io n o f C . r o s e s e e ll . P r e s s u r e p u l s e e a n e n h a n e e t h e r e l e a s e o f in t r a -
e e
l l
u l e r m e t a b o l i t e s
.
A m e t h o d t o d e t e r m in e a ll o w a b le e e ll l a y e r t h i e k n e s s w a s d e v e lo p e d
.
T h
e e a
l
e u
l
a t e d v a lu e
a g r e e d w
e
ll w i t h
e x P e r im e n t a l r e s u lt s
.
薄层刮板一荧光分析法在中药复方制剂
质量控制中的应用
第二军医大学药学院 (上海 2 0 0 4 3 3) 李 玲 . 刘明珠 徐卫 明
摘 要 用薄层刮板 一荧光分析法检测中药复方制剂之君药丁公藤 E cyr i加 ob tsu ￡fo li a eB nt h 的有
效成分东蓖若亭 ( sc 叩 ol et in) 的含量 ,克服了薄层色谱干扰 ,取得了准确 、 可靠的结果 。 本文的研究
为中药复方制剂的质量控制提供了一种较好的分析手段 。
关镇词 丁公藤 东蓑若亭 薄层刮板 一荧光分析法 中药复方制剂
如何解决中药复方制剂的质量控制问
迈 ,一直是药物分析工作者 比较关注的课题 。
特别是中药制剂组分繁多 , 成分复杂 ,如果不
经分离或适当处理 , 很难获得准确可靠的结
果 。 本课题在研究中药制剂藤络宁胶囊的质
量标准时 ,采用薄层刮板一荧光分光光度法 ,
对组方成分之一丁公藤的有效成分东蓑若
亭〔`一 ` 〕进行 了含量监 测 ,克服 了用薄层扫描
测定含量误差大 、 用 H P L C 法直接进样对色
谱柱污染大等缺点 , 排除了复杂组分相互间
的干扰 ,取得了准确可靠的结果 。
1 材料与方法
1
.
1 仪器与试药 : 日立 3 0 0 0 荧光分光光度
计 ; XW一 s o A 旋涡混合器 ; 8 0一 2 离心沉淀器 。
化学试剂均为分析纯 。
藤络宁胶囊 由本院植化教研室提供 ; 东
·
A d d r e s s
:
L I I
矛
i n g
,
C o l le g e o f P h a r n 飞a e y , T h e S e e o n d M ili t a r y M e d ie a l C o ll e g e
,
S h
a n g l l a i
《中草药 》 1 99 6 年第 27 卷第 5 期 · 2 7 5 ·