全 文 ：榭皮素二硫酸醋二钠对猪血小板
F
一肌动蛋白生成的影响△
广东医学院医用生化研究所 (湛江 524 0 2 ) 3宋芝娟 带 刘 文 梁念慈 佘 戟 .’ 莫丽儿 “
摘 要 懈皮素二硫酸醋二钠是以榭皮素为原料合成的一种水溶性黄酮类化合物 。 采用曲拉通
(T i r to n )沉淀法研究棚皮素二硫酸酷二钠与肌动蛋白微丝 (F一肌动蛋白 )生成间的关系 ,结果表明
棚皮素二硫酸醋二钠可强烈抑制凝血酶诱导的猪血小板肌动蛋白的聚合 ,半数抑制率 ( IsC 。 ) ~ 30
拌m ol / L 。 结果提示懈皮素二硫酸醋二钠具有较强的抗血小板作用 。
关键词 懈皮素二硫酸酷二钠 肌动蛋白微丝 血小板 抑制作用
懈皮素为天然的黄酮类化合物 , 因其在
植物界分布较广 , 且具有广泛的药理作用而
倍受重视 。 近年来对榭皮素深入研究的结果
表明 , 棚皮素可抑制癌细胞脱氧核糖核 酸
( D N A ) 合成 〔` , , 诱发 D N A 损伤 〔2 , , 抗 自由
基〔 3〕 ,抑制多种与细胞生长调控有关酶的活
性 (4 一 ’ 〕等作用 。 棚皮素可抑制人血小板聚集
和钙的升高即 , 并对花生四烯酸诱导的化学
发光有抑制作用 〔的 。 懈皮素的这种抗血小板
作用 , 可用于防治血栓栓塞性疾病 。但因其溶
解性 , 机体难于吸收 〔10) 。 为解决其溶解性问
题 ,我们将棚皮素结构加以部分改造 ,合成了
裕皮素二硫酸醋二钠 。 为探讨棚皮素二硫酸
醋二钠对血小板的可能作用 , 我们以血小板
中肌动蛋白为观察指标 ,研究两者的关系 。血
小板中肌动蛋白是血小板中细胞骨架蛋白之
一 ,其有二种存在形式 , 即肌动蛋白单体 ( G )
和 肌动蛋 白微丝 (F ) , 两者的相互转变对于
血小板的功能有着较大的影响 。 我们的研究
结果表明懈皮素二硫酸醋二钠可强烈抑制猪
血小板中肌动蛋 白的聚合 。
1 材料与方法
1
.
1 材料 :懈皮素二硫酸醋二钠由棚皮素与
硫酸在一定条件下反应而成 (另文发表 ) 。 凝
血 酶 、 N 一 2一经 乙 基 派 嗓一 N ` 一 2一乙 磺 酸
( H eP
e S )
、 乙二 醇 双 ( 2一氨 基 乙基 ) 四 乙 酸
( E G T A )购 自 S i g m a 公司 。 T r i t o n X 一 1 0 0 、件
琉基乙醇为 F ar co 产品 。 丙烯酞胺 , 日本产 。
其余为国产分析纯或生化试剂 。 猪血购 自湛
江屠宰厂 (高压电击处死猪后立即颈动脉取
血 ,用 A c D 或 E D T A 缓冲液抗凝 ) 。 电泳装
置采用 iB 。 一 R ad 公司的快速垂直板电泳 。
1
.
2 肌动蛋白聚合实验 : 方法参照 R os en -
b e g 等〔“ 〕 。 猪血用 E D T A 缓冲液〔2 2 0 m m o l /
L N a CI
,
s o m m ol / L 三 经 甲基 氨 基 甲烷
( T r i s )
,
5 0 m m o l / L E D T A
,
P H 7
.
4
,
0
.
1 v o l
-
u m e 〕抗凝 , 室温 1 6 0 9 离心 1 0 m i n ,上清为
富含血小板血浆 ( P R p ) , 3 7 ℃保温 9 0 m i n 。
取 4 0 0 产L P R P , 加 2 0 拼L 不同浓度的懈皮素
二硫酸醋二钠 3 7℃保温 1 5 m i n ,加入 1 0 产L
凝血酶 (终浓度为 4 6 5 U / L )准确 1 m i n ,立即
加人 4 3 Q 拜L 冰冷的 T r i t o n 抽提液 〔2% T r i-
t o n X
一
1 0 0
,
1 0 n m o l / L E G T A
,
2 m m o l / L
M g C 12
,
1 0 0 m m o l / L T r i s 和 1 m m o l / L 苯甲
磺酞氟 ( P M S F ) , p H 7 . 4〕 ,混 匀后 , 4 oC S 5 0 0
g 离心 4 im n , 弃去上清 。 沉淀用等量 T ir s 缓
.
A d d
宋芝娟
r e s s :
S
o n g Z h ij
u a n
1 98 9 年研究生毕业近年来主要从事有关血
,
I n
s t it u t e o f B i
o e
h
e m is t r y
,
, 获医学硕士学位 。 1 9 9 2 年晋
G
u a嗯 d o n g M e d ie a l C o l le ge , Z h a n j io n g升为讲师 . 干广东医学院生物化学教研室执教和从事科研工面的生化药理学
C K l l 活性的影响 。 1 9 9 6 年 研寒一项
, 现正在进行广东省卫生厅资 对血小板中市科技进步二等奖 参加专著《细胞内信号传导系统 写 , 并获专利一项 , 同年光荣的作为广东省 “ 千百 十” _ 〔程院级重点教师 。。 本课题获广东省高教厅专款资助广’ 东医学院化学教研室
《中草药 》 1 9 9 7 年第 2 5 卷第 8 期 · 4 7 7 ·
冲液 (s m m o l /L E T G A, i m m o l / L M g C 12 ,
5 0 m m o l / L T r i S
,
0
.
5 m m o l / L PM S F 洗涤一
次 ,沉淀加入 50 拜L 样品缓冲液 〔2%十二烷
基硫酸钠 ( S D S ) , 5%各琉基乙醇 , 10 %甘油 ,
6 2
.
5 m rn o l / L T r i s
, p H 6
.
8〕 , i 0 0 0C 煮沸后进
行十二烷基硫酸钠 一聚丙烯酞胺凝胶 电泳
( S D S
一
P A G E )
, 浓缩胶 3% ,分离胶 10 % , 每
次加样 10 拼L 。 电泳完毕经考马斯亮蓝 R 25 。染
色后 , 再脱色 , 最后将肌动蛋 白带剪下 , 加入
2 5%毗吮水溶液洗脱 24 h 。 混匀后利用 7 21
分光光度计测定 6 0 5 n m 的吸收度 ( A 。。。 。 m ) ,
计算肌动蛋白的相对含量 (测定管的 A 60 5 。 m/
总肌动蛋白的 A 60 5 。 m ) ,所有数据均进行 t 检
验 。
2 结果与讨论
2
.
1 懈皮素二硫酸醋二钠对凝血酶诱导的
肌动蛋白聚合的抑制作用 : 懈皮素二硫酸醋
二钠可抑制凝血酶 ( 4 6 5 U / L )诱导的猪血小
板肌动蛋 白的聚合作用 , 结果见 图 1 ( A 和
B )
,与对照组相 比 ,尸 < .0 05 。
撇皮素二硫酸醋二钠可强烈抑制凝血酶
诱导 的猪血小板肌动蛋 白的聚合 , I C S。 一 30
拌m ol / L 。 在一定浓度范围内这种抑制作用呈
剂量效应关系 。
2
.
2 讨论 : 自 1 9 5 9 年 B e t t e x 一 G a l l a n d 指 出
血小板中亦存在着 “ 肌 ” 蛋白后 , 血小板中的
肌动蛋 白 、 原肌球蛋 白和肌球蛋白等多种血
小板的细胞骨架蛋白相继被提取 。 人血小板
细胞骨架主要 由 F 一肌动蛋白 、肌动蛋白结合
蛋白和 a 一辅肌蛋白组成 〔“ , ,它们在 T irt on 中
不溶解 。 由它们组成的微丝在血小板的变形 、
颗粒释放 、 伸展和血管收缩中起着重要作用 。
由于血小板在血栓形成与止血等多种生理 、
病理过程中起着重要作用 , 寻找一些抗血小
板药物并研究它们可能的作用机理 , 对防治
某些危害人类生命严重的血栓栓塞性疾病有
着广泛的理论及应用价值 。
懈皮素及其衍生物具有抗血小板 、 抗自
由基 、 扰癌防癌等多种生物活性及药理作用 ,
在植物界存在广泛 , 且无毒无害 。 由此不难想
.
4 7 8
·
一 , . 口 . 口匆 口 .
奋花祥奋 门 . 卜
F 一 肌动蛋白
门助
, 尹, 巴巴二巴肠性二二
e d e b a
ǎ承à圳如盆年扭姗公材咸l灿
椒皮 素二硫酸酷 二钠的浓 度 (产m ol / L )
图 1 根皮素二硫酸醋二钠对凝血酶诱导
的猪血小板肌动蛋白聚合的影响
A
一
S D S
一
PA G E 图谱
a se空 白对照管 (未加凝血酶 ) b一凝血酶对照 管
( 4 6 5 U / )L
。一 f一测 定管 (撇皮素二硫酸酷二钠的
浓度分别为 2 0 、 5 0 、 1 0 0和 20 0 拜m o l / L )
B
一不同浓度的榭皮素二硫酸酷二钠与 F一肌动蛋白
相对含量间的关系
象懈皮素及其衍生物对人类预防和治疗血栓
栓塞性疾病 、肿瘤 、 衰老等有潜在价值 。 对懈
皮素的药代动力学研究表明 : 高剂量的懈皮
素难以被胃肠道粘膜细胞吸收〔 , 。 , 。 另懈皮素
在肠道可经细菌作用而被分解 ,使药物在未
吸收前即被部分破坏 〔` 2〕 。 如对懈皮素的化学
结构进行改造 ,使既具懈皮素的作用 ,又有抗
细菌分解作用 ,并可制成注射剂在 临床上使
用 。 有报道对栅皮素结构进行部分改造所成
的水溶物— 懈皮素磷酸醋钾能明显降低血液粘度 、 抑制 血小板 聚 集及循环血栓形
成 〔` 3〕 。 结果表明懈皮素二硫酸醋二钠可强烈
抑制凝血酶诱导的猪血小板肌动蛋 白聚集 ,
IC
S。 一 30 拌m ol / L 。 其制剂可望用于临床 。
参 考 文 献
1 肖显华 , 等 . 兰州大学学报 〔自然科学版 ) , 1 9 92 , 2 8 ( 2) :
12 8
2 王肖置 , 等 . 兰州大学学报 ( 自然科学版 ) , 1 9 8 9 , 2 5 : 103
谢梅林 ,等 . 现代应用药学 , 1 9 92 , 9( 1 ) : 1
C u n n in g h a m B D
, e t a l
.
A n t i e a n e e r D r u g D e s
, 1 9 9 2
, 7
( 5 )
:
3 65
S h i s h e v a A
, e t a l
.
B i o e h e m i s t r y
,
1 9 9 2
,
3 1 ( 34 )
:
8 0 9 5
G r a z i a n i Y
, e t a l
.
E u r J Bi
o e h e m
, 19 8 3
, 13 5
:
5 8 3
P r a jd a N
, e t a l
.
L i f e S e i e n e e s
,
1 9 9 5
,
5 6 ( 1 9 )
:
1 5 8 7
X i a o D o n g
, e t a l
.
A e t a P h a r m a e o lo g i e a S in i e a
,
1 9 9 5
, 1 6
( 3 )
:
2 2 3
9 顾振纶 ,等 . 中国药理学报 , 19 93 , 14 ( 3 ) : 2 6 3
1 0 赵维中 ,等 . 中国药理学通报 , 1 9 9 2 , 8 ( 6 ) : 4 52
1 1 R o s e n b e g S
, e t a l
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J C e l l B i o l
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1 9 8 1
,
9 1
:
2 0 1
1 2 屠世忠 . 国外医学药学分册 , 19 79 , 4 : 2 0
1 3 吴毓秀 ,等 . 山西医学院学报 , 1 9 9 3 , 2 4 ( 3 ) : 1 0 3
( 1 9 9 6
一
0 7一 3 1 收稿 )
E f f e c t o f D i s o d i u m Q u e r e e t i n D i s u l f a t e o n t h e F o r m a t i o n o f F
一 a c t i n
i n P i g P l a t e l e t I n d u e e d b y T lt r o m b i n
S o n g Z h ij
u a n , S h
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, e t a l
D i s o d iu m q u e r e e t i n d i s u lf a t e 15 a wa
t e r s o l u b l
e q u e r e e t i n d e r iv a t iv e
.
B y s t u d y in g t h
e r e
l
a t io n b
e t w
e e n d i
s -
o d i u m q u e r e e t i n d i s u l fa t e a n d F
一 a e t in fo r tn a t i o n in p ig p la t e le t s
,
i t h a s b e e n f
o u n d t h
a t th
e
d
e r i v a t iv e e a n
s t r o n g l y in h ib i t
a e t in p o l y m e r i : a t i o n in d u e e d b y t h r o m b i n w i t h a n IC S。 = 1 0 拜m o l / L , s u g g e s t in g t h a t d is o d iu m
q u e r e e t i n d i
s u l f
a t e 15 a r a t h
e r P o t e n t a n t iP l
a t e l
e t a g e n t
.
蝙蝠葛碱的抗氧化实验研究
咸宁医学院生化教研室 ( 4 3 7 10 0) 何丽娅 朱 李立 中“ 吴基 良“ 刘忠明
闺 清 ” 郑 敏 ’ ` 陈饺峨 , ` ,
摘 要 采用大鼠海马缺血再灌注模型 ,观察蝙蝠葛碱的抗氧化作用 。 结果表明 ,蝙蝠葛碱能明显
降低大脑海马结构组织中 M D A 的含量 ,显著提高 SO D 活力和 G S H 一P X 活力 , S O D /M D A 比值和
G SH / M D A 比值显著升高 ,提示蝙蝠葛碱具有明显的抗氧化作用 。
关键词 抗氧化 蝙蝠葛碱 大鼠
蝙蝠葛碱 ( d a u r i e i n e , D a u )为防己科植
物 蝙蝠葛 (又名 山豆根 )材亡in sP e o u m da u -
ir cu m D C
. 根茎中提取的一种双节基四氢异
喳琳类生物碱 。 它具有与奎尼丁类似的药理
作用 ,属于 I 类抗心律失常药 〔 1〕 , 能抗冠心病
患者血小板聚集及血栓素的形成 〔2 〕 。 但对抗
氧化作用的研究 , 目前尚未见报道 。现对蝙蝠
葛碱的抗氧化作用进行了初步研究 。
1 材料和方法
.1 1 动物 : 24 只 w is t er 大鼠 , 雌雄不拘 , 体
重 21 。一 2 30 9 , 由本院动物室提供 (购 自湖北
医科大学动物饲养中心 ) 。
1
.
2 药物和试剂 : 蝙蝠葛碱由陕西师范大学
中心实验室提取惠赠 , 含量高于 90 % 以上 ,
用 N a O H 溶解 , 稀盐酸调 p H 值至 7 . 0 左右
供实验之用 ; S O D 试剂盒购自同济医科大学
附属协和医院 ;还原型谷胧甘肤 ( G SH ) 为上
海生物化学研究所产品 ; 5, 51 一硫代双 C二硝
基苯 甲酸 ) ( T D N B )和硫代巴 比妥酸 ( T B A )
均 为 F l u k a 公司产品 ; i , i , 3 , 3一四乙氧基丙
烷 ( T E P )为 A ldr ihc 公司产品 ;其余试剂均
为国产分析纯 。
` A d d r e s s : H e L i y a
,
D e p t
.
o
f B i
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h
e m i s t r y
,
X i a n n i n g M
e d ie a l C o l le g e
,
X i
a n n i n g
. ` 药理教研室 ` 圣 ’ 组胚教研室何丽娅 女 ,科室副主任 、 副教授 。 毕业于咸宁 医学院医疗系 , 从事生物化学教学和科研工作已十余年之久 。 现为中国及湖北省生物化学与分子生物学学会会员 。 并先后参加和主持了多项省级以上科研课题的研究 ( 主要为缺血再灌注方面的研究 ) 。 近年来在省级 以上刊物上公开发表论文和省级以上学术会议上交流论文共 40 余篇 ,其中第一作者 28 篇 (3 篇获奖 、 2篇被某权威性学术刊物摘录 ) 。 作者于 19 9 7一。 4 调往武汉科技大学医学院基础部生化教研室工作 。
《中草药 》 1 9 9 7 年第 2 8 卷第 8 期 · 4 7 9 ·